American Journal of Infection Control Evaluación de las bacterias contaminantes que se encuentran en las toallas de papel sin usar y posible post-contaminación después de lavarse las manos: un estudio piloto Autores: •

Louis McCusky Gendron BSc Centre de Recherche de l’Institut Universitaire de Cardiologie et de Pneumologie de Québec, Quebec City, Quebec, Canada Département de Biochimie, de Microbiologie et de Bioinformatique, Faculté des Sciences et de Génie, Université Laval, Pavillon Alexandre-Vachon, Quebec City, Quebec, Canada

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Luc Trudel Bsc Département de Biochimie, de Microbiologie et de Bioinformatique, Faculté des Sciences et de Génie, Université Laval, Pavillon Alexandre-Vachon, Quebec City, Quebec, Canada

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Sylvain Moineau PhD Département de Biochimie, de Microbiologie et de Bioinformatique, Faculté des Sciences et de Génie, Université Laval, Pavillon Alexandre-Vachon, Quebec City, Quebec, Canada Groupe de Recherche en Ecologie Buccale (GREB) and Félix d’Hérelle Reference Center for Bacterial Viruses, Faculté de Médecine Dentaire, Université Laval, Pavillon de Médecine Dentaire, Quebec City, Quebec, Canada

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Caroline Duchaine PhD Centre de Recherche de l’Institut Universitaire de Cardiologie et de Pneumologie de Québec, Quebec City, Quebec, Canada Département de Biochimie, de Microbiologie et de Bioinformatique, Faculté des Sciences et de Génie, Université Laval, Pavillon Alexandre-Vachon, Quebec City, Quebec, Canada

Antecedentes: La contaminación bacteriana es una preocupación en la industria de la pulpa y el papel. No sólo la maquinaria está contaminada, sino también puede estarlo el producto de papel final. La transmisión bacteriana de toallas de papel sin usar a las manos y las superficies no está bien documentada. Métodos: Se determinó la existencia de una comunidad de bacterias cultivables en 6 diferentes marcas de toallas de papel no utilizadas mediante los métodos de cultivo y mediante la secuenciación del ADN ribosomal 16S de bacterias contaminantes. A continuación, se investigaron las posibles transmisiones de contacto en el aire y de manera directa de estas bacterias contaminantes durante el secado de manos después del lavado. Resultados: Fueron aisladas de las diferentes marcas de papel no utilizadas entre 102 y 105 unidades formadoras de colonias de bacterias (UFC) por gramo de papel. Las bacterias que pertenecen al género Bacillus fueron ampliamente los microorganismos más abundantes encontrados (83,0%), seguido por Paenibacillus (15,6%), Exiguobacterium (1,6%), y Clostridium dificile (0,01%). Las toallas de papel hechas de fibras recicladas albergaban entre 100 - 1.000 veces más bacterias que las fabricadas con pulpa de madera virgen. Se

observó que las bacterias se transfieren fácilmente a los guantes de nitrilo desechables que fueron utilizados para secarse con toallas de papel. Sin embargo, no se observó evidencia de transmisión de bacterias durante el dispensado de toallas de papel. Conclusión: Este estudio piloto demostró que una gran comunidad de bacterias cultivables, incluidos los productores de toxinas, se puede aislar de las toallas de papel no utilizadas y pueden ser transferidas a los individuos después de lavarse las manos. Esto puede tener implicancias en algunos entornos industriales y clínicos, así como en individuos inmunocomprometidos.

Las toallas de papel están hechas de materias primas y recicladas que contienen celulosa, lignina y otros nutrientes adecuados para el crecimiento de microbios presentes en el entorno de la fabricación de papel. Las bacterias se aíslan con frecuencia de las fábricas de papel y cartón en todo el mundo, incluida la India 1, Canadá2, Estados Unidos3, Nueva Zelanda4, Finlandia5-8, Francia8, Alemania8 y España7-8. Se han aislado de las máquinas las cepas de los géneros Aeromonas, Bacillus, Enterobacter, Microbacterium, Pseudomonas, Staphylococcus2-9. Estas bacterias probablemente contribuyen a la formación de una biopelícula y, por lo tanto, disminuye la eficiencia de la producción por causar corrosión y defectos en las máquinas 10. Las principales fuentes de contaminación microbiológica en este tipo de fábricas son: el agua reciclada, la materia prima utilizada, las piezas de las maquinas y el ambiente de la fábrica 11. Las temperaturas extremas en los molinos secadores probablemente matan a la mayoría, si no es a todas, de las células microbianas, pero algunas esporas resistentes al calor probablemente sobreviven y, en consecuencia, contaminan la maquinaria, así como el producto de papel terminado. Estudios previos establecieron que los principales contaminantes microbianos en productos de papel pertenecen a los géneros Bacillus y Paenibacillus 8-12-13. De hecho, las esporas de Bacillus, debido a su alta resistencia a una amplia gama de agentes químicos y físicos14, pueden sobrevivir a los diversos procedimientos en el proceso de fabricación de papel. Vale la pena mencionar que también se detectaron especies de Bacillus productoras de toxinas perjudiciales en las fábricas de papel6. Recientemente, algunos de los autores de este estudio han supervisado un experimento de lavado de manos en un laboratorio de estudiantes de microbiología. Se encontró que todos los estudiantes que se habían lavado las manos con agua, jabón regular o jabón antibacteriano tenían más bacterias en sus manos después del lavado que antes. La única excepción era en estudiantes que habían usado una solución sanitizante de manos a base de alcohol como un proceso de desinfección. Los estudiantes con más bacterias en sus manos se habían secado con toallas de papel, mientras que los estudiantes que utilizaron la solución a base de alcohol se frotaron las manos hasta que se secaron. Este experimento sugiere que se necesitan más investigaciones para comprobar la posible transmisión de bacterias a través de las toallas de papel en el lavado de manos. Por lo tanto, los objetivos de este estudio fueron determinar la extensión de la contaminación bacteriana de las distintas marcas de toallas de papel, así como aislar e identificar la comunidad de bacterias presente en estos productos comerciales. También se investigó la posible transmisión por contacto en el aire y de forma directa de estos contaminantes bacterianos durante la dispensación de papel y después de lavarse las manos, respectivamente.

Tabla 1 Especificaciones del papel de prueba y concentraciones de bacterias cultivables que se encontraron en estos papeles. Papel de prueba

Fabricante

A

1

B

2

C

1

D

1

E

3

F

4

Dimensiones por hoja (cm x cm)

Masa por hoja (±0,1 g)

UFC/g *

100% fibras recicladas sin blanquear

25.8 x 23.3

2.2

4.4 ± 0.2 x 105

Múltiples pliegues, 100% fibras recicladas, sin blanquear ¼ de pliegue, 100% fibras recicladas, sin blanquear

24.0 x 23.5

1.9

8.6 ± 1.4 x 104

33.0 x 30.7

2.1

3.1 ± 0.6 x 104

Un solo pliegue, 100% fibras recicladas y blanqueadas con H2O2 Rollo no perforado 60% fibra reciclada, blanqueado con H2O2

25.5 x 23.8

2.1

1.1 ± 0.1 x 105

22.3 x 19.3*

1.5

1.3 ± 0.3 x 103

28.0 x 15.4

1.9

1.2 ± 0.1 x 102

Tipo

Rollo perforado , 100% pulpa de madera virgen, blanqueado con cloro

*UFC/ gr.: Unidades formadoras de colonias por gramo.

MATERIAL Y MÉTODOS Toallas de papel de prueba Seis marcas de toallas de papel (designados de la A a la F), disponibles comercialmente en Canadá, se pusieron a prueba para comprobar la carga y la diversidad bacteriana. Las especificaciones para cada marca se encuentran en la Tabla 1. Los papeles reactivos A, B y C fueron hechos con 100% fibra reciclada sin ningún proceso de blanqueado. Estas 3 marcas difieren en la forma en que fueron plegadas: (A) un solo pliegue, (B) múltiples pliegues (C) un cuarto de pliegue. El papel de prueba (D) fue una sola toalla de papel doblada hecha de 100% fibra reciclada blanqueada con peróxido de hidrógeno (H2O2). El papel de Prueba E era un rollo de toalla de papel blanqueado con H2O2 hecho con 60% fibra reciclada y 40% pulpa de madera virgen. El papel de prueba F fue hecho de 100% pulpa de madera virgen y fue blanqueado con Cloro. Las marcas de toallas de papel de A a E estaban envueltas en fundas de papel grueso con las extremidades de hojas expuestas al ambiente, y la marca de papel F estaba completamente envuelta en plástico. Enumeración de bacterias Las muestras se prepararon siguiendo una versión modificada de un protocolo aquí

no descripto15 y bajo un gabinete de seguridad biológica de nivel II. En primer lugar, se seleccionaron 10 g, aproximadamente 5 hojas de papel (ver tabla 1), del papel de prueba deseado en el centro de la pila, se transfirió con una pinza estéril a una licuadora con jarra de vidrio estéril (Modelo BL10450H ; Black & Decker , New Britain , CT) conteniendo 500 ml de agua destilada con 0,025% de Tween 20 y fue licuado durante 30 segundos. La mezcla se volvió a dejar en reposo durante 60 minutos antes de agitarla nuevamente durante 30 segundos. Luego, se extendieron diluciones seriadas de la suspensión sobre placas de agar de soja tríptico (TSA) (Becton, Dickinson and Company , Sparks, MD) . TSA ha sido utilizado previamente para aislar un gran número de especies bacterianas en las máquinas de papel y cartón16-17. Un conjunto de placas se incubó en condiciones aerobias y los duplicados se incubaron en un sistema anaeróbico (modelo 1025; Thermo Forma, Marietta, OH) usando una mezcla de gas de dióxido de carbono (5%), hidrógeno (10%) y equilibrado con nitrógeno a 25ºC. Después de 48 horas de incubación, las unidades formadoras de colonias (UFC) se contaron en cada placa para determinar la carga bacteriana cultivable en cada marca de papel de prueba. A continuación las placas fueron incubadas nuevamente por 5 días más para confirmar la diferenciación de las colonias. Una o dos colonias de cada morfología fueron recogidas y se volvieron a sembrar en placas de TSA y se volvieron a incubar a 25ºC para una mayor caracterización. Toda la experimentación se hizo dos veces para cada marca de toallas de papel (n = 2 ; 5 toallas por marca por prueba). Caracterización genotípica La amplificación del gen de ARN ribosómico 16S de las colonias aisladas seleccionadas se realizó utilizando la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). En pocas palabras, una sola colonia se transfirió a una mezcla de 50 μl de PCR que contenia GoTaq PCR Bufer, 0,5 μmol de cebadores universales 63 de avance y 1387 de reversa18, 200 μmol dNTP, 3 mmol de MgCl 2 , 1,25 U de Promega GoTaq polimerasa (Fisher Scientific , Ottawa , ON, Canadá). Todas las reacciones de PCR se realizaron con un termociclador de ADN DYAD motor (Bio Rad, Mississauga, ON, Canadá) como se describe19: 1 ciclo a 94ºC durante 5 minutos, luego 30 ciclos de 94ºC durante 60 segundos, 55ºC durante 60 segundos, y 72°C durante 90 segundos. Y para terminar un paso de elongación final a 72ºC. Los productos de PCR fueron secuenciados en la plataforma genómica del Centro Hospitalario de la Universidad Laval utilizando un aparato ABI Prism 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Cada secuencia de ADN se comparó con secuencias disponibles en la base de datos del Banco de Genes (GenBank) del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) usando el análisis BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). La asociación de los microorganismos aislados a géneros o a especies de bacterias conocidas se estableció sobre la base de similitud de secuencias. Transferencia de bacterias desde la toalla de papal a las manos Bajo un gabinete de seguridad biológica de nivel II, las manos de un trabajador de laboratorio con guantes de nitrilo desechables se rociaron con una solución de etanol al 70%. A continuación, las manos se frotaron durante 15 segundos y se secaron al aire durante 3 minutos. Las manos fueron sumergidas en agua destilada estéril durante 15 segundos antes de usar 3 hojas de toalla de papel B, una hoja por vez, para secarse las manos. Por último, se estimó la contaminación bacteriana en los guantes de nitrilo como se describe a continuación20. Brevemente, el centro de la palma de la mano izquierda, así como el segundo, tercer y cuarto dedo se muestrearon usando 25 cm 2 de placas de agar de

contacto que contienen TSA. La superficie de contacto en las palmas fue de 25 cm 2 y de 10 cm2 para cada uno de los tres dedos. Las muestras de control fueron generadas mediante el uso de un nuevo par de guantes de nitrilo desechables y el mismo proceso de lavado descripto anteriormente, reemplazando sólo la etapa de secado con toallas de papel por secado al aire durante 3 minutos. Después de 48 horas de incubación aeróbica a 25ºC, se encontraron unidades formadoras de bacterias. Muestreo de aerosoles Se recogieron muestras de aerosoles en un laboratorio de investigación junto a un dispenser de toallas de papel genérico que contiene papel de prueba B. Un impactador de 6 pasos Andersen (Andersen Instruments Inc, de Atlanta, GA) 21 cargado con cajas de Petri que contenían un medio de TSA y anfotericina (5 mg ml) fue colocado a una distancia de 30 cm desde el dispenser y aproximadamente a 20 cm por debajo de la primera hoja de papel que sale desde el dispenser. El impactador se conectó a una bomba de alto volumen (Gast Manufacturing Inc , Benton Harbor , MI) a una velocidad de flujo de 28.3 L/min. El caudal de la bomba se calibró con un DryCal DC-2 calibrador de flujo primario (Bios International Corporation , Butler , NJ). Durante un período de muestreo de 5 minutos, 25 hojas de papel fueron sacados desde el dispenser a razón de 5 hojas por minuto. Cada hoja fue arrugada en las manos del investigador mientras usaba guantes de nitrilo desechables. Las manos del investigador se colocaron junto al dispenser aproximadamente a la misma altura y a la misma distancia de la muestra. Para controlar el experimento, en un periodo de 5 minutos se realizó un muestreo en el que el protocolo mencionado anteriormente era duplicado con la excepción de sacar toallas de papel. Las placas fueron incubadas a 25ºC durante 48 horas en condiciones aeróbicas. Análisis estadístico Se utilizó la prueba t de Estudiantes en Microsoft Excel (Microsoft Corp, Redmond, WA) para analizar los datos experimentales. Los recuentos bacterianos de cada marca probada fueron convertidos a logaritmos de base 10, y las medias se compararon entre si para verificar las diferencias. Un valor de P