AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE 2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) A PARTIR DE AMBIENTES CONTAMINADOS CON EXPLOSIVOS.

SONIA MARCELA VILLEGAS PLAZAS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ D.C. JUNIO 19 DE 2009

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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE 2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) A PARTIR DE AMBIENTES CONTAMINADOS CON EXPLOSIVOS.

SONIA MARCELA VILLEGAS PLAZAS

TRABAJO DE GRADO PRESENTADO COMO REQUISITO PARCIAL PARA OPTAR AL TÍTULO DE MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL

DIRECTOR: FABIO ROLDÁN, Ph.D.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ D.C. JUNIO 19 DE 2009

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NOTA DE ADVERTENCIA

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

Artículo 23 de la Resolución No. 13 de julio de 1946

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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE 2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) A PARTIR DE AMBIENTES CONTAMINADOS CON EXPLOSIVOS.

SONIA MARCELA VILLEGAS PLAZAS

APROBADO

__________________________

__________________________

Fabio Roldán, Ph.D.

Ziv Arbeli, Ph.D.

Microbiólogo

Microbiólogo

Director

Codirector

__________________________

__________________________

Aura Marina Pedroza, Ph.D.

Gloria Acosta, M.Sc

Bacterióloga

Microbióloga

Jurado

Jurado

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ D.C. JUNIO DE 2009

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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE 2,4,6-TRINITROTOLUENO (TNT) A PARTIR DE AMBIENTES CONTAMINADOS CON EXPLOSIVOS.

SONIA MARCELA VILLEGAS PLAZAS

_________________________

_________________________

Ingrid Schuler García, Ph.D

Janeth Arias Palacios, M.Sc

Decana Académica

Directora

Facultad de Ciencias

Carreras Microbiología

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ D.C. JUNIO 19 DE 2009 5   

AGRADECIMIENTOS

A Fabio Roldán, Erika García, Ziv Arbeli y Joaquín Benavidez por permitirme participar en un proyecto de aspiraciones grandes, imponentes e importantes. A Fabio por ser el ejemplo de una carrera exitosa y a Erika por enseñarme a dar pasos grandes. A Carlos por ser un compañero incondicional dentro y fuera del laboratorio, porque gracias a su humor, serenidad y responsabilidad, este proceso estuvo cobijado por una gran amistad. A todas las manos amigas que en momentos de desesperación nos brindaron su ayuda, Johan, Juan Pablo, Angela y Angélica, espero que sigan haciendo parte de este proyecto y que sus logros se queden en casa.

A INDUMIL por creer en el proyecto y motivar la respuesta de sus participantes dándonos un ejemplo de palabra y eficiencia. A la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA) por el espacio de trabajo y la formación académica.

A Fabio Roldán y Erika García por la dirección de este proyecto, los aportes académicos, la confianza, la comprensión y el apoyo en momentos difíciles. A mi familia por la confianza y la motivación para hacer las cosas cada día mejor y a mis amigos por ser cómplices y víctimas de este proceso.

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TABLA DE CONTENIDO

AGRADECIMIENTOS …………………………………………………………………… VI TABLA DE CONTENIDO ………………………………………………………………. VII ÍNDICE DE FIGURAS …………………………………………………………………… IX ÍNDICE DE TABLAS …………………………………………………………………….. X RESUMEN ………………………………………………………………………………... XI

1. INTRODUCCIÓN ………………………………………………………………….…… 1 2. MARCO TEÓRICO ……………………..……………………………………………… 2 2.1 DEGRADACIÓN MICROBIOLÓGICA DE TNT …………………………………… 5 2.2 RUTAS METABÓLICAS …………………………………………………….……….. 7 2.2.1 VÍA I ………………………………………………………………………………….. 8 2.2.2 VÍA II …………………………………………………………………………………. 9 2.2.3 VÍA III ……………………………………………………………………...………... 11 2.3 MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE TNT ………………………….... 13 2.3.1 AISLAMIENTO ……………………………………………………………………. 13 2.3.1.2 MEDIOS DE CULTIVO ……………………………………………………….… 14 2.3.2 EVALUACIÓN DEL POTENCIAL DEGRADADOR ……………………….…... 15 3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN …………………….….... 16 4. OBJETIVOS ……………………………………………………………………….…... 17 5. MATERIALES Y MÉTODOS ………………………………………………………… 18 vii   

5.1 ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICO ……………………………………………………… 18 5.2 AISLAMIENTO ………………....………………………………………………...…. 19 5.2.1 ETAPA I: PREENRIQUECIMIENTO ……………………………….…………… 20 5.2.2 ETAPA II: AISLAMIENTO EN MEDIO DE CULTIVO SÓLIDO …………...….. 21 5.2.3 ETAPA III: SEGUNDO CULTIVO Y SELECCIÓN MACROSCÓPICA DE COLONIAS………………………………………………………………………….……. 21 5.2.4 ETAPA IV: MÉTODOS ANALÍTICOS: HPLC ……………………………...…… 22 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ……………………….……………………………... 23 6.1 ETAPA I: PRE-ENRIQUECIMIENTO ……………………………………………... 24 6.2 ETAPA II: AISLAMIENTO EN MEDIO DE CULTIVO SÓLIDO ………….……... 27 6.3 ETAPA III: SUBCULTIVO Y SELECCIÓN DE COLONIAS ……………….……. 33 6.4 ETAPA IV: MÉTODOS ANALÍTICOS: HPLC …………………………..………… 35 7. CONCLUSIONES …………………………………………………………………….. 43 8. RECOMENDACIONES ……………………………………………………………..... 44 9. REFERENCIAS ……………………………………………………………………….. 45 10. ANEXOS …………….……………………………………………………………….. 48

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ÍNDICE DE FIGURAS 1. Estructura química del TNT …………..……………………………………… 3 2. Reducción de TNT mediante enzimas Nitroreductasas ………………..… 10 3. Formación del complejo Meisenheimer ……………………………………. 12 4. Transformación del complejo Meisenheimer …………………………….… 12 5. Diversidad de colonias obtenidas en T2 de la muestra No. 6 …………… 32 6. Subcultivo en medio líquido correspondiente a T2 ……………………….. 33 7. Coloraciones de Gram de las colonias T1, T100, T54 y T 137 ………….. 34 8. Cromatograma Estándar 100ppm TNT …………………………………….. 36 9. Cromatograma Control No 1 ……………………………………………….... 38 10. Cromatograma Control No 2 ….……………………………………………. 39 11. Cromatograma Cepa T1 ………………………………………………….... 41 12. Cromatograma Cepa T100 ………………………………………………… 42

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ÍNDICE DE TABLAS

1. Propiedades físico químicas del TNT ……………………………………..… 3 2. Estudios que reportan microorganismos como potenciales degradadores de TNT …………………………………………………………………………..…. 6 3. Medios de cultivo más reportados para el aislamiento de microorganismos degradadores de TNT …………………………………………………………… 14 4. Puntos de Muestreo seleccionados ……………………………………..…. 18 5.

Tratamientos

utilizados

en

el

aislamiento

de

microorganismos

degradadores de TNT ………………………………………………………..…. 19 6. Caracterización físico química de las muestras ………………………….. 23 7. Morfología microscópica de los microorganismos desarrollados en los preenriquecimientos ……………………………………………………………….... 26 8. Número de colonias seleccionadas a partir de cada muestra …………… 30 9. Cromatografía curva de calibración de TNT ……………………………… 37 10. Cromatografía Control No 1 ……………………………………………..… 38 11. Cromatografía Control No 2 …………………………………………….…. 39 12. Cromatografía Cepa T1 …………………………………………………….. 41 13. Cromatografía Cepa T100 ……….………………………………………… 42

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RESUMEN El 2,4,6-Trinitrotolueno (TNT) es un compuesto nitroaromático con propiedades explosivas y gran estabilidad química. Su producción incrementó desde la primera guerra mundial y actualmente supera los dos millones de toneladas anuales. De la mano con su uso ha incrementado la contaminación generada por este compuesto, el cual tiene efectos mutagénicos y carcinogénicos. Estas características han generado la necesidad de buscar estrategias para eliminarlo del ambiente; la biorremediación se ha perfilado como una de las más efectivas debido a que además de ser ambientalmente amigable, logra la mineralización completa del contaminante. Para llevar a cabo este método es necesario conocer microorganismos con capacidad metabólica para degradarlo. Los sitios que presentan contaminación histórica con explosivos, son una excelente fuente de aislamiento de microorganismos con potencial degradador, ya que están adaptados a su presencia y han adquirido la capacidad de incorporarlo a su metabolismo y transformarlo. El aislamiento se realizó a partir de zonas aledañas a una de las plantas de producción y ensamblaje de explosivos más importante de Colombia, donde se presumía había contaminación histórica de TNT. Se utilizaron tres medios de cultivo, diferenciados básicamente por la presencia o ausencia de fuentes adicionales de carbono (glucosa, citrato, glicerol y acetato) y nitrógeno (NH4). El aislamiento se realizó en tres fases diferentes, en las que se incrementó la concentración del explosivo en el medio de cultivo desde 50ppm hasta 100ppm. Se seleccionaron de todos los medios, las colonias que presentaron diferencias morfológicas, y aquellas que en la última etapa se desarrollaron en el medio de cultivo que no contenía ninguna fuente adicional de carbono y nitrógeno. La degradación del explosivo por parte de los microorganismos aislados se evaluó mediante la técnica de HPLC, la cual permitió comprobar el potencial degradador de 31 cepas aparentemente diferentes.

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ABSTRACT 2,4,6–Trinitrotoluene (TNT) is a nitroaromatic compound that has stand out due to its explosive properties and its great chemical stability. Its production has been increased since the World War II and now days it is over 2 million tons per year. As well as the use of this product has been increase, the contamination that it generates, which has mutagenic and carcinogenic effects has also raised. These features have generated the need of strategies that allow the elimination of this compound from the environment. The bioremediation seems to be one of the most effective alternatives since it is environmentally friendly and also it gets the whole mineralization of the contaminant. In order to accomplish this method it is required to know microorganisms metabolically capable to degrade this compound. Places that present historic contamination with explosives or with some compounds of similar chemical nature are an excellent isolation source of microorganisms with degradation potential for these compounds. It occurs not only because the microorganisms have adapted to the compound presence but also because they have acquired the capability of incorporate it to its metabolism, transforming it in simpler and less toxic compounds. The isolation was made from zones near by the colombian more important explosive production and assembly plant. Those places where presume to be contaminated with nitroaromatics like TNT. Three different culture media were used, basically differenced by the presence or absence of additional carbon sources (glucose, citrate, glycerol and acetate) and nitrogen (NH4). The isolation was made in three different phases in which the explosive concentration was increased from 50ppm to 100 ppm. The colonies that were selected from all the different media were those that presented morphological differences, and those which in the last stage developed in the culture medium that has not additional sources of carbon and nitrogen. The explosive degradation by the microorganism was evaluated with the HPLC technique.

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1. INTRODUCCIÓN

El TNT es uno de los explosivos más importantes dentro de la industria militar debido a que detona con gran potencia y por su estabilidad es fácil de manipular. En Colombia, se viene utilizando en diversas actividades como la minería, las excavaciones y las demoliciones, y esto ha provocado el incremento de su producción. Este compuesto es uno de los nitroaromáticos más conocidos y hace parte de un grupo de xenobióticos recalcitrantes que generan efectos nocivos sobre el medio ambiente. Dichas estructuras aromáticas nitrogenadas, se caracterizan por ser compuestos persistentes y altamente tóxicos, son químicos mutagénicos y carcinógenicos, que están clasificados por la USEPA (del inglés United States Environmental Protection Agency) como uno de los contaminantes de mayor prioridad, debido a su toxicidad con el ambiente y el peligro que representan para la salud humana. Estas características, han generado la necesidad de encontrar métodos efectivos y ambientalmente amigables que permitan tratar diversos ambientes contaminados con TNT. Aunque la incineración es el método más utilizado a nivel mundial para tratar este tipo de contaminantes, en las últimas décadas la biorremediación se ha convertido en una de las mejores alternativas para la eliminación de contaminantes xenobióticos, debido a que representa ventajas en cuanto a costos, seguridad, mineralización completa y efectividad, frente a los otros métodos. La biorremediación es definida como la degradación biológica de compuestos orgánicos mediante el metabolismo de diversos organismos. Su mecanismo de acción ha convertido al conocimiento de microorganismos con potencial degradador de compuestos recalcitrantes como el TNT, en el principal objetivo para su implementación en ambientes contaminados con compuestos de esta naturaleza.

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Experiencias en biorremediación basadas en la degradación de compuestos persistentes como explosivos, fenoles e hidrocarburos, reportan que los microorganismos nativos presentes en estos ambientes contaminados son los degradadores más efectivos, pues están adaptados a las condiciones del ambiente y la presencia del contaminante. Esto lleva a pensar que los sitios con presencia histórica de contaminación por TNT son unas de las mejores fuentes para buscar degradadores nativos con capacidad para utilizar este compuesto en su crecimiento como fuente de carbono y/o nitrógeno 2. MARCO TEÓRICO

A partir de 1830, con el desarrollo de la química orgánica, se empezaron a sintetizar gran diversidad de compuestos, dentro de los que destacaron gracias a su propiedad explosiva, los productos resultantes del proceso de nitrificación (Lewis et al., 2003). La Primera Guerra Mundial, trajo consigo un gran avance en la producción de estos compuestos, que logró consolidar la industria militar como una de las industrias más importantes durante el siglo XX. El 2,4,6-trinitrotolueno, más conocido como dinamita o TNT, ha sido uno de los productos dominantes dentro de esta industria, siendo también uno de los más utilizados en el desarrollo de bombas, granadas, propulsores y dispositivos detonantes empleados en demoliciones (Nyanhongo et al., 2008), gracias a que por su estabilidad es fácilmente manipulable.

El TNT es el producto de la nitración del tolueno (Figura 1), que se genera mediante una reacción llamada sustitución electrofílica, la cual requiere la presencia de una mezcla de ácidos nítricos y sulfúricos altamente concentrados (McMurry, 2004). Este compuesto posee una gran estabilidad química, y esto permite que en la producción de dispositivos detonantes pueda utilizarse de forma pura, sin la presencia de ninguno de sus isómeros (Unión Española de Explosivos, 1994). Sin embargo, en algunas ocasiones, se generan mezclas con otro tipo de nitrocompuestos de igual naturaleza

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como el pentaeritritol, con el objetivo de aumentar el potencial detonante de los productos (Ballesteros 2006).

Figura 1: Estructura química del 2,4,6-Trinitrotolueno. Tomada de: Lewis et al., 2003 Tabla No 1: Propiedades físico químicas del TNT Propiedad Punto de solidificación Punto de Degradación Temperatura de Explosión Solubilidad Agua 20oC Coeficiente Henry Presión de Vapor 20oC Densidad Velocidad de Detonación Peso Molecular

Magnitud 80,6ºC 300ºC 400ºC 120mg/L 0,0018 150Pa 1,65g/cm3 6900m/s 227,1 gmol

Tomada de: Unión Española de Explosivos, 1994 Byung-Hoon et al., 2008

Además de ser un compuesto químicamente estable, el TNT se caracteriza por ser insoluble en agua, neutro y no corrosivo (Unión Española de Explosivos, 1994). Forma cristales color amarillo pálido y bajo la luz solar se torna color rojizo. Su temperatura de fusión está cercana a los 80,6ºC y la de explosión supera los 400 ºC (Tabla 1), por lo cual debe utilizarse un detonador para ocasionarla. Parte de la estabilidad de este compuesto se debe a la insensibilidad que posee hacia los golpes, la fricción y la agitación

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(Unión Española de Explosivos, 1994). Es importante tener en cuenta que para mantener estables sus características a temperatura ambiente y trabajarla sin peligro de explosión, la muestra debe estar disuelta en compuestos como etanol y acetona (Ballesteros, 2006).

EL TNT es uno de los explosivos más utilizados, su producción supera los dos millones de toneladas anuales (Byung-Hoon In et al., 2008), y esta es una de las razones por las cuales se ha convertido en un contaminante de gran prioridad dentro de la lista especial que maneja la EPA acerca de los químicos contaminantes tóxicos más peligrosos. Adicionalmente, el TNT hace parte de un grupo de xenobióticos recalcitrantes nocivos para el ambiente (Bradley et al., 1994); razón que cual ha motivado diversas investigaciones dirigidas hacia la búsqueda de tratamientos que permitan recuperar

las

zonas

afectadas

con

estos

compuestos,

las

cuales

generalmente están ubicadas alrededor de las plantas de producción, y ensamble de armamento (misiles) o de lugares de alta actividad militar. Estas zonas se han caracterizado por presentar concentraciones superiores a los 200g TNT/Kg de Suelo (Zoe & Neil, 2006).

Muchos

de

los

compuestos

nitroaromáticos,

como

los

explosivos,

fertilizantes, insecticidas y solventes, han sido clasificados como compuestos citotóxicos y carcinogénicos (Park et al., 2003). Por parte del TNT, se ha reportado que tiene la capacidad de causar anomalías en los eritrocitos, destrucción del hígado y diferentes tipos de cáncer (Zoe & Neil, 2006), y es esta otra de las razones por las cuales se clasifica como un contaminante prioritario.

Debido a que su estructura química no es similar a la de algún compuesto generado de forma natural, el TNT, y en general todos los nitroaromáticos, se han convertido en compuestos altamente persistentes, pues su constitución

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química artificial, limita el proceso de degradación por microorganismos nativos presentes en los suelos contaminados (Zoe & Neil, 2006). Estas características y su persistencia en el ambiente afecta la integridad del ecosistema provocando efectos mutagénicos en los humanos, peces, algas y microorganismos (Park et al., 2003).

Actualmente, se conocen diferentes tratamientos, físicos, químicos y biológicos para tratar ambientes contaminados con explosivos, entre los que destacan la incineración de suelos, el compostaje y la biorremediación. Sin embargo, algunos estudios demuestran que la degradación biológica de compuestos

nitroaromáticos

representa

ventajas

frente

a

las

otras

soluciones, debido a que es un tratamiento ambientalmente amigable, económico, seguro para el personal que lo efectúa y efectivo debido a que no traslada el contaminante de un ambiente a otro, sino que realmente lo trasforma en metabolitos simples e inocuos (Zoe & Neil, 2006).

Es así, como conocer el metabolismo de los microorganismos capaces de degradar los explosivos en compuestos más simples y menos tóxicos para el entorno, ha tomado gran importancia, abriendo las puertas al desarrollo de métodos de remediación biológica.

2.1 Degradación Microbiológica de TNT El hallazgo de microorganismos presentes en áreas contaminadas con compuestos nitroaromáticos como TNT, solventes y fertilizantes, evidencia la existencia de especies capaces de tolerar estos compuestos y utilizarlos en su metabolismo, bien sea como fuente de carbono o nitrógeno. Esta capacidad y la gran diversidad metabólica de los microorganismos se ha convertido en un potencial biotecnológico para la biorremediación de compuestos xenobióticos como los nitroaromáticos.

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Numerosos estudios han reportado el aislamiento de microorganismos con potencial degradador de TNT (Tabla 2), capaces incluso de mineralizar este compuesto, a partir de ambientes contaminados con explosivos. Tabla No 2: Estudios que reportan algunos microorganismos como potenciales degradadores de TNT. FUENTE

AÑO

Boopathy R., et al.

1993

Vanderberg L., et al.

1995

Pasti-Grigsby M., et al.

1996

Tope A., et al.

1999

Pavlostathis S., et al.

2002

Kim H., et al.

2002

Park C., et al.

2002

Yin H., et al.

2004

Kutty R., et al.

2005

Claus H., et al.

2007

Claus H., et al

2007

INVESTIGACIÓN Desulfovibrio sp: Transformación de TNT en compuestos como 2,4-diamino-6nitrotolueno. Mycobacterium vaccae: Degradación de TNT produciendo un compuesto marrón identificado como 4-amino-2,6-dinitroácido benzóico. Actinomyces sp: Degradación aeróbica y anaeróbica de TNT con producción de intermediarios hidroxilaminotoluenos. Estudio sobre la transformación de TNT en aminonitrotoluenos por parte de una cepa de Arthrobacter sp. Anabaena sp: Transformación de TNT en productos solubles y metabolitos polares. Evaluación de la capacidad de Klebsiella sp. Para degradar TNT en compuestos menos tóxicos como amino-nitrotolueno. Estimación de la cinética de degradación de TNT por parte de una cepa de Pseudomonas putida. Evaluación de la capacidad metabólica de Escherichia coli para convertir TNT en compuestos como Hidroxilaminodinitrotolueno. Clostridium acetobutylicum: Degradación de TNT mediante enzimas nitroreductasas. Raoutella terrígena degradación de TNT en metabolitos más sencillos Aislamiento en suelos contaminados con TNT de una cepa de Raoultella terrígena capaz de degradar este compuesto.

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2.2 Rutas Metabólicas de Degradación de TNT:

Se conocen principalmente tres vías metabólicas por las cuales algunos microorganismos

degradan

el

TNT,

convirtiéndolo

en

compuestos

intermediarios menos tóxicos. La primera (Vía I), se da en condiciones de anaerobiosis y consiste en una transformación secuencial de los grupos nitro unidos al anillo aromático hacia la correspondiente amina (Yin et al., 2004). Esta vía de transformación, es generalmente realizada por microorganismos anaeróbicos, donde Clostridium sp es uno de los más reportados, junto con algunas bacterias sulfatoreductoras como Desulfovibrio sp (Zoe & Neil, 2006).

Así mismo, se han descrito otras dos vías alternativas, que ocurren en presencia de oxígeno, aún cuando una de ellas no lo utiliza como aceptor final de electrones. Precisamente, la segunda vía (Vía II), es aquella en la que el TNT actúa como un aceptor de electrones, debido a la gran facilidad que existe para reducir los nitro-grupos formados por los enlaces nitrógenooxígeno altamente electrofílicos (Yin et al., 2004), con este metabolismo se han reportado bacterias como Enterobacter cloacae, Escherichia coli y Pseudomonas putida (Zoe & Neil, 2006).

La tercera vía (Vía III) es una de las rutas metabólicas más complejas, que se caracteriza por la formación de un complejo llamado Meisenheimer, que se genera cuando el microorganismo es capaz de atacar directamente los enlaces que conforman el anillo aromático. Esta es una de las vías más difícil y menos común dentro de los microorganismos reportados (Zoe & Neil, 2006).

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2.2.1 Vía I

La descripción de esta ruta metabólica es dada con claridad en el estudio realizado

por

Preuss

y

col.

(1992),

donde

utilizaron

bacterias

sulfatoreductoras crecidas en un medio con sulfato y piruvato como fuente de energía y TNT como única fuente de nitrógeno.

Esta degradación consiste, básicamente, en una reducción secuencial de los grupos nitro del TNT hasta sus respectivas aminas (Yin et al., 2004). Algunos autores reportan que la reducción del primer nitro-sustituto del TNT, puede darse bajo condiciones tanto de aerobiosis como anaerobiosis (Zoe & Neil, 2006). Cuando se lleva a cabo este paso se obtiene uno de los primeros subproductos, denominado: 4-amino-2,6-dinitrotolueno (4-ADNT), y su isómero: 2-amino-4,6-dinitrotolueno (2-ADNT) (Preuss et al., 1992). Una de las características de esta secuencia de reacciones, es que el segundo grupo nitrogenado no se reduce hasta que finaliza la reacción anterior, por lo cual el segundo paso está definido por la transformación de 4-ADNT y 2-ADNT a 2,4-diamino-6-nitrotolueno (DANT) (Preuss et al., 1992).

La siguiente etapa es la reducción total del TNT, produciendo finalmente triaminotolueno (TAT). Esta reacción requiere un donador de electrones como el piruvato o el monóxido de carbono y un conjunto de enzimas encargadas de catalizar la reacción, llamadas hidrogenasa, Piruvato: ferredoxin oxidoreductasa y monóxido de carbono dihidrogenasa (Preuss et al., 1992).

Por lo general, este paso ocurre de manera directa sin la generación de ningún intermediario, sin embargo se han reportado casos en los que bajo la acción de la enzima monóxido de carbono dihidrogenasa se genera un compuesto intermediario conocido como 2,4-diamino-6-hidroxilaminotolueno

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(DAHAT) (Preuss et al., 1992). Los resultados obtenidos en este experimento sugirieron que bajo estas condiciones, el monóxido de carbono juega un papel bifuncional dentro de la reacción, donde además de ser el donador de electrones puede ser inhibidor de la reducción de DAHAT a TAT (Preuss et al., 1992).

2.2.2 Vía II

Esta es una de las rutas metabólicas que aunque no es estrictamente aeróbica, por lo general ocurre en presencia de oxígeno (Kim et al., 2002). El proceso, consiste en una reacción reductiva (Figura 2), a partir de la cual, uno o máximo dos de los grupos nitro que componen el TNT son convertidos en radicales nitroso e hidroxilamina, por acción de enzimas nitroreductasas (Kim et al., 2002).

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TNT 

Nitroso‐Dinitrotolueno 

Hidroxilamino‐Dinitrotolueno 

Amino‐Dinitrotolueno 

Figura 2: Reducción de TNT mediante enzimas Nitroreductasas (Tomada de: Zoe & Neil, 2006)

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2.2.3 Vía III

Esta ruta metabólica corresponde a la degradación aeróbica del TNT. La formación del complejo Meisenheimer y la dependencia de oxígeno, son sus principales características (Zoe & Neil, 2006). Actualmente no se reportan muchos microorganismos capaces de llevar a cabo este mecanismo, sin embargo

se

conoce

con

certeza

que

Pseudomonas

fluorescens,

Enterobacter cloacae y Rhodococcus erythropolis son capaces de degradar compuestos nitroaromáticos mediante esta vía (Núñes et al., 2001).

Este tipo de metabolismo, al ser uno de los más complejos, es también el menos conocido, aunque no se han determinado con seguridad todos los metabolitos producidos, se cree que la etapa final de esta ruta es la mineralización total del TNT (Vorbeck et al., 1994; Núñes et al., 2001; Zoe & Neil, 2006).

La formación del complejo Meisenheimer (Figura 3), implica la pérdida de las propiedades aromáticas del benceno. Aunque este compuesto es uno de los mejores donadores de electrones, cuando se encuentra nitrogenado (como lo es el TNT), pierde propiedades oxidativas, debido a la presencia de los grupos nitro unidos a sus carbonos 2,4 y 6 (Zoe & Neil, 2006). En consecuencia, el potencial redox del TNT disminuye, llevándose a cabo un ataque reductivo que trae consigo la formación NO2 y el complejo anteriormente mencionado (Figura 4) (Núñes et al., 2001; Zoe & Neil, 2006).

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Figura 3: Formación del Complejo Meisenheimer (Tomada de: Vorbeck et al., 1994)

Complejo Híbrido‐Meisenheimer

Complejo Dihiíbrido‐Meisenheimer

Figura 4: Transformación del complejo Meisenheimer (Tomada de: Zoe & Neil, 2006)

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Aunque los últimos productos de esta ruta metabólica no se han podido identificar, se ha confirmado que la transformación del complejo dihíbridoMeisenheimer ocurre mediante varias reacciones de reducción que genera la producción de diversos metabolitos y NO2 (Zoe & Neil, 2006). 2.3 Microorganismos Degradadores de TNT 2.3.1 Aislamiento Numerosos estudios reportan que los microorganismos nativos de ambientes contaminados con explosivos, son los microorganismos que presentan mejor potencial degradador de compuestos nitrogenados como el TNT.

Debido a la complejidad química que caracteriza a todos los compuestos xenobióticos, la búsqueda de estos microorganismos implica la localización de áreas de contaminación histórica, que son aquellos lugares en los que el compuesto ha permanecido presente durante largos periodos de tiempo; con el objetivo de encontrar microorganismos que han conseguido adaptarse a su

presencia,

desarrollando

potencial

degradador,

que

les

permite

aprovecharlo en su metabolismo como única fuente de carbono o nitrógeno (Zaripov et al., 2004; Oh et al., 1998).

Varias

investigaciones

reportan

que

el

TNT

es

tomado

por

los

microorganismos como fuente única de nitrógeno (Zaripov et al., 2004; Oh et al., 1998). Por ese motivo, necesitan la presencia adicional de compuestos que puedan consumir como fuente de carbono, bien sea materia orgánica presente naturalmente en el suelo o carbohidratos simples de fácil degradación como glucosa, succinato y acetato (Gonnison et al., 1993)

13   

2.3.1.2 Medios de Cultivo El aislamiento de microorganismos con este potencial degradador, requiere de un medio de cultivo que le brinde las condiciones nutricionales para efectuar este metabolismo. En la Tabla No 3, se muestra el contenido de cinco medios de cultivo diferentes, utilizados en estudios realizados con microorganismos degradadores de compuestos nitroaromáticos. En términos generales, además del explosivo, los microorganismos deben contar con una fuente de carbono, una solución mínima de sales, fósforo, vitaminas y elementos traza.

Tabla No 3: Medios de cultivo más reportados para el aislamiento de microorganismos degradadores de TNT. FUENTE

AÑO

Spanggord R., et al.

1991

Boopathy R., et al.

1993

Kim H., et al.

2002

Zaripov S., et al.

2003

Claus H., et al.

2007

MEDIO DE CULTIVO FC: FN: 100ppm DNT Medio Base: K2HPO4, 0.7g/L; KH2PO4,0.3 g/L;(NH4)2S04, 0.5 g/L; NaCl, 0.5 g/L; MgSO4 7H20, 0.05 g/L; CaCl2.2H20, 0.1 g/L; FeSO4 7H20, 0.003 g/L. Elementos Traza: H3BO3, 0.1g/L; CaSO4 5H20, 0.05 g/L; ZnSO4. 7H20, 0.05 g/L; Na2MoO2 6H20, 0.05 g/L. FC: Lactato o Piruvato 30mM FN: TNT 100ppm Medio Base: KH2PO4, 2.94 mM; K2HPO4, 1.15 mM; NH4Cl, 9.35 mM; NaCl, 10.27 mM; MgCl2, 0.5 mM; CaCl2, 0.34 mM; Na2SO4, 20.0 mM; Na2S, 0.5 mM; Resarsurina 0,003 mM. FC: 2,5g/L Glucosa FN: 300ppm TNT; 1g/L Sulfato de Amonio Medio Base: 0,1g/L MgSO4; 3,5g/L K2HPO4; 1,5g/L KH2PO4; 1g/L Extracto Levadura FC: Glucosa 5g/L FN: TNT 12-200 g/L Medio Base: 0,25g/L MgSO4; 4,5 g/L Na2HPO4; 3 g/L KH2PO4; 1 g/L (NH4)SO4; 0,05 g/L Extracto de Levadura Agar Nutritivo Standard Con adición de 10mg/L TNT

14   

Como se muestra en la tabla anterior (Tabla No 3), la concentración de TNT óptima para estimular la degradación del compuesto por parte de los microorganismos, varía en las investigaciones en un rango muy amplio, pues abarca concentraciones que van desde 50ppm, hasta 200g/L (200.000ppm). Sin embargo algunos estudios reportan que concentraciones por encima de los 100ppm ejercen un efecto inhibidor sobre el crecimiento de los microorganismos con potencial degradador (Gonnison et al., 1993). 2.3.2 Evaluación del Potencial Degradador La evaluación del potencial degradador de los microorganismos crecidos en un medio, se da generalmente mediante el control de consumo del sustrato, en este caso TNT. Los métodos más utilizados para esto son la cromatografía de gases y la cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) (Núñes et al., 2001), el objetivo es determinar la disminución de la concentración inicial de TNT presente en el medio en un determinado intervalo de tiempo. En el análisis por HPLC, un gran número de estudios reportan el etanol (Lachance et al., 2004; Collie et al., 1995; Park et al., 2003) como la fase líquida más utilizada, sin embargo también se usan compuestos como metanol y acetona. Aunque esta técnica es la más reportada para el estudio de la degradación de compuestos nitroaromáticos, Bruns-Nagel y col (1996) reportan que la cromatografía de gases fue el método más rápido y eficiente para la detección de compuestos como TNT, 4-ADNT y 2-ADNT en muestras provenientes de suelos contaminados. Por otra parte, existen técnicas más específicas, en cuanto a que son útiles para detectar uno de los posibles productos de la degradación. La detección de nitratos, mediante la técnica colorimétrica de Nessler, es una alternativa viable cuando se evalúa la degradación de TNT por parte de un

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microorganismo que lleva a cabo el metabolismo aeróbico en el que se produce el complejo de Meisenheimer (Vorbeck et al., 1994). 3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

El uso de TNT ha incrementado con el desarrollo de la industria militar que inició su progreso en la Primera Guerra Mundial. En Colombia, este compuesto se utiliza en diversas actividades que incluyen la excavación, la minería y la milicia.

De la mano de su utilización, ha incrementado la

contaminación producida por la acumulación de este compuesto en diversos ambientes. La toxicidad de su composición química y las propiedades mutagénicas y carcinogénicas que le son atribuidas, ha incentivado la búsqueda de soluciones efectivas y económicas, capaces de disminuir la concentración de este compuesto sin trasladarlo de un ambiente a otro. Actualmente, la biorremediación se perfila como una de las mejores alternativas

para

remediar

regiones

contaminadas

con

compuestos

explosivos como TNT, debido a que es una solución ambientalmente amigable que requiere una baja inversión económica. Sin embargo, en Colombia no se reporta ninguna investigación orientada a la biorremediación de explosivos y esto ha impedido el aprovechamiento de sus ventajas en nuestro país. La biorremediación, es una herramienta biológica que busca la degradación de compuestos químicos persistentes, por medio de organismos vivos que son capaces de metabolizarlos. Esta alternativa exige el conocimiento previo de microorganismos (en este caso) con una capacidad metabólica para degradar compuestos de naturaleza química similar al contaminante. Esta necesidad y el hecho de que no existen estudios similares en Colombia, ha motivado

esta

investigación,

cuyo

objetivo

principal

fue

aislar

microorganismos nativos de suelos contaminados con explosivos, capaces de degradar TNT.

16   

4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL: Aislar microorganismos degradadores de TNT, a partir de ambientes contaminados con explosivos.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: •

Identificar sitios contaminados en los que posiblemente se encuentren microorganismos con potencial degradador de TNT.

•

Evaluar si el TNT es utilizado por los microorganismos degradadores como fuente de carbono y/o nitrógeno, utilizando otras fuentes adicionales fácilmente asimilables.

•

Realizar

una

caracterización

macro

y

microscópica

de

los

microorganismos degradadores de TNT aislados. •

Comprobar la degradación de TNT por parte de los microorganismos aislados mediante la técnica de HPLC.

17   

5. MATERIALES Y MÉTODOS Las muestras de suelo, agua y lodos contaminados con residuos explosivos, entre los que se encontraban grandes cantidades de TNT, fueron recogidas en sitios aledaños a una de las principales plantas colombianas fabricadoras de productos explosivos comerciales.

Alrededor de sus instalaciones, se

definieron doce puntos de muestreo, que fueron elegidos por su proximidad con las áreas de manipulación del compuesto de interés y las áreas de desechos y manejo de residuos resultantes de los procesos de producción físicos y químicos (Tabla 4). Las muestras se almacenaron en bolsas estériles que se mantuvieron en refrigeración hasta su análisis en el laboratorio de USBA (Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental). Tabla No 4: Puntos de muestreo seleccionados No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Área Muestreada Exterior Canal Exterior Trampa Taller Multiplicador Canal de la Trampa Caneca Tanque de Transporte Ex Caja de Captación Concentración Tensoactivos Campo de Prueba Lodos de Planta Tratamiento de Aguas Residuales (PTAR) Fitorremediación Caño PTAR

5.1 Análisis Físico-Químico Inicialmente, se realizó una caracterización preliminar de las muestras determinando pH y salinidad, estas propiedades se calcularon siguiendo los POE’s del laboratorio de USBA de la Universidad Javeriana. Estas propiedades se eligieron por la facilidad y economía con la que pueden ser calculadas y por ser las más importantes a la hora de guiarnos en la

18   

preparación del medio de cultivo. A la muestra número 6, correspondiente a los trozos de producto comercial tomados del tanque transportador de la planta no se le midieron estas variables, debido a que por su composición se recomendó evitar al máximo su manipulación. Incluir cálculos sobre la concentración inicial de explosivo y la presencia de fuentes de carbono y nitrógeno, habría permitido realizar una caracterización completa de las muestras, arrojando datos importantes para definir cuál de los sitios funcionaría mejor como fuente de aislamiento de microorganismos degradadores, sin embargo estos ensayos no se incluyeron en este proyecto por limitantes de tiempo y presupuesto. 5.2 Aislamiento La preparación de los medios de cultivo que se utilizaron fueron tomadas de estudios

que

reportaron

aislamientos

exitosos

de

microorganismos

degradadores de TNT (Zaripov et al., 2004; Kim et al., 2002). Para realizar el aislamiento a partir de las muestras tomadas, se evaluó el crecimiento de microorganismos en tres tratamientos diferentes. La diferencia entre estos tratamientos, fue básicamente la presencia de carbono y nitrógeno, con el fin de determinar si el TNT era metabolizado por los degradadores como una fuente de carbono o nitrógeno. El medio de cultivo base para los tres, contenía una solución mínima de sales, buffer fosfato, trazas, vitaminas y TNT. Tabla No 5: Tratamientos Utilizados en el aislamiento de microorganismos degradadores de TNT Tratamiento T1 T2 T3

Características Fuente Carbono Fuente Nitrógeno + +

19   

Como fuente de carbono se utilizó una mezcla de glucosa, glicerol, citrato y acetato a una concentración final de 25 ppm, y como fuente de nitrógeno 10 ppm de nitrato de amonio (NH4NO3). El explosivo se adicionó a los tres tratamientos en solución con acetona a una concentración final de 50 ppm, concentración que fue seleccionada por ser la más reportada en diversas investigaciones,

como

una

concentración

óptima

para

evaluar

la

biodegradación de este compuesto. El proceso que se llevó a cabo para el aislamiento de microorganismos degradadores, se dividió en tres etapas, cada una con una duración aproximada de diez días.

5.2.1 Etapa I: Preenriquecimiento: Se montaron en total 36 preenriquecimientos, tres tratamientos por cada una de las 12 muestras, utilizando frascos de vidrio estériles (100 mL). El montaje se realizó colocando inicialmente 1 g o mL de muestra y 125 µL de solución de explosivo en acetona, solvente que se dejó evaporar en la cabina de flujo laminar durante dos horas, con el objetivo de volatilizar la acetona y disminuir los residuos que pudieran interferir en los ensayos y evitar que fuera utilizado como una fuente de carbono adicional para los microorganismos,

o

ejerciera

un

efecto

tóxico

sobre

los

mismos.

Posteriormente, se agregaron 4 g o mL de muestra y 45 mL del medio de cultivo correspondiente a cada tratamiento. Los preenriquecimientos se mantuvieron a temperatura ambiente (21,0 ± 0,9 o

C) y agitación constante de 115 rpm durante 10 días. Los frascos utilizados

para mantener estos microcosmos no se sellaron completamente, para garantizar la presencia de oxígeno en el ambiente.

20   

5.2.2 Etapa II: Aislamiento en Medio de Cultivo Sólido A partir de los preenriquecimientos, se realizaron diluciones seriadas (10-2, a 10-5) en solución salina al 0,85% p/v, utilizando la metodología estandarizada por Latorre (2007) en el laboratorio de USBA. Todos los preenriquecimientos, fueron sembrados en superficie por duplicado en tres medios de cultivo sólidos, correspondientes a T1, T2 y T3 (Tabla 5). Adicionalmente se realizó un ensayo en una de las réplicas del Tratamiento1 (T1) que consistía en adicionar el explosivo en la superficie del medio ya solidificado, mientras que en los otros tratamientos se manejó disolviendo la solución de explosivo y acetona en el medio líquido estéril justo antes de servir las cajas. Todos los cultivos fueron incubados a temperatura ambiente (21,0 ± 0,9 oC) en condiciones aeróbicas, durante aproximadamente dos semanas.

5.2.3 Etapa III: Segundo cultivo y selección macroscópica de colonias. La etapa III inició con la selección de todas las colonias que crecieron en los tratamientos y presentaron diferencias macroscópicas, esperando tomar el mayor número de posibles degradadores. El segundo cultivo se realizó en medio sólido de cada uno de los tratamientos con concentración doble de TNT

(100ppm)

para

generar

mayor

presión

selectiva

sobre

los

microorganismos. Para llevar a cabo el aislamiento de estas colonias se utilizaron cajas de petri marcadas con una cuadrícula de 22 espacios (uno para cada colonia). Cada colonia seleccionada se repicó con un palillo de madera estéril en los tres tratamientos, el cual se introdujo finalmente en un tubo para centrífuga (50 mL) con 10 mL de T2 (100 ppm de TNT), medio de cultivo elegido para el

21   

análisis mediante HPLC, debido a que es reportado como el medio más favorable para la degradación del compuesto evaluado. Estos cultivos fueron incubados a temperatura ambiente (21,0 ± 0,9 oC) durante 10 días. Finalizado este periodo, se evaluaron las características macroscópicas y microscópicas de todas las colonias. Se definió como primer criterio de selección el crecimiento positivo en T1, debido a que por sus condiciones nutricionales este medio podría ser el más selectivo. Posteriormente se evaluaron las colonias crecidas en T2 y se seleccionaron aquellas que presentaran morfologías macro y microscópicas diferentes.

5.2.4 Etapa IV: Métodos Analíticos: HPLC El TNT residual de los tubos sembrados en la etapa anterior, fue evaluado mediante cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC), basándose principalmente en el método 8330 descrito por la EPA (EPA, 1994). Para su desarrollo se tomaron 1.2 ml de cada cultivo y se centrifugaron a 1200 rpm durante 10 min; el sobrenadante obtenido se pasó a través de un filtro de membrana 0.2 µm (Advantec) de nitrato de celulosa.

Posteriormente se

inyectaron 100 µL de cada muestra al equipo de HPLC marca Shimatzu prominence, que consta de un detector de diodos y una columna Restek C18. Se utilizó una solución Metanol:Agua (50:50 v/v) como fase móvil con un flujo de 1 ml/minuto y una

temperatura de 35ºC. La longitud de onda

empleada para la detección de los picos de TNT fue 254 nm. Una

solución estándar de TNT fue utilizada para validar el tiempo de

retención de este compuesto y se procesó bajo las mismas condiciones.

22   

Para poder cuantificar la concentración de TNT presente en los cultivos, se elaboró una curva patrón, utilizando soluciones estándar preparadas con concentraciones conocidas de TNT (12,5 ppm, 25 ppm, 50 ppm, 100 ppm). Se definieron dos controles diferentes. El control No 1 correspondió al medio de cultivo del Tratamiento 2 sin ser inoculado, el cual permitió cuantificar la concentración inicial de TNT presente en el medio. El segundo control fue tomado del medio de cultivo T2 contenido por un palillo de madera estéril, igual a los que se utilizaron para inocular las cepas. Esto con el objetivo de visualizar su efecto en el medio.

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se realizó una caracterización preliminar físico-química de las muestras y se obtuvieron los siguientes valores de pH y conductividad. Tabla 6: Caracterización físico-química de las muestras Muestra No

pH

1 2 3 4 5 7 8 9 10 11 12

7,11 7,34 6,58 7,14 2,11 7,54 7,20 7,88 8,73 7,42 8,95

Conductividad (deciSiemens/metro) 0,34 0,22 0,17 1,15 1,47 0,44 14,96 0,63 1,57 0,47 0,44

Dilución 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1

La conductividad de los ambientes muestreados se determinó con el objetivo de tener un indicio a cerca de las propiedades salinas de los mismos, para así orientar la preparación de los medios de cultivo. En general, los valores de todas las muestras estuvieron entre 0 y 2 dS/m, valores entre los que se

23   

consideran ambientes normales de baja salinidad. Sin embargo, la muestra No. 8, procedente del tanque de concentración de tensoactivos, obtuvo una conductividad superior de 14,96 dS/m indicando características de fuerte salinidad (Tabla No. 6). Este fenómeno, puede deberse a la presencia de compuestos como carbonatos, cloruros y sulfatos, que junto con los tensoactivos, pueden ser compuestos residuos de la producción de los explosivos comerciales. Como se puede visualizar en la Tabla No 6, la mayoría de las muestras presentaron un pH cercano a la neutralidad, sin embargo algunas de ellas arrojaron valores extremos de acidez y alcalinidad. Aunque es difícil pensar que a partir de muestras con un pH de 2,11 se logren obtener microorganismos nativos que puedan desarrollarse en un medio de cultivo con pH neutro, no se considera una variable que pueda influir en el aislamiento de microorganismos degradadores de TNT, ya que como lo reportan Zaripov (2004) y Kim (2002) en sus estudios, la degradación biológica de compuestos nitroaromáticos ha sido posible en amplios rangos de pH.

6.1 Etapa I: Pre-enriquecimiento Todos los pre-enriquecimientos presentaron turbidez lo cual podía ser considerado como indicador de crecimiento. Se comprobó la presencia de microorganismos

mediante

coloración

de

Gram

y

se

observaron

principalmente tres morfotipos: cocos Gram positivos, bacilos Gram positivos (GP) y bacilos Gram negativos (GN), siendo las dos últimas las morfologías más predominantes. Un estudio realizado por Fuller y col (1996) demostró que las bacterias Gram positivas son muchos más sensibles al TNT que las bacterias Gram negativas, las cuales tienden a tolerar concentraciones más altas de este compuesto y presentar velocidades de degradación mucho más

24   

eficientes. Sin embargo, en la evaluación microscópica que se hizo de los pre-enriquecimientos, fue más común la presencia de bacterias GP que GN (Tabla 7), lo que puede deberse a la ventaja que representa para estas bacterias (GP) la esporulación. A pesar de que los pre-enriquecimientos preparados presentaban una concentración considerable de TNT (50 ppm), la presión selectiva que este ejerció sobre los microorganismos no fue tan alta, debido a la posibilidad de que las muestras (suelos, lagos y aguas) contuvieran algunas trazas de carbono y nitrógeno fácilmente asimilables. Aunque habría sido bastante útil determinar la presencia de estas trazas y la concentración inicial de TNT en cada una de las muestras para conocer con certeza las condiciones nutricionales bajo las cuales se desarrollaban los microorganismos nativos, esta determinación no se realizó por limitantes de tiempo y presupuesto. En algunas muestras se observó la presencia de bacilos Gram negativos curvos y en forma de “S”, muy similares a las bacterias características del ciclo del azufre (Tabla 7). En un estudio realizado por Kulkarni y Chaudhari (2007) se presentó una revisión general de los microorganismos capaces de degradar compuestos nitroaromáticos, donde encontraron que Desulfovibrio sp y en general bacterias sulfato reductoras, presentan la capacidad de degradar TNT. La morfología característica de estas bacterias se encontró en los Tratamientos 1 y 2 (Tabla 7), los cuales tienen en común la ausencia de una fuente adicional de nitrógeno. El estudio mencionado, reporta que estas bacterias utilizan el TNT como única fuente de nitrógeno, convirtiéndolo en triaminotolueno (TAT) y algunos otros compuestos no identificados. Es importante tener en cuenta que al abrir los frascos de los preenriquecimientos, el sonido y los olores percibidos evidenciaron la acumulación de gases, los cuales sugieren un metabolismo activo por microorganismos dentro de los mismos.

25   

Aunque inicialmente las condiciones de los microcosmos fueron aeróbicas, es probable que al finalizar el periodo de incubación, la disponibilidad de oxígeno haya disminuido y las condiciones finales fueran favorables para el crecimiento de microorganismos anaerobios. La degradación de TNT se puede llevar a cabo en cualquiera de estas condiciones, de hecho microorganismos

estrictamente

anaeróbicos

como

Clostridium

sp.y

Acetobacterium sp han sido reportados como potenciales degradadores de compuestos nitroaromáticos como TNT (Neal & Arnett, 2004; Kutty & Bennett, 2005).

Tabla 7: Morfología microscópica de los microorganismos desarrollados en los pre-enriquecimientos. Mtra.

1

2

3

4

5

6

T1

Bacilos Gram Positivos x

Bacilos Gram Negativos -

Cocos Gram Positivos x

T2

x

-

x

T3 T1 T2 T3 T1 T2 T3

x x x x x x x

x x -

x x x x x

T1

x

-

x

T2

x

-

x

T3 T1 T2 T3 T1 T2 T3

x x x x x x

x -

x x x x x

Tto

26   

Otra Morfología BGN en forma de S BGN curvo BGN en forma de S BGN en forma de S -

Mtra.

7

8

9

10

11

12

T1

Bacilos Gram Positivos x

Bacilos Gram Negativos -

Cocos Gram Positivos x

T2

x

x

x

T3 T1 T2 T3 T1 T2 T3 T1 T2 T3 T1 T2 T3

x x x x x x x x x x -

x x x x

-

T1

x

-

-

T2 T3

x x

x -

x -

Tto.

Otra Morfología BGN en forma de S BGN curvo BGN en forma de S -

6.2 Etapa II: Aislamiento en medio de cultivo sólido El crecimiento de colonias en los medios de cultivo correspondientes a los tres tratamientos fue muy diverso, sin embargo no se observó ninguna característica particular de las colonias conocidas de los microorganismos degradadores de TNT que son descritas en estudios anteriores. Nyanhongo y col (2008) por ejemplo, realizaron un estudio en el que lograron identificar el potencial degradador de microorganismos como Pseudomonas putida y Bacillus SF en medio de cultivo sólido, gracias a las características macroscópicas y el viraje del color del medio provocado por las colonias. Según los resultados de esta investigación, cuando los microorganismos degradan los cristales de TNT, forman colonias color rojo oscuro y viran el color del medio a rojo o amarillo, dependiendo del metabolito que produzcan.

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Con el objetivo de evidenciar un efecto parecido, se realizaron dos ensayos sobre la forma de adicionar el explosivo al medio de cultivo, en superficie y en solución. Aunque se encontraron diferencias importantes en el crecimiento de microorganismos adicionando la solución de TNT en la superficie del medio, es necesario estandarizar la concentración de TNT bajo la cual se logra opacidad en el medio de cultivo, de tal forma que se puedan observar los halos de degradación, o se logre visualizar el cambio de color provocado por la producción de metabolitos como 2-aminodinitrotolueno y sus isómeros. En este ensayo, en el que el TNT fue adicionado en la superficie del medio una vez solidificado, el número de colonias obtenidas fue mucho más pequeño y la diversidad morfológica que se apreció en estas cajas fue menor, probablemente debido a que la concentración final de TNT que se consiguió sobre la superficie del medio fue mayor que la que resultó con la disolución del explosivo en el medio líquido, ensayos en los que el número de colonias fue mucho mayor y con una distribución en el medio mucho más homogénea. La adición del explosivo en la superficie, formó una mancha blanca opaca sobre el medio, que se difuminó al adicionar el inóculo. Sin embargo, en una de las cajas fue posible observar el crecimiento de dos colonias circulares, pequeñas, blancas, convexas y de borde regular sobre la mancha de TNT. Alrededor de las colonias se identificó la formación de una zona de aclaramiento, que sin ser totalmente translúcida, fue posible diferenciarla en la superficie del medio. Aunque no se puede afirmar que dicha zona corresponde a un halo de degradación, es importante tener en cuenta, que estas dos colonias además de presentar la morfología más abundante encontrada en los diferentes ensayos, fueron seleccionadas para pasarlas al subcultivo de la Etapa III. De igual forma presentaron un crecimiento abundante en el Tratamiento 2, que según la teoría se ha reportado como el

28   

medio de cultivo óptimo para el crecimiento de los microorganismos con potencial degradador de TNT. Diversos estudios (Gonnison et al., 1993; Zaripov et al., 2003; Stenuit et al., 2006; Kulkarni M. & Chaudhari A., 2007), han demostrado que dichos microorganismos utilizan el explosivo como única fuente de nitrógeno, por lo cual recomiendan agregar al medio de cultivo una fuente adicional de carbono fácilmente asimilable como la glucosa o el acetato (Gonnison et al., 1993), para generar un balance de nutrientes favorable para la degradación. En este estudio, el tratamiento con estas características (T2) no solo presentó el mayor número de colonias, sino que fue donde mayor diversidad morfológica se observó. Como parte de los resultados, se esperaba que el crecimiento en los otros tratamientos, en los que no se adicionaba ninguna fuente de carbono, fuera bajo; sin embargo en T3, por ejemplo, la mayoría de las muestras presentaron crecimiento masivo de una colonia puntiforme, trasparente y regular. Mientras que en T1, a pesar de ser el tratamiento con menor recuperación de biomasa, fue bastante diverso. Es posible suponer que todos los microorganismos capaces de desarrollarse bajo las condiciones nutricionales de estos medios, son potenciales degradadores de TNT, sin embargo es importante tener en cuenta, que al ser muestras procedentes de suelos y lodos, las suspensiones inoculadas, podrían contener algunas trazas importantes de carbono orgánico y nitrógeno fácilmente asimilable, suficientes para permitir su desarrollo; razón por la cual se realizaron pases sucesivos de las colonias en medios de cultivo con mayor concentración de explosivo (100ppm), esperando ejercer una presión selectiva sobre los microorganismos no degradadores de TNT.

29   

Tabla 8: Número de colonias seleccionadas a partir de cada muestra. Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Origen Exterior Canal Exterior Trampa Taller Multiplicador Canal de la Trampa Caneca Tanque de Transporte Ex Caja de Captación Concentración Tensoactivos Campo de Prueba Lodos de PTAR Fitorremediación Caño PTAR

No Colonias 22 22 20 18 16 14 14 8 15 6 4 5

El crecimiento de microorganismos fue muy diferente en todas las muestras. Aunque en términos generales, fue positivo para todas, se obtuvo un mayor número de colonias potencialmente degradadoras, a partir de los cultivos procedentes de las muestras 1, 2 y 3 (Tabla 8). Estas muestras se caracterizaron por estar constituidas de lodo y agua procedentes del pantano que rodeaba la planta de cristalización del explosivo (Muestra No 1) y los canales de desagüe ubicados alrededor de ella (Muestras No 2 y 3). La carga microbiana puede deberse a la alta disponibilidad de nutrientes de estos ambientes y la lejanía de los mismos con fuentes de contaminación por sustancias químicas que puedan ejercer algún efecto tóxico. La muestra No 10 y la Muestra No 12, presentaron el pH más alto de todas las muestras obtenidas, 8,73 y 8,95, respectivamente (Tabla 6). La primera corresponde a los lodos de la Planta de Tratamiento de Aguas Residuales (PTAR) caracterizados por contener altas concentraciones de aluminio, y la segunda al caño ubicado alrededor de ésta. Probablemente el pH alto, influyó en que a partir de estas muestras la recuperación de colonias no haya sido muy abundante, pues como se muestra en la Tabla 8 fueron las

30   

muestras a partir de las cuales se seleccionaron menos colonias aparentemente degradadoras de TNT. El impacto químico característico de estas zonas es la causa de la carga microbiana reducida presente en estos ambientes. Contrario a esto, la Muestra No 5, que también se caracterizó por tener un pH extremo, pero en este caso ácido con un valor de 2,11, presentó en comparación con las muestras 10 y 12, un crecimiento abundante. Mientras en T2 se obtuvo gran diversidad morfológica (Figura 5), en T1 y T3, las colonias, aunque abundantes fueron todas muy similares: trasparentes, pequeñas, convexas y circulares. Debido a que el pH del medio utilizado se encontraba cercano a la neutralidad, no se esperaba crecimiento microbiano a partir de estas muestras, pues se dio un cambio drástico en las condiciones ambientales,

y

se

esperaría

que

esto

generara

estrés

en

los

microorganismos inhibiendo su crecimiento. Estos resultados abren dos nuevos interrogantes, el primero dirigido a la razón por la cual a partir de una muestra con un pH extremadamente ácido como lo es 2,11, lograron aislarse un gran número de microorganismos en un medio con condiciones nutricionales especiales y un pH cercano a la neutralidad. Y el segundo, dirigido hacia la evaluación de la eficiencia de microorganismos acidófilos para degradar compuestos nitroaromáticos como los explosivos. Es probable que la diferencia existente entre la recuperación de la biomasa que se logró en las muestras con pH básico y ácido, no se deba necesariamente a la influencia del pH sobre la capacidad degradadora de los microorganismos, sino que es importante tener en cuenta que las muestras de pH básico fueron tomadas de zonas que con el objetivo de eliminar residuos del contaminante, habían sido sometidas a diversos tratamientos por los cuales podrían estar presentes algunas sustancias químicamente tóxicas, afectando directamente la carga microbiana de estos ambientes.

31   

Figura a 5: Diversid dad de colo onias obten nidas en T2 de la Muestra No 5

En cuanto a la Mue estra No 6, 6 que corresponde al bloque de produccto c comercial tomado t dirrectamente del tanque de transsporte, no se esperab ba e encontrar crecimiento c o. Sin emb bargo, a pa artir de estta muestra a se lograro on i identificar 14 1 morfolog gías diferen ntes (Tabla a No 8). Au unque el crrecimiento no n f fue tan ab bundante como c en la as Muestra as 1 y 2, hubo creciimiento y se s l lograron ide entificar má ás coloniass diferentess que a parttir de muesstras con alto i impacto químico como o la 10 y la 12. Por otra pa arte, en las Muestras 8 y 11, tom madas del ta anque de concentració c ón d de

tensoa activos

y

el

camp po

de

tra atamiento

por

fitorrremediació ón,

r respectivam mente, el crecimientto fue mu uy bajo; probablemente por la c concentrac ción de aluminio provveniente de e la PTAR y la conccentración de d c compuesto os tensoacttivos, los cuales c adem más de se er molécula as complejas d difíciles de degradar, tienen un efecto emu ulsionante, que puede e provocar la de los nutrrientes, hacciendo más difícil su assimilación. f floculación A partir de las Muesttras 4, 7 y 9 se obtuvvieron entre e 14 y 16 colonias co on a aparente potencial de egradador, cifra c muy próxima p a la a que se ob btuvo a parrtir d las primeras muesttras (Tabla 8). de

32   

6 Etapa III: 6.3 I Subculttivo y selec cción de colonias c En total se e seleccion naron a pa artir de lass 12 muestras, 165 colonias c qu ue p presentaro n morfolog gías apare entemente diferentess. Estas colonias se s s subcultivaro on en los tres medioss de cultivo o y se coloccaron en su uspensión en e T con con T2 ncentración n doble de TNT (100 0ppm), med dio que fue e elegido por p f favorecer la a degradacción del exp plosivo. Después del periodo de incubacción, todos los tubos eppendorf e e los que se en s s sembraron las colonia as presenta aron turbide ez y un color amarillo más intensso q el del medio de cultivo que c iniciial (Figura 6). Investig gaciones re ealizadas por p Nyanhongo o y col (200 08), mostra aron que essta coloraciión se pressenta cuand do s acumulan en el medio subproducto se os de la degradació ón como 2A Aminodinitr rotolueno y 4-Aminod dinitrotoluen no, los cuales son pro oducidos por p B Bacillus, Desulfovibrio o sp. (Kulka arni et al., 2007), Pse eudomonass sp. (Park et a 2002) y algunos consorcioss microbian al., nos de baccterias Gram Negativas ( (Kulkarni ett al., 2007)..

Figu ura 6: Subc cultivo en medio líqu uido corres spondiente e a T2.

33   

A Aunque la mayoría de d las colo onias que se sometie eron a este subcultivvo, l lograron re ecuperarse en T2, no todas pressentaron crecimiento c en T1 y T3. T Por este motivo, m se utilizó el crecimiento o en T1 como prime er criterio de d s selección nias de los cultivos que sería an evaluado os para elegirr las colon m mediante HPLC, H debido a que la presión selectiva a la que se e sometiero on e estos micro oorganismo os fue muccho más altta al increm mentar la concentració c ón d TNT. de L Las coloraciones de Gram que se realiza aron a los subcultivoss líquidos de d c colonias qu ue se analizzaron mediante HPLC C, revelaron n que en su mayoría, los m microorgan nismos capa aces de cre ecer en un medio de cultivo con n condiciones a altamente selectivas s c como las de d T1, son bacterias GN, G las cua ales son más r resistentes a conce entraciones altas de TNT y poseen una tasa de d d degradació ón mucho más m rápida que q la de bacterias b GP P (Zaripov et al., 2004 4).

F Figura 7: Coloracion C nes de Gram m de las colonias T1, T100, T54 4 y T137

34   

Finalmente tras diez días de incubación de los subcultivos, fueron seleccionadas 31 colonias, a las cuales les fue evaluada la capacidad degradadora de TNT, mediante la técnica de HPLC.

6.4 Etapa IV: Métodos Analíticos: HPLC Para evaluar la degradación de TNT por parte de las cepas seleccionadas, se realizó una curva patrón preliminar con una solución estándar de TNT de concentración conocida, que permitiera trazar un punto de comparación para determinar si la concentración del explosivo en los diferentes cultivos había disminuido o no (Cromatograma, Figura 8). Como se muestra en la Tabla No 9, no fue posible realizar una relación del área bajo la curva, con la concentración de explosivo, debido a que la curva, además de contener muy pocos puntos, no fue del todo precisa. La zona sombreada en las tablas que acompañan todos los cromatogramas, representa los datos correspondientes a TNT. Como es posible verlo en la Tabla No 9, el tiempo de  retención para el TNT fue de 5,9 minutos con un área correspondiente a 100ppm de aproximadamente 14678057,9 mm2. Adicional a esto, se analizaron dos controles diferentes que permitieron evaluar la presencia de TNT en el medio de cultivo T2 sin ser inoculado. El primer control, correspondió únicamente al medio de cultivo y arrojó un tiempo de retención para el TNT de 6,2 minutos (Cromatograma, Figura 9; Tabla No 10). El segundo control se analizó diez días después de introducir en el medio un palillo con los cuales se estaba inoculando cada muestra. Como se puede observar en el Cromatograma correspondiente a la figura 10 (Tabla no 11), es probable que el control se haya contaminado y la concentración de TNT haya disminuido, pues el área bajo la curva correspondiente al tiempo 6,2, que es proporcional a la concentración del

35   

explosivo, es diez veces más pequeña que la de los estándares, lo que sugiere que la concentración de TNT presente fue mucho menor a 100ppm.

/76.301

mAU 210nm,4nm (1.00) 400

350

300

250

200

150

0

2.0

/17.410

RT3.320/1.925

1.0

RT2.365/0.995

/1.661

50

/0.040 /0.049 /1.619

100

-50 0.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

12.0

Figura 8: Cromatograma Estándar 100ppm TNT

36   

13.0

14.0

min

Tabla 9: Cromatografía Curva de Calibración de TNT ABS 254 nm T. RETENCIÓN 1,307 1,631 1,755 2,358 3,371 5,954 9,197 1,331 1,765 2,348 5,949 0,162 0,523 0,797 2,138 2,549 3,406 1,463 1,765 2,318 4,183 5,914

ÁREA 12,5 ppm 33432,4 133276,8 225116,9 438400,4 65185,9 1728559,7 100731,7 25 ppm 21065,7 265919,5 947950,5 3421050,0 50 ppm 14685,5 1029,3 1809,8 2037,3 4070,1 64397,5 100 ppm 21826,7 62188,5 4221569,5 2284,6 14678057,9

37   

ALTURA 2159,3 12081,8 15220,5 16521,1 1824,7 21870,3 1307 1319,1 16862,5 32981,3 45787,6 2534 170 141,7 145,5 270,6 1899,4 1962,3 4901,7 207254 133,3 308678,2

/55.858

/24.798 /17.033

mAU 210nm,4nm (1.00) 325 300 275 250 225 200 175 150 125

0

/0.763

/0.315

25

/0.108

50

RT3.320/0.448

75

/0.220

RT2.365/0.457

100

-25 -50 0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.0

12.0

Figura 9: Cromatograma Control No 1

Tabla 10: Cromatografía Control No 1 ABS 254 nm T. RETENCIÓN 1,694 2,426 3,408 4,075 4,382 6,227

ÁREA 2839784,9 3458913,2 5395,8 20630,8 34827,2 7966096,8

38   

ALTURA 115919,4 318677,4 403 1239,7 1504,8 207288,9

13.0

14.0

min

RT2.365/1.968

/96.315

mAU 210nm,4nm (1.00) 350

300

250

200

150

/0.493

/0.179

/0.068

50

/0.978

100

0

-50

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

min

Figura 10: Cromatograma Control No 2

Tabla 11: Cromatografía Control No 2 ABS 254 nm T. RETENCIÓN 1,818 2,417 6,159 7,322 7,986

ÁREA 11441883,7 6378743,2 140842,1 366834,7 225687,2

ALTURA 1004096,7 363018,5 4185,1 9964,6 5188,2

El resultado para todas las cepas analizadas fue muy similar a los cromatogramas que se muestran a continuación, correspondientes a las cepas T1 y T100. Las curvas de mayor altura que aparecen en el extremo izquierdo de las gráficas (Figuras 11 y 12), antes del tiempo de retención del explosivo, corresponde quizás a la presencia de azúcares simples como glucosa, acetato, glicerol y citrato, los cuales fueron la fuente de carbono

39   

adicionada al medio y se caracterizan por tener tiempos de retención pequeños. Para los dos casos, la curva que corresponde al TNT (probablemente situada entre los tiempo 6-6,1) es mucho más pequeña que la del control No 1, el cual puede considerarse la concentración inicial de TNT en el medio, antes de ser inoculado. Las curvas que aparecen en el extremo derecho de los cromatogramas, mostrando tiempos de retención más altos, indican la presencia de compuestos menos polares que el TNT, pues la fase móvil utilizada fue metanol y éste al ser un compuesto polar, hace que los compuestos no polares, con los cuales no tiene afinidad, se demoren más en atravesarla y muestren un tiempo de retención más alto. Diversos estudios en los que han caracterizado el metabolismo de los microorganismos degradadores de TNT, se ha encontrado la producción de metabolitos menos polares como el 4-Amino-2,6-Dinitrotolueno, su isómero 2-Amino-4,6-Dinitrotolueno (Stenuit et al., 2006) y el Triainotolueno (TAT), el cual es producido junto con otros subproductos desconocidos, pero se resumen como la ruta más eficiente en la degradación del TNT (Kulkarni et al., 2007). El área bajo la curva correspondiente a la concentración de TNT presente en el medio disminuyó en todas las cepas analizadas. Aunque aparentemente, todas tienen un potencial degradador de TNT, para poder concluir esto con certeza es necesario hacer un seguimiento en intervalos de tiempo más cortos, para evaluar la reducción del compuesto en el medio. En vista que el control No 2 no pudo ser utilizado como un blanco de comparación por la presencia de contaminantes, podría evaluarse otro

40   

material diferente a la madera para inocular los medios de cultivo y así

/97.069

mAU 210nm,4nm (1.00)

400

350

RT2.365/1.879

eliminar una posible fuente de contaminación.

300

250

200

150

/0.010

0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

/0.003

/0.452

/0.443

/0.035

50

/0.021

/0.089

100

11.0

Figura 11: Cromatograma Cepa T1

Tabla 12: Cromatografía Cepa T1 ABS 254 nm T. RETENCIÓN 1,789 2,427 3,706 4,619 5,323 6,133 7,313 8,054

ÁREA 11971153,5 5137177,1 71319,2 27899,9 4478,1 2960,3 150230,8 187625,3

41   

ALTURA 932139,5 318568 4202,9 1403,1 205 130,4 4256,9 3853,2

12.0

min

/45.513 /5.441 RT2.066/10.834 RT2.365/8.546 RT2.365/25.756

mAU 210nm,4nm (1.00) 350

300

250

200

150

/1.538

/0.633

/0.039

/0.052

0

/0.099

50

/0.571 /0.979

100

-50 1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

Figura 12: Cromatograma Cepa T100

Tabla 13: Cromatografía Cepa No 100 ABS 254 nm T. RETENCIÓN 1,746 2,003 2,418 4,088 4,593 6,077 7,28

ÁREA 3479490 357736 3380758 16003,7 13040,4 167444,4 196788

42   

ALTURA 316794,9 46789 194810,4 1061,7 686,2 4817,9 5403,3

11.0

min

7. CONCLUSIONES ‐

Los sitios ubicados alrededor de la planta de cristalización de TNT, a partir de los cuales se tomaron sedimentos, fueron los ambientes a partir de los cuales se logró aislar un mayor número de microorganismos (colonias) potencialmente degradadores de TNT.

‐

La mayor variabilidad de morfotipos se obtuvo a partir del tratamiento 2, indicando la importancia de adicionar al medio una fuente de carbono, para favorecer la degradación.

‐

La mayoría de las cepas que presentaron potencial degradador de TNT son bacilos Gram negativos.

‐

La degradación de TNT por parte de los microorganismos aislados se comprobó mediante la técnica de HPLC, la cual permitió comprobar la disminución de la concentración de TNT presente en el medio y la aparición de otros metabolitos, posiblemente subproductos de la degradación del explosivo.

43   

8. RECOMENDACIONES ‐

Es necesario estandarizar la forma de adicionar el explosivo al medio de cultivo, de tal forma que resulte más fácil visualizar la degradación del compuesto y así realizar el seguimiento del metabolismo.

‐

Debido a que el control No 2 (Medio de cultivo + Palillo estéril) presentó contaminación, es importante probar materiales diferentes para realizar esta siembra, con el objetivo de eliminar una posible fuente de contaminación.

‐

Es necesario conseguir estándares de HPLC para diferentes subproductos del metabolismo de TNT como aminodinitrotolueno y triaminotolueno. Y evaluar cuál sería la mejor técnica para identificar estas sustancias.

‐

El aislamiento de microorganismos degradadores de TNT requiere la elaboración de pases sucesivos en medios de cultivo con explosivo, para eliminar trazas de compuestos orgánicos de fácil asimilación provenientes de la muestra, y ejercer una presión selectiva importante sobre los microorganismos no degradadores.

‐

La concentración de explosivo adicionada al medio de cultivo debe ser superior a 50 ppm, ya que bajo esta concentración no hay una presión selectiva importante sobre los microorganismos nativos.

44   

8. REFERENCIAS

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‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

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45   

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‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐

‐ ‐ ‐ ‐

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47   

ANEXOS ANEXO 1: Características macro y microscópicas de las colonias seleccionadas para el análisis mediante HPLC #

Origen

T4

Muestra 1

T9

Muestra 1

T17

Muestra 1

T12

Muestra 1

T21

Muestra 1

T24

Muestra 2

T27

Muestra 2

T39

Muestra 2

T40

Muestra 2

T42

Muestra 2

T43

Muestra 2

T50

Muestra 3

T52

Muestra 3

T58

Muestra 3

T62

Muestra 3

T63

Muestra 3

T64

Muestra 3

T65

Muestra 4

T68

Muestra 4

Caract. Macroscópicas Regular, mucosa, convexa color crema Irregular, cóncava, seca, color amarillo claro Circular, cóncava, bordes regulares y claros, color amarillo Irregular, cóncava, cremosa, color amarillo pálido con el centro más oscuro Irregular, cremosa, cóncava, color amarillo oscuro Regular, ovalada, plana, cremosa, amarillo pálido. Regular, cóncava, cremosa y blanca Irregular, cremosa, bordes dentados, cóncava, blanca. Regular, convexa, cremosa, amarillo pálido con centro oscuro. Irregular, plana, blanca con bordes oscuros. Regular, convexa, mucosa, amarilla pálida y centro oscuro. Irregular, convexa, cremosa y amarilla Regular, cóncava, cremosa color beige. Irregular, plana, cremosa de centro más oscuro. Irregular, convexa, cremosa, blanca con bordes oscuros. Regular, convexa, cremosa, opaca y de centro oscuro. Regular, cóncava, cremosa, amarillo pálido. Regular, cóncava, cremosa, beige de centro oscuro. Irregular, cremosa, plana y blanca

48   

Caract. Microscópicas BGN BGN BGN

BGN largos BGN y levaduras BGP BGP BGP BGP BGN BGN BGN cortos BGN delgados BGP BGN delgados y levaduras. BGN cortos BGN cortos y levaduras BGN cortos. BGN cortos.

#

Origen

T69

Muestra 4

T73

Muestra 4

T74

Muestra 4

T87

Muestra 5

T89

Muestra 5

T96

Muestra 5

T98

Muestra 5

T99

Muestra 6

T100

Muestra 6

T105

Muestra 6

T107

Muestra 6

T111

Muestra 6

Caract. Macroscópicas Circular, bordes irregulares, cremosa, convexa, blanca. Circular, regular, cóncava, cremosa, beige. Irregular, convexa, cremosa, blanca con centro oscuro. Irregular, seca, plana, opaca, transparente. Circular, convexa, cremosa, brillante, color crema. Regular, cóncava, cremosa, blanca. Circular, convexa, cremosa, amarillo pálido con centro oscuro. Regular, plana, cremosa, opaca, blanca Irregular, convexa, brillante, cremosa, blanca Circular, regular, convexa, cremosa y brillante Circular, cóncava, cremosa, blanca Regular, convexa, cremosa, brillante, blanca, traslúcida.

49   

Caract. Microscópicas BGN cortos. BGN cortos y levaduras. BGP y BGN cortos BGN cortos BGN BGN BGN y BGP CGP y BGN BGN BGP BGP BGP