Aportaciones del laboratorio en el diagnóstico y el tratamiento del paciente intoxicado.

Dpto. Toxicología y Legislación Sanitaria, Fac. Medicina Universidad Complutense de Madrid

Dra. Ana María López Parra

Esquema •

Introducción.

•

Muestras.

•

Envasado, conservación y almacenamiento.

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Análisis químico-toxicológico.

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Métodos de extracción.

•

Detección e identificación del tóxico: técnicas espectrofotométricas técnicas cromatográficas técnicas inmunoquímicas

Introducción La investigación toxicológica es el conjunto de procesos analíticos que tienen por objeto el aislamiento, identificación y determinación cuantitativa de los tóxicos, tanto en el vivo como en el cadáver, con el fin de permitir el diagnóstico de la intoxicación.

Muestras • • • • • •

Contenido gástrico Sangre Orina Pelo Saliva Meconio

Muestras Contenido gástrico -Vómito, aspirado gástrico y lavados estomacales. -En el caso de los lavados estomacales, primer lavado. -Un volumen de aproximadamente 20 ml. -Puede ser necesario procedimientos de homogenización, filtración y/o centrifugación. -No representa grado de intoxicación.

Muestras Sangre -Es una de las muestras más útiles para la identificación y especialmente para el análisis cuantitativo. -La sangre total y el plasma son las muestras más representativas. -Recoger la muestra en tubos con heparina o EDTA como anticoagulante. -Si se sospecha de intoxicación con etanol, utilizar fluoruro sódico como conservante. Y la extracción deberá efectuarse desinfectando la zona con cloruro mercúrico.

Muestras Orina -Ensayos preliminares en el screening de tóxicos. -Para drogas de abuso. -La concentración de un tóxico puede llegar a ser 100 veces mayor que en la sangre. -Se debe de tomar antes del tratamiento. -Como mínimo 50 ml.

Muestras Pelo -Tóxicos minerales -Detección de drogas de abuso. -Refleja el estado promedio de los elementos minerales del organismo durante su crecimiento.

Muestras Saliva. -Correlación de los análisis séricos con drogas de abuso y psicofármacos. Drager DrugCheck™ Kit Meconio. -Meconio: líquido amniótico, moco, lanugo, bilis y células que se han desprendido de la piel y del tracto intestinal. -Identificación de drogas durante la gestación.

Muestras Hígado

-Niveles de tóxicos superiores a los de la sangre. -Especialmente útil cuando no se puede disponer de sangre. -Evitar contaminación por bilis. -Evitar añadir conservantes.

Envasado y conservación • Tapones PTFE (polytetrafluoroethylene) • Conservantes: – Azida sódica (0,1%, p/v) – Fluoruro sódico (1%, p/v) • Anticoagulante: - Heparina - EDTA - Oxalato potásico (0,5%, p/v).

Almacenamiento Factores que intervienen: Luz

Temperatura

Hidrólisis

Oxidación

Descomposición biológica

Análisis químico-toxicológico • 1. Separación o extracción del tóxico de la muestra. • 2. Detección e identificación del tóxico. • 3. Cuantificación.

Métodos de extracción Finalidad: Aislamiento y purificación del tóxico Concentración del tóxico en el extracto obtenido Parte de la muestra se reserva íntegra

Desde el punto de vista analítico los tóxicos se dividen en: – – – –

Tóxicos volátiles Tóxicos gaseosos Tóxicos orgánicos fijos o extraíbles Tóxicos inorgánicos o minerales

Métodos de extracción de tóxicos volátiles

• Aquellos que se volatilizan por debajo de los 100ºC, por lo cual son arrastrados por el vapor de agua cuando ésta destila (alcohol etílico, alcohol metílico, benceno, fenoles, ...).

Métodos de extracción de tóxicos volátiles Las técnicas son: -Destilación simple. -Destilación fraccionada. -Destilación directa al vacío. -Destilación por arrastre en corriente de vapor. -Microdifusión. -Técnica de “espacio de cabeza” ("head space" ).

Destilación simple

Muestra problema

Tóxico volátil extraído

Destilación fraccionada

Separación según puntos de ebullición

Microdifusión Análisis

Muestra

Acetaldehído

3 ml de sangre 5 ml de tejido 3 ml de sangre 5 ml de tejido 1 ml de sangre

Acetona Monóxido de carbono Cianuro Etanol

Formaldehído Hidrocarburos halogenados Isopropanol

Camara de Conway

Metanol Fenoles Sulfuro

2-4 ml de sangre 5 ml de tejido 0,8 ml de sangre 4 ml de tejido 3 ml de sangre 5 ml de tejido 1-4 ml de sangre 1-4 ml de tejido 2 ml de sangre 5 ml de tejido 2 ml de sangre 5 ml de tejido 2-4 ml de sangre 5 ml de tejido 2-4 ml de sangre 5 ml de tejido

Agente liberador 3-4 gotas de SO4H2 al 10% 3-4 gotas de SO4H2 al 10% 1 ml de SO4H2 al 10% 3-4 gotas de SO4H2 al 10% 1 ml de CO3K2 al 10% 3-4 gotas de SO4H2 al 10% 1 ml de CO3K2 1 ml de CO3K2 3-4 gotas de SO4H2 al 10% 3-4 gotas de SO4H2 al 10%

Compartimento interior 3,3 ml de SO3HNa 0,15M 3,3 ml de SO3HNa 0,15M 2 ml de cloruro de paladio 3,3 ml de NaOH 0,1N 2 ml de dicromato potásico 3,3 ml de SO3HNa 0,15M 1 ml de tolueno 3,3 ml de SO4H2 al 10% 3,3 ml de SO3HNa 0,15M 3,3 ml de NaOH 0,1N 3,3 ml de NaOH 0,1N

Tiempo de difusión 3 horas 3 horas 1 hora 3 horas 3 horas

3 horas 3 horas 3 horas 3 horas 3 horas 3 horas

Técnica de espacio de cabeza 1.

2. 3.

La muestra se deposita en un vial cerrado con tapón perforable, en el que se deja una cámara de aire. Se calienta a 60ºC durante 30 min. Se extrae con una jeringa para gases una muestra de la parte superior del frasco para inyectarla en un cromatógrafo de gases.

Métodos de extracción de tóxicos gaseosos • Se denominan tóxicos gaseosos a todas aquellas sustancias que a temperatura ambiente se encuentran en estado gaseoso. Por ejemplo: CO, HCN, SH2, AsH3, SbH3 , NH3, Cl2, Br2.

Métodos de extracción de tóxicos gaseosos • Las técnicas son: -La extracción de gases en sangre se basa en leyes físicas, según las cuales su solubilidad disminuye elevando la temperatura o disminuyendo la presión. -Mediante las mismas técnicas que para los tóxicos volátiles. -Cromatografía de gases

Técnicas cromatográficas Volatilización

Cromatografía de gases (GC)

Técnica de separación. Se basa en la diferente velocidad con que se mueven los solutos a través de un medio poroso arrastrados por un disolvente en movimiento.

Cromatografía de gases

*Line Base *Pico Cromatográfico *Base del Pico *Área del Pico

*Altura del Pico *Anchura del Pico *Anchura del Pico a la mitad de la altura

Cromatografía de gases Ventajas e inconvenientes • Costoso. • Personal especializado. • Técnica muy sensible, fiable y rentable para determinaciones cualitativas (casi la totalidad de los tóxicos) y cuantitativas (límite de sensibilidad 1-5 µg/ml.) . • Posibilidad de derivación (obtener un compuesto intermedio a partir de una sustancia no volátil) hace su aplicación prácticamente universal.

Métodos de microextracción en fase sólida

Métodos de extracción de tóxicos orgánicos fijos Sustancias orgánicas y no volátiles. Se incluyen: *Tóxicos de origen vegetal (glucósidos, aceites esenciales, alcaloides, etc) *Productos de síntesis (medicamentos).

Métodos de extracción de tóxicos orgánicos fijos Las técnicas son: -Con disolvente polar (etanol): técnica de Stas-Otto. - Con disolventes apolar: los más frecuentes son: éter etílico, cloroformo y diclorometano. Puede ser: *Directa: sólo aplicable a muestras biológicas limpias como la orina *Previa purificación de la muestra (eliminación de proteínas). Fraccionamiento del extracto antes de su análisis: Debido a la gran variedad de tóxicos orgánicos conocidos es necesario un fraccionamiento del extracto.

Métodos de extracción de tóxicos orgánicos fijos Clasificación de tóxicos orgánicos en: 1. Ácidos: débiles (por ejemplo barbitúricos) o fuertes (por ejemplo salicilatos), unos y otros extraíbles con disolventes orgánicos en medio ácido. 2. Básicos: extraíbles con disolventes orgánicos en medio básico (alcaloides, antidepresivos tricíclicos, etc.) 3. Neutros: extraíbles con disolventes orgánicos en medio ácido o básico.

Métodos de extracción de tóxicos orgánicos fijos Las técnicas son: -Método de electrodiálisis: se basa en la propiedad que tiene la corriente eléctrica de descomponer las sales de los tóxicos orgánicos, yendo la base hacia el polo negativo y el resto al polo positivo. -Columnas con rellenos de resinas: las drogas orgánicas son absorbidas por la resina y luego son eluidos con solventes apropiados.

Métodos de extracción de tóxicos orgánicos fijos

Extracción en fase sólida

Métodos de extracción de tóxicos minerales o inorgánicos Estos tóxicos se encuentran en el organismo firmemente unidos a albúmina, lípidos o glúcidos, siendo requisito la destrucción de la materia orgánica para poder realizar su análisis.

Métodos de extracción de tóxicos minerales o inorgánicos 1. Mineralización: proceso por el cual se produce la destrucción de la materia orgánica y la consiguiente liberación del tóxico. a) Destrucción oxidativa por vía húmeda de la materia orgánica empleando ácido nítrico o mezclas de ác. nítrico-agua oxigenada, etc. b) Destrucción de materia orgánica por vía seca (calcinación). c) Formación de complejos y posteriormente se separa con disolventes orgánicos.

Se pueden efectuarse combinaciones entre los distintos métodos, para obtener una muestra más apropiada.

Métodos de extracción de tóxicos minerales o inorgánicos Existen métodos que no precisan la destrucción de la materia orgánica como: *Diálisis. *Ultrafiltración. *Electrodiálisis. *Desproteinización. 2. Marcha posterior de extracción

Detección e identificación del tóxico Dos etapas: 1. Rastreo o detección rápida: -Técnicas de inmunoensayo -Cromatografía en capa fina 2. Técnicas de confirmación: -Técnicas espectrofotométricas. -Técnicas cromatográficas.

Técnicas inmunoensayo Fundamento: Reacciones antígeno-anticuerpo. Se aplica especialmente para drogas de abuso y psicofármacos.

Tóxico libre

+ AC

Tóxico libre-AC

Tóxico marcado Tóxico marcado

Técnicas inmunoensayo 1. Radioinmunoensayo (RIA): isótopo radioactivo. 2. Enzimoinmunoensayo: enzima. -ELISA: ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas -EMIT: inmunoensayo multiplicado por enzimas 3. Fluorescencia polarizada (FPIA): fluoróforo. 4. Inmunoanálisis por interacción cinética de partículas (KIMS): competencia por unirse al Ab y evitar formar agregados de micropartículas.

Técnicas inmunoensayo

•Su aplicación es cualitativa y cuantitativa (con patrones de concentración). •Técnicas rápidas, y sensibles. •Posibilidad de reacciones cruzadas.

Técnicas cromatográficas Cromatografía en capa fina (CCF)

Fase movil Cloroformo/acetona 80:20 Isopropanol/cloroformo Cloroformo/acetona 90:10

Fase estacionaria Silica gel G activada a 120ºC/30 min Desarrollo: 30 min/10 cm Silica gel G activada a 120ºC/30 min Desarrollo: 30 min/10 cm Silica gel G activada a 120ºC/30 min Desarrollo: 30-45 min

Aplicaciones Todos los tipos Barbitúricos Anticonvulsionantes Sedantes no babitúricos

Detección e identificación del tóxico 2. Técnicas de confirmación: -Técnicas espectrofotométricas. -Técnicas cromatográficas.

Técnicas espectrofotométricas Fundamento: capacidad que tienen las moléculas y los átomos de absorber radiaciones de diferente longitud de onda utilizando la energía de dichas radiaciones para producir cambios energéticos en su estructura (en los átomos transiciones electrónicas y en las moléculas movimientos electrónicos)

Técnicas Espectrofotometría UV visible Espectrofluorimetría Espectrofotometría infrarroja Espectrofotometría de absorción atómica Espectrometría de masas

Aplicaciones Compuestos Orgánicos Orgánicos Orgánicos Metales Orgánicos

Análisis Cuali/cuantitativo Cuali/cuantitativo Cualitativo Cuali/cuantitativo Cualitativo

Espectrofotometría de absorción atómica (EAA)

E* Luz incidente

E

Fluorescencia emitida

Espectrofotometría de absorción atómica

Lámpara de cátodo hueco

Sistema atomizador

Sistema monocromador

Sistema detector

La emisión de una energía electromagnética de longitud de onda determinada, se hace incidir sobre un átomo libre en estado fundamental, este átomo absorbe la energía y con lo que pasa a un estado excitado.

Espectrofotometría de absorción atómica Ventajas e inconvenientes • Costoso. • En la interpretación de resultados considerar: contaminación en la toma y mantenimiento de las muestras, etc. • Personal especializado. • Técnica muy sensible, fiable y rentable. Su sensibilidad permite identificar y cuantificar metales en niveles de traza.

Espectrofotometría de emsión atómica (EEA)

E*

Luz emitida

E

Volatilización Ionización

2.Aceleración iones

Espectrofotometría de masas (EM)

3. Separación

4. Detección

Técnica cualitativa y cuantitativa. Separa partículas moleculares o atómicas según su masa.

Espectrofotometría de masas

Técnica cualitativa y cuantitativa. Análisis de fragmentos moleculares. Determinación de la estructura molecular. Su principal aplicación es la identificación de sustancias desconocidas

Espectrofotometría de masas Ventajas e inconvenientes • Costoso. • Personal especializado. • Acoplamiento a GC (o HPLC): método más efectivo para la identificación de tóxicos y sus metabolitos. • ICP-MASAS

ICP-Masas

ICP: Plasma de acoplamiento inducido

Técnicas cromatográficas Cromatografía de líquidos Cromatografía de gases

Técnicas cromatográficas Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) Ventajas e inconvenientes • Costoso. • Personal especializado. • No destruye la muestra, lo que permite la detección por distintos sistemas en serie. • Requiere mínima preparación y pequeñas cantidades. • Mayor precisión que GC. En general se aplica a compuestos de alto peso molecular y polar mientras que GLC se aplica a gases permanentes y sustancias volátiles. • Mejor resolución y menor tiempo de análisis.

Gracias por su atención