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APLICACIONES DE LA PRODUCCION IN VITRO DE EMBRIONES G. Brem Introducción Para la producción in vitro de embriones (PIV) existe una serie de aplicaciones que corresponden en parte a aquellas de la transferencia de embriones, como por ejemplo su empleo en la reproducción de razas en peligro de extinción, de genotipos exóticos o en el aumento del número de terneros en un rodeo. Por otra parte la PIV tiene aplicaciones que son particulares de ese método biotecnológico. Un ejemplo de ello es la producción de terneros a partir de animales faenados y sometidos a pruebas de rendimiento propio. En el presente capítulo se presentará un panorama de las principales aplicaciones de la PIV de embriones bovinos desde el punto de vista productivo y técnico. Generalmente los programas de PIV pueden dividirse en proyectos de acuerdo al origen de los ovarios y de los ovocitos. En ellos se pueden desarrollar los trabajos con un pool de ovarios de terneras o vacas. En otros casos se pueden seleccionar determinadas hembras, las cuales en forma individual o en determinados grupos son consideradas para un programa de PIV después de la faena.

Producción in vitro de embriones en programas de investigación y como técnicas reproductivas Para el estudio de los fenómenos vinculados con el desarrollo de estadios embrionarios tempranos es necesario en la regla un gran número (p.e.: el desarrollo de una biblioteca de ADN) de embriones desarrollados en forma sincrónica. Para cumplir con esos objetivos se presentan, particularmente en la especie bovina, dos problemas: es extremadamente dificultoso (en promedio sólo 8 embriones/ donante) recolectar esos estadios (a través del lavaje de oviducto o después de la matanza) de la donante. En segundo lugar debe esperarse una divergencia del estadio de los embriones de hasta 24h, en función del momento de la fecundación. La PIV tiene la ventaja de producir embriones en un número suficientemente grande y sincrónico en el desarrollo. Es posible, además, llevar a cabo estudios con los ovocitos recolectados durante la maduración y la fertilización. Para llevar a cabo los métodos de clonado y la transferencia de genes en el bovino se requiere de un gran número de ovocitos, cigotos y en parte también embriones. Su realización con embriones recolectados in vivo sería dificultosa e imposible de continuar a largo plazo. La PIV constituye el método de elección, demostrado en las primeras experiencias en la producción de animales clonados y transgénicos. Los resultados obtenidos con esos programas son aún insatisfactorios, sin embargo constituyen una buena alternativa, comparada con la aplicación de embriones obtenidos in vivo. En los programas de investigación y manipulación mencionados se puede emplear en la regla un pool no seleccionado de ovarios. Los embriones, donantes de blastómeros, requeridos para un programa de clonado constituyen una excepción. De la misma forma puede ser necesario en un programa de transferencia génica, dependiendo de la estructura génica a transferir (capítulo XIII), emplear animales de razas lecheras o con una constelación genética especial.

Vacas de interés productivo como donantes de ovocitos Al contrario de la recolección de ovocitos de un pool de ovarios para diversos programas, obtener ovocitos de una vaca es interesante desde el punto de vista productivo. Particularmente animales con una larga y eficiente vida productiva constituyen un potencial prometedor para la PIV. A pesar que esas vacas tienen más descendencia que la media de la población, persiste aún una gran demanda por sus descendientes. Esas vacas, de acuerdo a la experiencia, no responden satisfactoriamente a un programa de superovulación como los animales jóvenes, de forma tal que un programa de TE no brinda Biotecnología de la Reproducción

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el éxito esperado. En el momento de la faena o la matanza de esos animales la PIV ofrece la última posibilidad de aprovechar su potencial genético. Como demostración del significado que puede tener ese programa es interesante el ejemplo de la raza Holstein-Friesian alemana (HFa). De las 23 000 vacas elite hay más de 120 que tienen un rendimiento en su vida de 100 000 kg de leche. En promedio se faenan alrededor de 5000 vacas por año. Con un empleo consecuente de la PIV podrían producirse anualmente 10 000 terneros adicionales con muy buenos valores productivos estimados. Ello sería especialmente interesante por que además se necesitaría menos semen por embrión producido comparado al requerido en el servicio con IA. Las porciones de semen de toros HFa se disponen en general en cantidades insuficientes y son además caras. En muchos casos el uso eficiente del semen cubre los costos del programa de PIV e incluso posiblemente de la transferencia de los embriones producidos. En una segunda etapa se podría extender la PIV a toda la población Herdbook (HB). Si se eligen para el programa de PIV 50 000 vacas HB, lo que constituye 30% de las vacas faenadas, se podrían producir alrededor de 100 000 terneros. Esos terneros podrían reemplazar a los animales descendientes de animales de bajo valor productivo y aumentar de esa forma el progreso genético de la población. Desde el punto de vista reproductivo la consecuencia sería que alrededor de 10% de las inseminaciones serían reemplazadas con la transferencia de embriones producidos in vitro. Genéticamente el empleo de las vacas HB en la PIV significaría una mejora del progreso genético sobre la línea madre-hija (capítulo XXI). Convencional: tasa de reposición

PIV:

madre de vaca= 80% => i= 0,35 rIA = 0,5 ∆G = .35. .5 sA = .175 sA

tasa de reposición

madre de vaca= 60% => i = 0,64 rIA = 0,5 ∆G = .64 . .5 . sA = .32 sA

Según ello el aumento del progreso genético sobre la línea madre-hija sería del 83%. A pesar que la línea madre-hija contribuye solamente en un 10% del progreso genético total, la casi duplicación del ∆G sobre esa línea es ventajosa porque aumentaría el significado de la línea más débil en el mejoramiento genético. A través del empleo más intensivo de las vacas del Herdbook es de esperar, además, ventajas adicionales en los componentes maternos.

Producción in vitro de embriones de razas bovinas en peligro de extinción La formación de reservas genéticas de razas en peligro de extinción gana creciente significado. Existen estimaciones que de las 500 razas que existen en la actualidad sólo 20 mantendrán significado en la producción a fines de este siglo. Sin embargo existen esfuerzos por evitar la pérdida total del potencial genético de esas razas a través de la congelación y conservación de semen y embriones. En ese sentido la PIV de embriones es particularmente interesante porque las pocas hembras aún existentes son relativamente viejas y no pueden ser incluidas en un programa de transferencia de embriones o lo son sin éxito. Nosotros hemos observado en vacas viejas que los ovarios carecían de folículos, lo que hacía imposible el programa de PIV. En la mayoría de las vacas es posible obtener los ovocitos, producir embriones, congelarlos y conservarlos en nitrógeno líquido durante décadas. En el momento de reestablecer la raza en peligro de extinción o para superar las depresiones consanguíneas los embriones producidos pueden ser descongelados e incorporados en la pequeña población existente.

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Terneras o fetos como donantes de ovocitos También de los ovarios de terneras y fetos pueden obtenerse ovocitos para la PIV. A pesar que el número de folículos existentes es mayor que en ovarios de vacas adultas, la producción de embriones de terneras es menor, como consecuencia de la menor tasa de desarrollo de los ovocitos (ver capítulo XI). A pesar de ello la PIV es posible y encuentra aplicación en algunas áreas específicas. Un aspecto de importancia es el acortamiento del intervalo generacional. Ello sería interesante cuando la obtención de los ovocitos de esas terneras sea repetible. Hasta el momento existe información insuficiente sobre ese aspecto. La PIV de embriones de terneras, después del sacrificio en el matadero, puede ser interesante también bajo determinadas condiciones. Por ejemplo cuando es necesaria una determinada constelación genética, diagnosticable genéticamente y que puede ser producida a través de la recombinación de la meiosis. Como ejemplo se encuentran haplotipos MHC o individuos homocigotas sin cuernos. Si la ternera no representa el genotipo deseado, puede provocarse 4 meses después la siguiente ronda recombinante por medio de la PIV. El intervalo generacional puede acortarse de esta manera de 3 a 1,1 años. Ello aumentará las posibilidades de seleccionar el genotipo deseado. Los animales producidos serán recriados, destinados a otras pruebas o a la producción. Otra alternativa de aplicación es la de terneros de engorde. En Bavaria la carne de ternero se produce a partir de las terneras, dado que los machos son engordados como toros. Las terneras alcanzan 170 kg a los 4 meses. Si se logra producir 4 embriones y con ello 2 terneros con la aplicación de la PIV, sería posible alcanzar un 50% de reposición. La selección posibilitada de esta forma (tabla 1) podría concentrarse en parámetros de rendimiento cárneo como engorde diario o cualidades a la faena (p.e.: componente cárneo, partes de valor carnicero, etc.). Como ejemplo de la ganancia diaria el progreso genético podría corresponder a 25 g por año (∆G= 0,8 . 0,7 . 50 g/1.1 = 25 g). Producción de razas productoras de carne en rodeos lecheros La producción in vitro y la transferencia de embriones de razas productoras de carne o de doble propósito a vacas lecheras, no afectadas a la reposición, es una alternativa más de la aplicación de la PIV. Esa alternativa es interesante económicamente cuando existe una mayor diferencia entre el valor de los terneros de las donantes y las receptoras frente a los costos producidos por la PIV y la transferencia. Una condición importante es que la obtención se lleve a cabo sin problemas, esto es, que se disponga en el matadero de un número suficiente de hembras.

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Tabla 1: Intensidad de selección en función del número de animales seleccionados Animales seleccionados (%)

Intensidad de selección i

80

0,35

60

0,64

40

0,97

20

1,4

10

1,76

5

2,06

3

2,27

1

2,67

0,8

2,74

0,6

2,83

0,4

3,96

0,2

3,17

0,1

3,37

0,01

3,96

G = rAI . i . sA ∆G= Progreso genético rIA= Exactitud de la estimación del valor genético i = Intensidad de selección SA = Desviación estándar genética aditiva Un efecto positivo de la producción de embriones de razas cárneas en vientres de vacas lecheras se produce cuando se emplea semen de toros seleccionados por sus atributos en su rendimiento cárneo, ganancia de peso o facilidad de parto. Con ello se posibilita también obtener rendimientos óptimos con toros puros o con embriones cruzas, como consecuencia del efecto de heterosis. A través de la transferencia bilateral de los embriones a una receptora se posibilita además aumentar hasta 40% el número de terneros por vaca. Ello podría ser otra razón para aplicar la PIV en razas cárneas. Además de la transferencia bilateral es posible aumentar la tasa de mellizos hasta 50% mediante la transferencia contra lateral de embriones a vacas servidas o inseminadas. La aplicación de la PIV es simple y económicamente aceptable si la transferencia de embriones congelados/descongelados tiene valores de sobrevivencia de 50% aproximadamente. De esta forma será posible conservar los embriones en el contenedor de nitrógeno líquido y transferirlos dentro de los programas de rutina sobre celo inducido o natural. Los costos del ternero producido corresponderían al 20% del precio de venta. La PIV de embriones constituye un método biotecnológico prometedor en el aumento de la eficiencia de la producción bovina intensiva.

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Prueba de rendimiento a la faena y de los parámetros de calidad de carne Un aspecto especialmente innovador de la PIV de embriones lo constituye la particularidad de la obtención de ovocitos que los animales pueden ser selecciona-dos después de la faena según sus particularidades cárneas. En programas convencionales de selección esas características pueden evaluarse mediante engorrosas pruebas de progenie. Esas pruebas de la descendencia pueden llevarse a cabo sólo en una parte de los toros. Para un programa de IVP es posible emplear semen de toros que cuenten con buenos valores en esas particularidades. En los toros jóvenes es posible llevar a cabo una prueba de rendimiento a la faena después del período de recolección de semen. La condición para una consecuente prueba de rendimiento propio de las vacas faenadas es que se puedan tomar datos fehacientes a la faena como también identificar los ovarios en forma individual. A partir de los datos del matadero deberá ser posible la toma de una decisión selectiva y llevar a cabo la PIV. A partir de algunos cálculos se demostrará qué progreso genético anual es posible alcanzar (desviaciones estándar) con este método en función del porcentaje de animales seleccionados y de la heredabilidad (tabla 2). Los valores de la tabla 2 tienen validez sólo si toda la descendencia en el rodeo es producida de esa forma. Si sólo se incluye una parte de la población, el progreso genético corresponderá sólo a esa parte de la población o a los terneros originarios de ese programa. Para determinar el progreso genético en toda la población se deberá considerar qué porcentaje de la descendencia total tiene origen en ese programa y el progreso genético de los parámetros correspondientes en la descendencia originaria de un programa convencional. Tabla 2: Progreso genético anual (en desviaciones estándar sA) en función del porcentaje de las vacas seleccionadas mediante prueba de rendimiento propio y de la heredabilidad (h2) Vacas faenadas seleccionadas (%)

80

60

50

40

20

10

5

Intensidad de selección ik

.35

.64

.8

.97

1.4

2.06

2.06

0,2

.14

.17

.18

.19

.23

.26

.28

0,3

.17

.20

.22

.24

.28

.31

.34

0,4

.20

.23

.25

.27

.32

.36

.40

0,5

.22

.26

.28

.30

.36

.41

.44

0,6

.25

.29

.31

.33

.39

.45

.49

0,7

.27

.31

.33

.36

.43

.48

.53

0,8

.28

.33

.36

.39

.46

.51

.56

0,9

.30

.35

.38

.41

.48

.55

.60

h2

TB = 2,5 años; TK = 3 años; iB = 1.4; Fertilidad 100% (iB + iK) . h ∆G -------------------. sA = T b + TK Biotecnología de la Reproducción

(1,4 + iK) . h -------------------------- . sA 5,5 www.reprobiotec.com

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Dado que las características corporales a la faena tienen una heredabilidad e importancia económica altas, es de esperar que este programa pueda llevarse a cabo exitosamente. Las características de calidad de la carne que generalmente también encuentran consideración tienen la dificultad que hasta el momento no se dispone en el lugar de métodos simples, rápidos y valederos de evaluación. En la elección de las características a seleccionar debe evaluarse detalladamente qué parámetros serán considerados. La consideración simultánea de varias características determina, por un lado, un trabajo más complejo en la selección de las vacas en el matadero. Por el otro, naturalmente un reducido progreso genético de las características individuales. Cuando las correlaciones entre las características son suficientemente positivas y altas, se llegará a un considerable mejoramiento correlacionado con la selección de una característica. Por último debe acentuarse una vez más que a través de la combinación de la selección de vacas faenadas y posterior producción in vitro de embriones, se cuenta por primera vez con un método aplicable en la práctica para alcanzar el mejoramiento genético de las características a la faena de la hembra bovina. Ello cobra particular importancia en los tiempos actuales, en los que se le atribuye a la calidad de los productos una importancia creciente. Un significativo progreso, alcanzable a través de la aplicación de nuevas biotecnologías.

Obtención de los ovocitos de animales vivos La punción de ovarios de animales vivos constituye una continuación prometedora del desarrollo y aplicación de la PIV. A través de las técnicas de ultrasonido es posible puncionar los folículos y obtener los ovocitos en forma repetida, lo que posibilita aumentar el número de ovocitos recolectados. En el caso de que esa forma de recolección de ovocitos continuada se pueda llevar a cabo y que se puedan producir embriones con la misma eficiencia que con ovarios de animales sacrificados, podría esperarse en teoría la producción de 100 embriones transferibles por vaca y año. Ello aportaría una considerable mejora de la aplicación de la TE porque aumentaría el número de la descendencia y disminuiría la tasa de descarte de los animales seleccionados. La aplicación consecuente de la PIV de embriones con los ovocitos obtenidos de animales vivos puede constituir una alternativa de los programas de superovulación en el mediano y largo plazo. La ventaja de esa técnica es que permitiría obtener ovocitos de vacas de alto valor genético, que no responden a los tratamientos hormonales de los programas de TE. El número de embriones por donante y año puede aumentar e incluso sería posible continuar el programa de PIV en animales preñados sin peligro de afectar la continuidad de la gestación. Condiciones para ello son la optimización de la eficiencia de las técnicas de recolección, un número suficiente de ovocitos vitales en condiciones de madurar y ser fertilizados con una metodología económica.

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