BlOMEDlCA Vol. 1, No. 4

- 1981

REVISIONES

ANTIGENOS EMPLEADOS EN LAS PRUEBAS INMUNODIAGNOSTICAS PARA DETECTAR ANTICUERPOS DE MALARIA

La serología en malaria se emplea de rutina para: 1) evaluar las áreas maláricas en estudios epidemiológicos: 2) confirmar por laboratorio los casos sospechosos en los cuales no se ha podido definir un diagnóstico por el estudio de la gota gruesa y extendidos de sangre periférica, y 3) el control de potenciales donantes de sangre. Históricamente, en cada una de estas variables. las pruebas se han aplicado para detectar o estimar los anticuerpos maláricos que, cuando están presentes, se encuentran con frecuencia en relativos bajos nive1es;por lo tanto, en el desarrollo de pruebas serológicas para malaria se ha hecho énfasis en el hallazgo de técnicas de alta sensibilidad, minimizando la atención puesta a la especificidad de las reacciones antígenoanticuerpo. La siguiente revisión no incluye la evaluación de prueba alguna y se restringe a considerar las preparaciones antigénicas

J e f e , M a l a r i a Vacccne P r o g r a n . M a r v l a n d 2 0 8 1 3 U: S . A .

empleadas como reactivos en la defección de anticuerpos antimaláricos. La especificidad alcanzada en cualquiera de las pruebas es función principal de los antígenos seleccionados y por ello. la discusión se centra en la factibilidad y aplicabilidad de las preparaciones antigénicas utilizadas en cada una de ellas. Las pruebas en sí mismas han sido discutidas recientemente por Voller y Houba (1)y descritas detalladamente en el memorando de WHO, "Serological Testing in Malaria" (2). No se incluyen discusiones sobre nuevas estrategias serológicas para detectar parásitos, antígenos circulantes ni complejos inmunes en la sangre. 1.

Técnicas de Anticuerpos por Fluorescencia Indirecta [IFAJ:

Debido a que esta prueba emplea como antígeno el parásito intracelular, es actualmente la más especie-específica dentro de las que seleccionan como antígeno al pará-

Inimiii,oparasifolopy H r n r i c h . N a v a l M e d i c a l R e \ e a r c h I i i , t i t u t r .

I I o e s , M a l a r i a V a c c i l i r P r o g r a m . [ r n r n u n o p a r a r i t o l ~ ~ tyl r a n r l i . N a v a l M e d i c t i l K r , r a r c h I i i ~ r i t i i l c . t l r t l i r s d a . M a r y l ñ n d 2 0 8 1 4 U . S. A . + e s

B i ó l o g a , M a l a r i a V a c c i n e P r o g r a m . I r n r n u i i o p a r a a i t o l o g y Br;,iicli. N a v a l M r d i i a l K e \ i ~ r c l il i ~ r t i t u t r . t l c l h e r d a . M a r y l a i i d 2 0 8 14 U . S . h .

""

l e f e d e la U n i d a d d c I n i i i u n o l o g í a d e h l a l a i i a . i ; i i i p o d e M i c r o h i o l o g i a . I i i i f i t i i i o N;ictondl d e S u l i i i l . Boeoti. Colonihin.

N O T A : Este trabajo fue auspiciado por el "Naval Medical Research and Development Cornmand, Work Unit No. M F 58.524.009.0095". Las aseveraciones y opiniones aquí expresadas son privativas de los autores y no deben considerarse como oficiales o reflejo de los puntos de vista del "U. S. Navy Department" o del Servicio Naval en general.

ANTIGENOS EMPLEADOS E N L A S PRUEBAS INMUNODIAGNOSTICAS PARA DETECTAR

sito homólogo. La técnica de IFA es considerada por lo general como el patrón de comparación cuando se valoran otras pruebas (3). El antígeno es colocado en forma de extendido o gota gruesa de sangre perasitada rica en esquizontes. el cual es el estadío más reactivo del paresito. La sangre infectada obtenida de un paciente con Plasrnodium falciparum requiere de un periódo corto de incubación a partir de la sangría para alcanzar la maduración, por cuanto en la sangre periférica sólo circulan trofozoitos jóvenes (anillos). Una de las fuentes obvias de paresitos para la preparación del antígeno es entonces un individuo infectado con las formas sanguíneas circulantes de una especia apropiada de Plasmodium. No obstante, esta fuente representa un serio problema para los laboratorios localizados en áreas de baja endemicidad por cuanto requiere del acceso a pacientes clínicamente enfermos. Como fuente sustitutiva pueden emplearse primates del género Aotus trivirgotus infectados con una cepa adaptada de cada una de las especies del parásito; sin embargo. los Aotus son demasiado costosos y difíciles de conseguir. Por otra parte, los cultivos in vitro de estadíos eritrocíticos del parásito, constituyen una atractiva fuente alterna para los laboratorios que no tienen acceso a infecciones activas (4). Desafortunadamente. el desarrollo de este sistema está restringido en el presente al P. falciparum, aun cuando existe un informe preliminar sobre el cultivo de P. vivax (5).

En ausencia de una fuente conveniente de parásitos humanos. estos se han sustituído con algún éxito por parásitos de simios estrechamente relacionados. Como ejemplos de este tipo de sustitución estan P. fieldi o P. cynomolgi bastianelli. para P. falciparum (7, 8): P. brasilianum o P. fieldi, para P. malariae (7) y P. cynomolgi para P. vivox (9). Recientemente se ha sugerido (10) la sustitución de P. falciparum por P. berghei parásito del ratón, pera esta elección puede ser cuestionable en razón de las considerables diferencias que pueden presentarse en los antígenos de estas dos diferentes especies. No obstante como se ha demostrado en pacientes con múltiples infecciones previas (7). por los datos de tasas de transmisión en malaria (11)y por estudios de evaluación de la sensibilidad de la prueba IFA (12). la sustitución del antígeno homólogo por un heterólogo provee una información valedera auncuando existe una disminución de la especificidad de especie y de la sensibilidad de la prueba. Además, el empleo de antígenos heterólogos en estudios seroepidemiológicos puede causar dificultades en la interpretación, cuando en un brea malarica esta presente más de una especie del parásito.

Con la prueba IFA pueden ocurrir reacciones cruzadas, necesitándose múltiples evaluaciones con preparaciones de cada especie del parásito para definir la especificidad de la reacción. Para reducir estas pruebas múltiples se ha empleado la preparación de un antígeno único. producto de una mezcla de células infectadas con El mantenimiento del cultivo in vitro del P. especies diferentes del parásito (13). falciparum y la producción continua de formas maduras del parásito es un procediEn resumen. la principal ventaja de la miento sencillo pero laborioso y en ocasiones prueba IFA radica en la especificidad de costoso, limitando su utilización a laborato- especie y sensibilidad, ya que se emplea rios especializados de investigación. como antígeno al parásito intraeritrocítico Además. no pueden ignorarse las posibilida- intacto. Este tipo de antígeno proporciona des de cambios antigénicos en los parásitos los puntos de enlace naturales para inducir mantenidos en cultivos por largos periódos los anticuerpos, lo cual lo hace superior a los de tiempo. Langreth y sus colaboradores ( 6 ) antígenos preparados con extractos solubles demostraron como algunas cepas manteni- crudos. das en cultivo por tiempo prolongado perdían Desde el punto de vista técnico. la gradualmente el antígeno "knob", presente en las membranas de los glóbulos rojos principal dificultad de la prueba reside en la infectados con trofozoitos maduros o seg- obtención de una fuente adecuada de antígeno. Tal dificultad puede obviarse, en el mentos de Plasmodium falciparum.

R. L. BEAUOOIN. J. M. RAMSEY. N. D. PACHECO.

caso de P. falciporum, estableciendo una unidad central que produzca el antígeno a partir del cultivo in vitro. para distribuirlo a los laboratorios que no cuenten con un sistema apropiado. Las láminas portaobjeto con las preparaciones de sangre parasitada, puedensecarse al aire y almacenarse durante varias semanas a temperatura ambiente con un desecante, facilitando así su transporte (2). También pueden congelarse y mantenerse almacenados hasta por 12 meses a -70°C (121. Para otras especies diferentes al P. falciparum es imperioso contar con una unidad que tenga acceso a los Aotus, para producir antígeno con destino a los laboratorios dedicados al trabajo de serología en malaria. La centralización de la producción de estas especies es una medida importante para la conservación de los primates, mientras se desarrollan los métodos de cultivo adecuados.

C. A. ESPINA1

dad o la especificidad de la prueba. lo que a su vez puede influir en su reproductibilidad. Por esta razón se deben preparar grandes lotes de antígeno que se almacenan liofilizados (191. Debido a que se requieren muy pocas cantidades de antígeno cuando la prueba se lleva a cabo en placas de microaglutinación, un lote de eritrocitos sensibilizados es suficiente, por lo general. para cubrir incluso amplios estudios seroepidemiológicos (20). Sin embargo, en algunos estudios longitudinales de larga duración, como el llevado a cabo durante diez años por Armstrong en Etiopia (211, se han encontrado fallas en la reproducibilidad. debidas a las diferencias de reactividad entre las distintas preparaciones antigénicas. No obstante. hay que resaltar que la relativa poca cantidad de material que se requiere por prueba y la posibilidad de preparar y almacenar grandes lotes. reducen la necesidad de contar con un acceso regular a sangres infectadas para preparar el antígeno, como es el caso de la prueba IFA.

uso de cultivos eritrocíticos del P. falciparum y los métodos más eficientes de separación y aislamiento de parásitos (22. En esta prueba la preparación antigénica 231, podrán incrementar la uniformidad consiste en eritrocitos adsorbidos con ex- antigenica con el consecuente aumento en la tractos solubles, crudos, de malaria. sensibilidad y especificidad de la prueba. No ha sido investigado convenientemente el La prueba es relativamente sencilla de impacto que produzca sobre la especificidad aplicar aún en condiciones de campo. pero de especie el empleo de antígenos heterólolos procedimientos para preparar elantígeno gos para la prueba IHA. En los estudios seroy para adsorber los eritrocitos portadores epidemiológicos la prueba IHA produce con son complicados y solo pueden ser realizados frecuencia resultados falsos negativos en por laboratorios experimentados. Los deta- población infantil y en niños menores infeclles para estos procedimientos han sido tados, incluso cuando sus sueros reaccionan descritos amplia y adecuadamente (14. 15, a altos títulos con la prueba IFA (26). En un r e .o, LO, 1 1 , LO,. esfuerzo para aclarar las razones de tal discrepancia. Bidwell y sus colaboradores Debe anotarse, sin embargo, que la fuente (291, empleando el sistema Plosrnodium de los eritrocitos portadores [cordero u folciparum-Aotus, demostraron que el antíhombre "O"), la manera como ellos son geno soluble en la prueba IHA falló en la tratados (temperatura y tiempo de almace- detección de los anticuerpos inducidos namiento, tamizado y método de fijación], las h r a n t e la parasitemia. Si estos anticuerpos especies de Plasmodium [P. knowlesi, P. desarrollados durante la fase inicial de la vivax o P. folciporuml, la fuente de las infección fuepon ciertamente detectados por células infectadas (mono u hombre), asi la prueba IFA, es probable que los antígenos como el método de extracción del antígeno empleados en las dos pruebas reaccionen soluble, pueden afectar. todos. la sensibili- con diferentes anticuerpos. 2.

Técnica de Hemaglutinación Indirecta VHAJ

.

ANTIGENOS EMPLEADOS EN LAS PRUEBAS lNMUNOOlAGNOSTlCAS PARA DETECTAR

El empleo de antígenos homólogos, su paración de antígenos específicos de meropurificación y la estandarización de los zoitos requiere excesivas manipulaciones de reactivos deben elevar, en forma ponderable, los cultivos, lo cual puede complicar consila calidad de la prueba IHA y la interpreta- derablemente esta tarea. Aún más, es posible que este sistema, por su misma ción de los datos obtenidos en ella. naturaleza, reduzca la sensibilidad de la Tecnicos Inmunoenzimóticos: ELISA técnica por que restringe el antígeno reactivo Fnzyme-linked immunosorbent Assay) solo a aquellos exo-antígenos liberados por un solo estadío del parásito, en una infección Auncuando la mayoría de los reactivos sincrónica. basicos que se requieren para la prueba se consiguen en el comercio, el antígeno debe Técnicas de Difusión en Gel (GDT) ser preparado localmente. Brevemente, éste se obtiene preparando un extracto soluble Los antígenos empleados en las pruebas de una sangre altamente infectada. Se de precipitinas para la serología en malaria. sonica la sangre infectada y luego de centri- son de origen humano y consisten en dos fugarla se retira el sobrenadante, rico en tipos principales: 1) antígenos placentarios. antígeno, para con él cubrir los tubos de también utilizados en la IFA, obtenidos por polipropileno o las placas de microtitulación lo general en el momento del parto a partir (30, 31). La fuente de células parasitadas de placentas altamente parasitadas, (34). puede ser un animal infectado (Aotus para 2) antígenos solubles, que circulan libreP. falciporum y Rhesus para P. knowlesi) o mente en la sangre de personas altamente cultivos in vitro para P. folciporum (32). No infectadas (35). se ha estudiado adecuadamente la especificidad de especie que tiene la prueba ELISA El antígeno placentario, rico en parásitos pero es de esperar que las preparaciones del maduros, se prepara como un filtrado del antígeno soluble crudo no tengan mayor extracto acuoso, crudo. de placentas maceespecificidad que la encontrada en la radas. Por otra parte. el gran número de prueba IHA. Por otra parte. los procedimien- antígenos solubles que se encuentran libres tos para la preparación del antígeno y para en el plasma se pueden catalogar claramenel cubrimiento de los tubos o las microplacas te en 3 grupos principales: Los antígenos son menos complicados que los de la prueba "L", que son termolábiles, destruyendose a IHA y por lo tanto están sujetos a menos 56°C; los antígenos "R", que son termoresisvariaciones. Los lotes del antígeno para tentes, resisten temperaturas de 56°C pero ELISA pueden prepararse y almacenarse en se destruyen a 100°C y los antígenos "S". alícuotas a -70°C. para su posterior empleo que son completamente termoestables, no en el tamizado de los tubos o las placas. siendo destruidos a 100°C.Cada uno de estos Tanto el ELISA como la técnica IHA requie- grupos puede a su vez subdividirse; han sido ren míniyas cantidades de antígeno, espe- identificados cuando menos 20 antígenos cialmente- cuando se emplean las micro- "S" serológicamente diferentes (35). placas. Como los antígenos requeridos para la Ambroise Thomas y sus colaboradores aplicación de la prueba de difusión en gel se (33), demostraron que los exo-antígenos obtienen de individuos altamente infectados. solubles presentes en el sobrenadante de en el momento actual su uso está restringido cultivos de seis horas de merozoitos de a los laboratorios que tienen acceso a P. folciporum, pueden ser empleados para población con infecciones clínicas. Aún más, preparar las placas para la prueba de estos antígenos sólo son empleados para ELISA e incluso, que se puede aumentar la detectar infecciones por P. falciporum. especificidad cuando se emplean para Cuando se emplean antígenos solubles detectar las infecciones por esta especie; sin embargo, no se ha determinado la posibilidad plasmáticos, se agrava el problema de un de emplear estos exo-antígenos en estudios posible exceso de especificidad en la reacepidemiológicos. Debe anotarse que la pre- ción. No todos los antíaenos se encuentran a

R. L. BEAUOOIN.

J. M. RAMSEY. N. D. PACHECO. C.

un mismo tiempo y al parecer pueden presentarse seriadamente según el periódo de la infección. con inducción de anticuerpos de poca afinidad. Por lo tanto, en la actualidad parece improbable el que se puedan vencer todas las dificultades en la estandarización para establecer el empleo de la prueba en forma general y rutinaria. No obstante, los antígenos "S" podrían usarse para serotipificar las infecciones Dor P. folci~arumen diferentes localidadesA (36). La comunicación de que pueden obtenerse antigenos solubles de P. falciporum, en Aotus infectados (37), hace preveer que se tenga una fuente alterna más conveniente. Sin embargo. esta alternativa de emplear los Aotus para la obtención de antígenos continuará siendo un problema por largo tiempo, dado su costo y dificultad de consecución, como fue enfáticamente discutido el tratar la prueba IFA. El aislamiento de exo-antígenos solubles, detectables por la prueba de ELISA y producidos por cultivo de parásitos (33), sugiere que puede ser viable la producción in vitro de los antígenos empleados en las pruebas de precipitación, como la GDT y por lo tanto merecen un estudio más amplio.

A. ESPINA1

genos se preparan como extracto soluble de sangre parasitada y están sujetos a las mismas ventajas y desventajas discutidas para la prueba de ELISA. Como es de esperar, la sensibilidad es alta, pero su especificidad, que depende de la pureza del antígeno, no es mayor que la obtenida con ELISA. Otros Pruebas Han sido descritas otras pruebas para detectar anticuerpos contra los parásitos de la malaria; por ejemplo, la aglutinación de células infectadas por esquizontes, asi como una variedad de pruebas de crecimiento in vitro e inhibición de la reinvasión. Estas fueron desarrolladas para satisfacer requisitos experimentales específicos y no han sido adaptados aún para llenar las necesidades comunes en aplicaciones seroepidemiológicas o sero-diagnósticas. En su estado actual no son aplicables o son impracticables para un trabajo serológico de rutina. DISCUSIONES Y CONCLUSIONES

Técnicos de Radioinmunoensoyo (RIA)

Los antígenos empleados en las pruebas serológicas para detectar los anticuerpos inducidos por los parásitos de la malaria, se agrupan en dos amplias categorías: 1) parásitos intactos y 2) extractos solubles preparados, bien de homogeneizados de parásitos o bien de productos (exoantígenos), liberados por el parásito. en el curso de una infección o cultivo. Las mayores fuentes para la preparación de estos antígenos están en los humanos o en los primates no humanos infectados con las apropiadas especies humanas del parásito. La factibilidad de los cultivos de P. falciparum y más recientemente de P. vivax están reduciendo considerablemente la dependencia de las infecciones activas en mamíferos, con el fin de proveer los antígenos necesarios para las pruebas serológicas.

Las pruebas RIA no han sido empleadas hasta ahora para fines sero-epidemiológicos o sero-diagnósticos, sin embargo, se han comunicado resultados sobre los métodos indirectos, empleando antígenos de malaria adsorbidos en eritrocitos de cordero (391, o en placas de microtitulación (40). Los antí-

Es incuestionable que el primer requisito que debe cumplir una prueba serológica para detectar los anticuerpos en un individuo infectado por parásitos de la malaria es su sensibilidad. porque estos anticuerpos se presentan a menudo en relativos bajos niveles. dentro de la población de individuos

Los antígenos placentarios empleados en la prueba GDT pueden prepararse en relativos grandes lotes y son fácilmente almacenables en estado de liofilización (3, 4). También los antígenos solubles "S" son muy estables (38) y fácilmente se congelan y almacenan indefinidamente a -70°C. Las pruebas de precipitación, son considerablemente menos sensibles que las otras pruebas tratadas. La GDT requiere. por otra parte. soluciones de reactivos más concentrados para obtener el punto final de reacción. Esta prueba es prácticamente descartable por la limitación en los recursos de antígeno y antisueros.

ANTIGENOS EMPLUOOS EN LAS PRUEBAS INMUNOOIAGNOSTICAS PARA DETECTAR....

sometidos a estudio. Por otra parte, la especificidad reviste considerable importancia, ya que es ampliamente reconocido que los parásitos de la malaria comparten antígenos con otros agentes infecciosos (V.g. espiroquetas) y. más importante aún entre ellos mismos. Hay cuatro especies diferentes del parásto responsables de la enfermedad clínica en el hombre que requieren de una identificación específica. Como la especificidad de cualquier prueba serológica para detectar anticuerpos no puede ser mayor que la del antígeno usado. se hace imperativo extremar los cuidados para su selección, procesamiento y estandarización. Dentro de las preparaciones antigénicas de uso más corriente. están los eritrocitos intactos parasitados, empleados para la prueba de fluorescencia indirecta, los que pueden dar un alto grado de especificidad de especie con los parásitos humanos homólogos. De igual manera, la identificación de especies por cualquiera de los métodos serológicos no puede hacerse si se e m ~ l e a n antígenos beterólogos derivados de un par&sito de simio. Por otra parte. podría emplearse una prueba con reactivos como los de los antígenos "S", que poseen una alta especificidad en su reactividad. pero cuya aplicación generalizada tiene severas limitaciones.

Es indudable que la clave para incrementar la sensibilidad y la especificidad en las pruebas serológicas para detectar anticuerpos de la malaria, depende de la selección de antígenos mejor definidos. más altamente purificados y mejor estandarizados. AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan su agradecimiento a la señorita Betty Leckey por su asesoría editorial en la preparación del trabajo.

l. v o l l e r A and Houba V. M a l a r i a . l n : p r a c t i c a 1 m e t h o d r i n c l i n i c a l immu,ogy. v o . 2, l m m u n o l o g i c i n v e r t i g a t i o n of t r o p i c a l p a r a s i t i c diseaser, ~ d i n b u r s h u.K.. C h u r c h i l l LiYing$tOn, CO. Ed. 1 9 .

2. w o r l d H e a l t h 0 r g a n i z a t i o n . s e r o i o g i c a l t e r t i n g i n m a l a r i a . B v l l e t i n of the W a r l d H e a l t h Organizatlon, 1974; 5 0 : 527. 3. spencer H c et al. he e n z y m e l i n k e d i m m u n o s o r b e n t asLay ( E L I S A I t o r m a l a r i a . E l . Comparison w i t h the m a l a r i a i n d i r e c f f l u o r e r c e n t a n t i b o d y ter, ( $ F A , . A m e r i ~ can J o u r n a l o1 T r o p i c a l ~ e d i c i n eand Hygiene, I P I P ~ ; 28: 931. d . H a l l CH et al. C v l t u r e d P l a r m o d i u m t a l c i p a r u m " r e d a s antigen i n a m a l a r i a i n d l r e c f fluorescent a n t i b a d y test. A m e r i c a n J o v r n a l o1 T r o p i c a l M e d i c i n e and Hygiene, 1 9 7 8 ; 27: 849.

5.

La factibilidad de un sistema para producir P. folciparum en cultivos de eritrocitos, provee una fuente de antígenos específicos para esta especie, al igual que la reciente comunicación preliminar sobre el éxito en el cultivo de P. vivax 151. . .. Darece brindar una adecuada fuente de suministro de este parásito para las pruebas serológicas en el futuro. Deben favorecerse los intentos de cultivar P. maloriae y P. ovale. Una vez identificada una adecuada fuente de par$&tos in vitro, aúnla incognita de su purificación. En un amplio sentido. la purificación incluye el aislamiento del parásito, libre de antígenos extraños v- s e ~ a r a d o por estedíos de evolución (22). A

La purificación química de los antígenos específicos. incluida la identificación de los puntos de enlace con sus anticuerpos. parece ser más los sistemas disponibles. como el uso de 10s anticuerpos monoclonales (41).

LarrDYy G ef a1.A p r o p o r d e I'obtenfion p o r r u l t u r e i n v i f r o de f o r m e s i n t r a e r y t h r o c y t a i r e r de P l a r m o d i u m v i v a x . c o m p t e r R e n d u r d e r seances d e ~ ' ~ c a d e m di es Sciencer Serie 111: Sciencer de l a Vie. 1981; 2 9 2 : 9 2 9 .

6. L a n g r e t h S G e l a l . P l a r m o d i u m f a l c i p a r v m : ~ o r r o kf n o b r on the i n f e c l e d e r y t h i o c y t e r u r f a c e a f f e r i o g - t e r m c u l t i v a t i o n . E x p e r i m e n t a l ~ a r a r i t o l o g y , 1979; 4 8 : 211. 7. COIII w~ESe l al. F l u a r e r c e n t a n t i b o d y r f u d i e r in n v m a n

m a l a r i a 1V. C r o s ~ r e e " i o n 3 between h u m n a n d " m i a n m a l a r i a . A m e r i c a n ~ o u r n a lo1 T r o p i c a l M e d i c i n e n a d

1966; 8.

:

,,.

K u v i n S F and vol le^ A. M a l a r i a 1 a n t i b o d y t i t r e s of west A W i ~ a n s .BrnISh M e d i c a l JOvrnal, 1963; 2 : 477.

9. Tobie J E et al. F l u o r e s c e n t a n t i b o d y r t u o i e s on croar r e a c t i o n s aetween human

in

voiunteers. n m e r i c a n J o v r n a i of T r o p i c a l M e d i c i n e and

uygiene, 1962;

11

: 289

10. ~ i e wr n a n a P i e k a r r k i ~ . Z u r r e r o d i a g n o r t i k d e rm a l a r i a .

plasm,diYm bergnei P.falciparum alsantigen fur d e n indireckten immunot~uorerzenz-terf. lmmunitat und ~ ~ f ~ k1979; t i 7~ : 7~s . 11. D r a p e r C C and V o l l e r A. Theepidemiolcgicsl i n t e r p r e t a -

,ion

rerologic

T,OP~C~I M

~

data

malaria.

~and ~ Hcw i e~n eI. 1 ~ 7 2 .2 1 : 696.

of

R. L. BEAUDOIN. J. M. RAMSEY. N. D. PACHECO. C. A. ESPINAL 1 2 . SUIZer A J et a l .

test for An evaluafion of a f h i c k r m e a r

lndirecf tluorercentantibady

p a i d 5 i t i c diceases. Y .

21. ~ a t h e w H s ~ e t a l .he indirecf n e m a g g l u t i n a t i o n

malaria.

Evaluation

of

entigens

tert t o r

orepared

trom

d n t i g e n i n t h e I F A test for m a l a r i a anfibodier. A m e r i c a n

Plarmadium falciparum and P i a r m o d i u m v i v a x . A m e r i .

JOurnal o f T r o p i c a l M e d i c i n e a n d HyDiene. 1 9 6 9 ; 18

c a n ~ a u r n a lo'

'

IPP.

~ r a p i c a !~ e d i c i n ea n d

Hygiene.

1975;

24 : 4 1 7 .

13. S U I Z ~ TA J e t a l . A m u l t i - r p e c i e s m a l a r i a antigen f o r u s e i n

!he i n d i r e c t f l u o r e r c e n t a n f i b a d y ~ o y a l Saciety

af

ter,. T r a n s a c t i o n i o, , h e

~ r o p i c a i ~ e d i c i n e and

28.

~ygiene.

1 7 7 3 , 67 : 5 5 .

c o r t i i l e b r o g g e r R e l al. c h a n g i n g p a t t e r n r in l h e h u m o r a l i m m u n e r e i p o n r e to m a l a r i a b e f o r e . d u r i n g a n d a f t e r t h e a p p l i c a t i o n of c o n t r o l m e a r u r e r . a l o n g i t u d i n a l r t u d y i n w e ~ f ~ f r i c a nr a v a n n a .

11. Delowi12

R

S

and

Stein

B

A

A

tanned

red

celi

~ u l t e f i n of

!he

world

Healtn

O r g a n i z a t i o n . 1978; S6 : 5 7 9 .

haemagglutinatioo tert, using Plarmodium berghei antigeo a n d h o m o l o g o u r a n t i r e r a .

Roya1

of

5oriety

Transactionr

~ r o p i c a i ~ e d i c i n e and

0'

,he

2 9 . B i d w e l l D et a l . A p p l i c a t i o n o ? i n d i r e c f n e m a g g l u t i n a t i o n

tests for m a l a r i a V I . c o m p a r i r o n a f i n d i r e c t h e m a g g l v t i ~

~ygiene.

n a t i o n a n d i m m u n o f l u o r e s c e n c e t e r f r f o t m a l a r i a anfibody in Plarmodium falciparum infected owl m o n k e y r . W H O /

1962; 5 6 : 217. 1 5 . W e l l d e B T e f a l . A n i n d i r e c f h e m a g g l u t i n a t i o n test f o r

m a l a r i a u r i n g a n d a n f i g e n f r o m the

M A L 1914; 7 1 : 82d.

lyrate a f p a r a s i t i z e d

e r y t h r o c y t e r . ~ i l i t a r y~ e d i c i n e .1967; 134

1 0 . v o i l e r ~e t a l . ~ e w r e r a l o g i c afl e r f f o r m a l a r i a a n t i b o i d i e r .

izad.

B r i f i r h M e d i c a l J o u r n a l 1975; 1 : 659.

l b . K a g a n L G E v a l v a t i o o of the i n d i r e c t h e m a g g l u l i n a t i o n t e s t a s a " e p i d e m i a l o g i c technique o, m a l a r i a A m e r i c a " A m e r i c a " J o u r n a l o f Troyiical M e d i c i n e a n d Hygiene. 1977; 21 : 683. 17. N e u w i r r e n J H T et a l . Sfudier

on v a r i o u r a r p e r t r of fhe

i n d i r e c t h e m a g g l u t i n a t i a n t e r t for m a l a r i a WOrld H e a l t h O r g a n i i a f i o n , 1912; 4 6 : 7 7 1 .

31. Volter

A

et

al.

Enzyme immunoarrays

diseases. T r a n s a c t i o n r

Of

tor

pararific

the R o y a l Society o f T r o p i c a l

M e d i c i n e a n d Hygiene, 1976; 10 : 98. 3 2 . spencer H

B u l l e t i n of the

c

et a l .

assay (ELISAI

,O(

he e n z y m e l i n k e d i m m u n o r o r b e n l

m a l a r i a . l. the " r e a, in v i t r o c u l t u r e d

~ l a i m o d i u mf a l c i p a r u m

ar a n f i g e n . e m e r i c a n J o u r n a l o f

T r o p i c a l M e d i c i n e a n d H y g i e n e . 1 9 7 9 ; 28 : 7 2 7 . 18. M a t h e w r

H M et a l . A r e r o e p i d e m i o l o g i c a l r t u d y of m a l a r i a i n t h e r e p u b l i c of !he P h i > i p p i n e r b y t h e i n d i r e c t 33. ~ m b r o i s e~ h o m a sP e t a l . M i r e en e n v i d e n c e . p a r u n e hemagglutination t e r t ~ m e r i c a n ~ourna~of~pidemiology. micromefhode immunoenzymologique IELISAl. ,970; 92 ' 376. d'antitenes m e t a b o l i q u e r P r a d v i t r i n v i t r o p a r P l a r m o d i u m

19. N e u w i s l e n J

H

E and Leeuwenberg A

T r a n ~ a c t i O n Sof t h e R o y a l Saciety o f T r o p i c a l M e d i c i n e a n d Hygiene. 1 7 7 2 ; 66

.

f a l c i p a r u m en c u l t u r e . W H O / M A L 1981: 8 1

D M . lndirecf

h e m o g g ~ u t i n a t i o nles! for m a l a r i a w i t n iyopnilized c e t ~ r .

3 4 . ~ c ~ r e g I oA re t a l . ~ e m o r t r a t i o n o f c i r c u l a f i n g a n f i b o d i e r t.

666.

~ l a r m o d i u mf a l c i p a r u m i n f e c t i o n r i n m a n

Tranractianr

Of ,he Roya1 society o, T r o p i c a l M e d i c i n e a n d Hygiene. 1775; 69 : 413.

E v a l u a f i o n o , ,he reru1ts o , a" i n d i r e c f h e m a g g l u t i n a f i o n t e r t tor m a l a r i a in a n E t h i o p i a n POpUiatiOn. P r o c e e d i n g r a f f h e H e l m i n t h o l o g i c a i SOciety o + Washington. 1 9 7 2 ; 39 : 541.

36. w i i r o n R i M . ~ e t h o d for r the biological characterization

K r e f e r J P . T h e irolafion and f r a r t i o n a f i o n af m a l a r i a n t e c t e d i e l i r . Bullefin of +he World Health Organizatian, 1977; 5 1 : 311.

31.

21. A r m r f r a n g J C

H e i d r i c h H G et a l . F r e e - f i o w e l e c f r o p h o r e r i r isolation of intracelular Parasiles ( P l a r m o d i u m falciparum from

c u t u r e . S e p a r a t o n of t h e t r e e p a r a r i f e r a c c o r d i n g to

ot malaria p a r a r i f e r : cnaracferizafion of P l a r m o d i u m f a I c i p a r v m w i t h L a n d S - a n t i g e o r , W H O / M A L 1981; 937 : 1 .

ROgeri

w

A ~r e t a l . A

fe31

for

J and v o l l e r A. A

c o m p a r i r o n ot

malaria1

38. w i i s o n R J M et al.

The r t a b i l i t v a n d f r a c t i o n a t i o n ot

malaria, antigenr from

me

blVods 01 ~ f r i c a n si n f e c l e d

w i f h ~ i a r m o d i u mf a l c i p a r u m . l n t e r n a t i o n a l J o u r n a l f o r

p i a r m o d i a l t r a c t i o n r M i l i t a r y M e d i c i n e . 19666: 131 : l l d l .

ggiutination

R

w i t h ~ l a r m o d i u mf a l c i p a r v m . P a r a r i t o l a g v . 1972; 6 4 : 191.

ParaiiIOIOgy. 1973; 3 : 5 1 1 .

2 4 MahDney D F e l a l . T h e p r e p a r a t i o n a n d I e r o l o g i r a c t i v i t y 01

wilson

a n f i g e n r f r o m h u m a n a n d A o t u r m a n k e y r blaod i n f e c l e d

s f a g e r . J o u r n a I of P a r a r i t o l o g y , l i n ~ r e S r 1 .1981.

25

b y gel-diffurion lechniques.

35. W i l l o n R J et a l . O c c u r r e n c e 01 S a n t i g e n s i n s e r u m in

m a l a r i a . I n f e c t i O n a n d l m m u n i t y . 1 9 7 3 ; 7 : 680.

23

PlaLmOdium f a l c i p a r u m

N a l Y r e . 1966; 210 : 1384.

20. F a r r n y D C a n d K a g a n I G . U s e o , r f a b i e renritired celtr in a " i m p r o v e d i n d i r e C f m i c r o h e m a g g l u t i n a t i a n ter, t o r

22.

930~

3 9 . s f u z D R et a l . E r t i m a f i o n of a n t i m a l a r i a l a n f i b o d y b y r d d i o i m m u n o a r r a y . J a u r n a l o f P a r a r i t o l o g y . 1 9 7 4 ; 6 0 . 539.

modified. indirect m i c r o n e m a ~

maiaria.

American

T r o p i c a l M e d i c i n e a n d Hygiene. 1968; 11

'

Journal

ot

do

voiler A ,ion$

H E T e f a l . A p p l i c a t i o n o + the n d i r e c f haema991utination tert f o t m a l a r i a r e p r o d u c i b i l i t y w i t h

26. Meuwisren J

P l a r m o d i u m f a l c i p a r u m s c n i i f i ~ e dc e l l r . ~ u l l e t i nof the W O r l d H e a l t h O r g a n i z a t i o n . ,973: 4 9 : 3 1 7 .

el al

A c o m p a r a s o n of i r o t o p i c a n d e n l y m e

i m m u n o a r r a y r far tropical parasitic d i s e a r e s . ~ r a n r a c ~

804.

o, ,he

Roya,

Hygiene, 1977; 71

41.

~ e r r i nL

n et

Sociefy

o,

Tropical

Medicine

and

431.

ai. antisenic characterization o l plarmadia

using m o n o ~ l o n dal n t i b o d i e r . W H O / M A L 1981; 918 : l .