VII Congreso SEAE Zaragoza 2006

Nº 43

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEL SUELO CON PROPIEDADES ÚTILES EN FRUTICULTURA ECOLÓGICA P. A. García Galavís, C. Santamaría Linaza, J.C. Ruíz Porras, S. Naranjo Durán y A. Daza Ortega C.I.F.A. “Las Torres-Tomejil”, IFAPA, CICE, Junta de Andalucía. Apdo. Oficial, 41200 Alcalá del Río (Sevilla). E-mail: [email protected]

RESUMEN La fruticultura ecológica constituye una apuesta agroambiental y comercial de interés creciente. Los microorganismos asociados a las raíces de los diferentes patrones usados en fruticultura están escasamente analizados. En este estudio se describe el aislamiento, a partir de plantas cultivadas en manejo ecológico y en manejo convencional, de la microbiota bacteriana presente en la rizosfera y la rizoplana de los siguientes portainjertos: Nemaguard, GF 677, Garnem, Mariana 2624 y Mariana GF 81. Las bacterias más abundantes se han analizado in vitro para detectar tres funciones potencialmente beneficiosas para las plantas: solubilización de fósforo, producción de sideróforos e inhibición de Agrobacterium tumefaciens, bacteria productora de tumores vegetales. Se ha determinado que la rizosfera y rizoplana de los 5 portainjertos contienen cada una aproximadamente 1-5 x107 u.f.c./gramo de raíz seca. Se ha observado que aproximadamente el 50 y el 30% de las bacterias aisladas fueron capaces de solubilizar fósforo y de producir sideróforos, respectivamente, y alrededor de un 10% ejerció algún grado de inhibición de A. tumefaciens en condiciones in vitro. Algunas bacterias que han mostrado actividad in vitro se han ensayado en presencia de la planta y se han seleccionado las que podrían presentar interés aplicado. En concreto, se dispone de una serie de bacterias que han incrementado la asimilación de hierro por el portainjerto Nemaguard, altamente sensible a la clorosis férrica. Palabras clave: patrones de frutales, bacterias rizosféricas, solubilización de fósforo, sideróforos, biocontrol. INTRODUCCIÓN La diversidad y actividad de los microorganismos del suelo son fundamentales para la fertilidad, el funcionamiento equilibrado y la estabilidad de los agrosistemas. Más concretamente, algunos microorganismos asociados a las raíces presentan características que pueden ser beneficiosas para las plantas y tener una aplicación como inoculantes biológicos respetuosa con el medio natural siendo, por tanto, muy interesantes en un contexto de agricultura ecológica, bien sea como biofertilizantes o como agentes de biocontrol (Barea, 1998). El fósforo se encuentra en muchos suelos precipitado en forma insoluble, no disponible para la planta. Existen microorganismos rizosféricos (PhosphateSolubilizing Bacteria) que solubilizan estos precipitados dejándolos disponibles para su absorción (Rodríguez y Fraga, 1999) y produciendo una mejora en los cultivos (Zaidi et al., 2003). A pesar de la presencia de hierro en el suelo, en numerosas ocasiones, las elevadas concentraciones de carbonato cálcico bloquean su uso por la planta, aunque no su absorción, provocando una carencia fisiológica (clorosis férrica). Determinados microorganismos rizosféricos tienen la capacidad de sintetizar compuestos de bajo

VII Congreso SEAE Zaragoza 2006

Nº 43

peso molecular con gran afinidad por el hierro, sideróforos, que secuestran dicho metal del suelo y lo hacen asimilable para la planta (Wang et al., 1993). Agrobacterium tumefaciens es una bacteria del suelo que provoca tumores vegetales en numerosos patrones de frutales (De Cleene y De Ley, 1976). El único mecanismo eficaz de control existente es el empleo del antagonista bacteriano Agrobacterium radiobacter K-84 (López et al., 1989), pero al tratarse de dos especies taxonómicamente próximas, y además hallarse los genes de patogenicidad y bioconcotrol codificados en elementos plasmídicos extracomosómicos, se dan con frecuencia procesos de transferencia genética que invalidan la eficacia de este sistema de control biológico. En consecuencia, es interesante desarrollar sistemas alternativos a K-84 para el control de A. tumefaciens, y que puedan emplearse sin riesgos en los sistemas de producción ecológica. Los frutales de hueso son socioeconómicamente importantes en los sectores agrarios español y andaluz. La microbiota asociada a los diferentes patrones usados en fruticultura está escasamente analizada. En este estudio se describe el aislamiento, a partir de raíces de plantas cultivadas en manejo ecológico y en manejo convencional, de la microbiota bacteriana presente en la rizosfera y la rizoplana de los siguientes portainjertos: Nemaguard, GF 677, Garnem (GXN 15), Mariana 2624 y Mariana GF 81. Las bacterias más abundantes se han analizado in vitro para detectar estas tres funciones potencialmente beneficiosas para las plantas: solubilización de fósforo, producción de sideróforos e inhibición de A. tumefaciens.Con algunas de las bacterias que han mostrado una respuesta positiva se han realizado inoculaciones en plantas con la finalidad de seleccionar las que presenten interés en estas condiciones naturales. MATERIALES Y MÉTODOS En la finca experimental del CIFA “Las Torres”, que presenta un suelo de tipo franco, se plantaron en febrero de 2004 dos parcelas (una en suelo sometido a manejo ecológico desde 1998 y otra en manejo convencional) con 60 ejemplares de cada uno de los portainjertos de frutales siguientes: Mariana GF 8-1, Mariana 2624, Nemaguard, INRA GF 677 y Garnem (Garfi x Nemared 15). En otoño de ese año se arrancaron 9 árboles de cada patrón y tratamiento y se aislaron los microorganismos asociados a la raíz. Las fracciones bacterianas correspondientes a la rizosfera y la rizoplana se aislaron según describen Ellis et al. (2003). Las bacterias más abundantes en ambas fracciones (que se encuentran aprox. a una concentración de 106 ufc/g de suelo) se han analizado para detectar tres actividades beneficiosas para las plantas. En total se han analizado 810 bacterias; el número correspondiente a cada actividad, patrón, zona de la raíz y tipo de manejo del suelo se indica en los Cuadros específicos. Las bacterias capaces de solubilizar fósforo se han aislado en medio PVK, que contiene fosfato tricálcico (Pikovskaya, 1948). La detección de microorganismos productores de sideróforos se ha llevado a cabo en medio CAS (Alexander y Zuberer, 1993). La realización de bioensayos para el aislamiento de bacterias capaces de inhibir el crecimiento de Agrobacterium tumefaciens se realizó según describen López et al. (1989). Para analizar si algunas de las bacterias que producen sideróforos son capaces de incrementar la asimilación de hierro por la planta, se han inoculado plantas de aproximadamente 2 meses germinadas de hueso del melocotonero Nemaguard, portainjerto conocido por su sensibilidad a la clorosis férrica. Se han utilizado macetas de 1l conteniendo como sustrato una mezcla de vermiculita y perlita (2:1, v/v). Se han realizado doce tratamientos con 12 plantas cada uno: diez aislamientos bacterianosy dos controles sin bacterias, uno con hierro poco asimilable y otro con quelato de hierro. Las inoculaciones bacterianas se realizaron sumergiendo las raíces en el

VII Congreso SEAE Zaragoza 2006

Nº 43

momento del trasplante durante unos segundos en los respectivos cultivos bacterianos diluidos a 108 ufc/ml y, además, la bacteria se incorporó también al sustrato mediante una solución acuosa conteniendo 3x107 ufc/ml (200 ml/maceta). Las solución nutritiva de riego fue (g/L): 0,4 g de nitrato amónico, 0,3 g de nitrato potásico, 0,2 g de fosfato monopotásico y 0,01 g de citrato de hierro(III). Esta solución se aplicó a los diez tratamientos bacterianos y al control con hierro no asimilable. La solución aplicada al tratamiento con hierro asimilable fue similar pero contuvo el hierro en forma de quelato (0,025 g/l de Sequestrene). La dosis de riego fue de 150-200 ml /planta, una o dos veces semanales, según evapotranspiración. Las plantas se mantuvieron en invernadero durante todo el ensayo. Aproximadamente a mitad del ensayo se realizó una reinoculación bacteriana (aprox. 3x109 bacterias por planta y maceta). El ensayo se levantó a los 105 días y se determinaron los parámetros siguientes: pesos secos de las partes aérea y radical, número de ramificaciones del tallo y longitud total del mismo, colorimetría de la hoja y determinación de clorofila. Las coordenadas L, a y b de color fueron analizadas con un colorímetro Minolta CR 300. La determinación de clorofila se realizó según Arnon (1949), extrayendo dos discos de hojas recién arrancadas (tres hojas por planta) con un sacabocados de 9 mm de diámetro. Los discos se introducen en un tubo de ensayo con 5 ml de metanol y se dejan en oscuridad a temperatura ambiente (aprox. a 25 ºC) durante 24 horas. Se mide la absorbancia en un espectrofotómetro a las longitudes de 645 y 663 nm. Clorofila a = (12,72 x A663)-(2,58 x A645). Clorofila b = (22,87 x A645)-(4,67 x A663). Clorofila a+b = (8,02 x A663)-(20,20 x A645). Las unidades se dan en μg de clorofila/ mg de materia seca. Los análisis estadísticos de la varianza (ANOVA) y el test SNK de comparación de medias (p