Aplicación de las técnicas moleculares para el manejo de cultivos de microalgas y gestión de áreas costeras

¿Por qué cultivar Microalgas?  Actividad escasamente desarrollada pero con un potencial económico muy grande.  Actividad de bajo impacto ambiental (no compite por suelo fértil).  Se puede asociar a actividades medioambientales (biofiltración de aguas residuales, de hidroponía, de gases de combustión, etc.).  Aspectos legales.

Sistemas Abiertos

Sistemas Cerrados

¿Cómo se cultivan las Microalgas?

Laboratorio

Centrifugado

Escalado

Atomizado

Raceways (250L, 10.000L,…)

Biomasa (seca, fresca)

¿Cómo aplicar la Biología Molecular?

ANTES

DURANTE

DESPUÉS

Laboratorio

Cultivos

Producto final

En el laboratorio (antes de cultivar a gran escala) Detección de especies de interés en muestras de campo 3xs

Muestras

Cepas puras

3xs Semanas, Meses

C- C+

PCR especifica

Secuenciación

Secuenciación

En el laboratorio (antes de cultivar a gran escala) Identificación y/o confirmación de especies que se adquirieran Especies mal identificadas: Colecciones, artículos, base de datos

Identificación sólo hasta “sp.”: Muchas especies del mismo género 1 especie produce la sustancia de interés (ej. Dunaliella sp., Nannochloropsis sp.)

Taxonomía tradicional: Caracteres fisiológicos y morfológicos.

? Taxonomia tradicional

Ingeniería genética Fuentes naturales agotadas (ej. Taxol) Bastante desarrollado en bacterias, hongos, levaduras

Microalgas: biofactorías unicelulares Tipo de proteína

Función

Aplicación

Anticuerpo

Actividad contra la glicoproteína D del virus herpes simple

Anticuerpos monoclonales

Anticuerpo derivado del IgG1

Actividad contra el antígeno PA83 del ántrax

Anticuerpos monoclonales

Toxina B del cólera

Vacuna oral contra Staphylococcus aureus

Vacuna oral

Factor necrosis tumoral

Tratamiento del cáncer

Terapéutico

Suero bovino amiloide asociado a las glándulas mamarias

Estimulación de la producción de mucina en el intestino para inmunizar a recién nacidos

Terapéutico

Descarboxilasa de ácido glutámico humana 65

Diagnóstico temprano de la diabetes tipo I

Terapéutico

Factor de crecimiento endotelial vascular humano

Tratamiento del enfisema pulmonar y de la disfunción eréctil; antidepresivo

Terapéutico

Proteína B1 del grupo de alta movilidad

Curación de heridas mediante la activación de células endoteliales

Terapéutico

Chlamydomonas reinhardtii: gama completa de herramientas moleculares para la manipulación genética

Gran capacidad para acumular biomasa (64.000L/4 semanas) (XXX-12h) Manipulación genética (6-8 semanas) Proteínas, biodiesel, pigmentos, …

Organismo Bacterias Levaduras Células de insectos Células de mamíferos Animales Células de plantas Plantas Microalgas

Costo de producción Bajo Medio Alto Alto Alto Bajo Muy bajo

Tiempo de producción Corto Medio Medio Largo Muy largo Corto Largo

Capacidad de escalamiento Alto Alto Medio Muy bajo Bajo Alto Muy alto

Calidad del producto Bajo Medio Alto Muy alto Muy alto Alto Alto

Riesgo de Contaminación Endotoxinas Bajo Alto Virus-Priones Virus-Priones Bajo Bajo

Muy bajo

Corto

Muy alto

Alto

Bajo

Rivera Solís et al. 2011. La microalga verde Chlamydomonas reinhardtii: nueva alternativa para la producción de proteínas recombinantes de interés médico. Ciencia, (oct-nov):1-9

En los cultivos Identificación (Bacterias, Diatomeas, Dinoflagelados, Cianobacterias) PCR especificas (genero, especie…), Secuenciación (SSU, ITS, rbcL, …) Contaminantes en microalgas comerciales (raceways abiertos) Más frecuentes en verano Identificar especie: Prever toxicidad. Tomar medidas para evitar la contaminación.

Secuenciación

Especie a identificar

Extracción ADN PCR Secuenciación

Identificación

Identificación de toxinas en los cultivos de microalgas

PCR (vs HPLC, ELISA, otros ensayos….) Identificar los genes que producen toxinas: Microcistinas (mcyA, mcyB, mcyC, mcyD, mcyE, mcyG) Cilindrospermopsina

Extracción ADN PCR Gene a identificar

PCR convencional PCR a tiempo real

Furukawa K. J. of Bioscience and Bioengineering, (2006) 102 (2): 90-96; Ouahid Y. Environ Toxicol , (2005) 20:235-243; Fergursson KM, Saint CP. Environ Toxicol, (2003) 18(2):120-5.

Aspectos legales Estudios impacto ambiental (ej. ¿Si la especie a cultivar existe en Canarias?) Lista de especies Marinas de Canarias (Algas, Hongos, Plantas y Animales). Gobierno de Canarias. 2003 Estudios antes 2002. (microorganismos: Bacterias, Dinoflagelados y Cianobacterias) Reino Plantae: sólo División Magnoliophyta No está contemplado División Chlorophyta: Tetraselmis, Dunaliella Taxonomía puede haber cambiado. No detectar no significa que no exista.

PCR especifica para detectar la especie del cultivo en el entorno cercano marino. PCR/secuenciación de las especies presentes en los cultivo de microalgas.

Producto Final: Trazabilidad (Chlorella)

Productos comerciales (tabletas y capsulas) Muestras de biomasa comercial

Secuenciación del 18S rDNA

Otras especies (Scenedesmus, Parachlorella,…) Diferentes especies de Chlorella (C. vulgaris, C. sorokiniana,…) Görs et al. (2010). Quality analysis of commercial Chlorella products used as dietary supplement in human nutrition. J Appl Phycol, 22:265–276

Casos Prácticos (Planta Piloto ITC)

#1

#2

?

?

Casos Prácticos (Planta Piloto ITC) Secuenciación del 18S rDNA, ITS BLAST (Basic Local Alignment Search Tool): http://www.ncbi.nlm.nih.gov Árbol filogenético

Chlamydomonas oligothermica Nannochloropsis salina isolate D12 Nannochloropsis salina strain MBIC10063 Nannochloropsis gaditana

Cepa problema Nannochloropsis limnetica strain SAG 18.99 Nannochloropsis granulata strain MBIC10054 Nannochloropsis oceanica strain MBIC10090 Nannochloropsis maritima Nannochloropsis oceanica strain LAMB0001

Casos Prácticos (Planta Piloto ITC)

Isochrysis galbana

Nannochloropsis gaditana

GRACIAS