Aspectos Bioquímicos y Fisiológicos de la Nutrición Animal

Instituto de Ciencia Animal Ministerio de Educación Superior

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PROLOGO

Este libro ha sido preparado por los profesionales del departamento de Ciencias Biofisiologicas de Instituto de Ciencia Animal a partir de las conferencias que se imparten en la asignatura Fisiología Digestiva y Bioquímica Nutricional correspondiente a la maestría “Producción Animal Tropical” que se imparte con carácter nacional e internacional a profesionales y egresados de las carreras de corte agropecuario o disciplinas afines. Fue concebido para actualizar las ediciones anteriores de los Tomos I y II de Bioquímica Nutricional y para llevar a los educandos los conocimientos mas actualizados acerca de la fisiología digestiva de rumiantes y monogástricos sometidos a las nuevas condiciones de alimentación con dietas tradicionales y no convencionales. El libro consta 20 conferencias distribuidas en tres capítulos que abarcan desde la fisiología y anatomía del tracto digestivo de rumiantes y monogástricos hasta la influencia de las practicas de manejo en el comportamiento de estos índices. En el se tratan aspectos nuevos acerca del el estrés en el trópico el estrés oxidativo, los factores antinutricionales, los minerales orgánicos, el uso de alimentos fibrosos en especie monogástricas y métodos actuales para hallar el valor nutritivo de los alimentos entre otros. Consideramos que el libro puede servir como un valioso material de consulta tanto para profesionales que deseen investigar en el campo de la agropecuaria como para recien graduados que requieran profundizar en sus conocimientos acerca de la Fisiología Digestiva y la Bioquímica Nutricional .

Odilia Gutiérrez y Lourdes Savón

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Índice Contenido

Autores

Sección I: Fisiología y Anatomía del Tracto Digestivo HI II III IV V

Fisiología digestiva del rumen Anatomía comparada y digestiva de los animales monogástricos: aves, cerdos y conejos Los microorganismos del rumen y su actividad La celulosas ruminal y los factores que la modifican Micro ecología del Tracto Gastrointestinal en monogástricos

Denia delgado L. E. Dihigo Juana Galindo Juana Galindo R. Bocourt

Sección II: Digestión y absorción de nutrientes VI VII VIII IX X XI XII

Digestión de los carbohidratos y absorción de los AGV en el rumen Digestión y absorción de carbohidratos en monogástricos Digestión y absorción de lípidos en rumiantes Digestión y absorción de lípidos en monogástricos Digestión y absorción de compuestos nitrogenados en rumiantes Digestión y absorción de proteínas en monogástricos Metabolismo mineral

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Metabolismo de las vitaminas

Denia Delgado Soraya Rodríguez R. Stuart Madeleidy Martínez Bertha Chongo R. Bocourt Odilia Gutiérrez y Lourdes Savón Odilia Gutiérrez y R. Bocourt

Sección III: Aspectos fisiológicos del manejo animal XIV XV XVI

El estrés oxidativo: sus causas y consecuencias Consideraciones acerca del estrés y su manejo en rumiantes Aspectos fisiológicos del uso de los follajes tropicales en la alimentación de rumiantes XVII Efectos de los factores antinutricionales en la fisiología digestiva de las especies monogástricas XVIII Consumo voluntario y su mecanismo de control en monogástricos XIX XX

Alimentación no convencional de especies monogástricas. Utilización de alimentos ricos en fibras Metodología para determinación del valor nutritivo de pastos y forrajes

R. Stuart Denia Delgado Bertha Chongo María. F. Díaz Lourdes Savón y Madeleidy Martínez Lourdes Savón O. La O

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Sección I Fisiología y Anatomía del Tracto Digestivo

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I Fisiología digestiva del rumiante Dra. Denia C. Delgado Contenido Introducción .............................................................................................................................................................................6 El tracto digestivo del rumiante. ............................................................................................................................................7 El retículo rumen. Características generales.........................................................................................................................8 El canal reticular o gotera esofágica. ...................................................................................................................................9 El Omaso. ............................................................................................................................................................................10 El abomaso. .........................................................................................................................................................................10 Intestinos..............................................................................................................................................................................10 Desarrollo del estómago del rumiante..................................................................................................................................11 Microbiología del rumen.......................................................................................................................................................11 Motricidad ruminal y movimientos asociados del contenido de la digesta. ......................................................................12 Motricidad ruminal. Los dos ciclos motores. ......................................................................................................................12 Propulsión y mezclaje..........................................................................................................................................................13 Ingestión y Rumiación...........................................................................................................................................................13 Rumiación............................................................................................................................................................................14 El tamaño de las partículas del rumen. Factores que influyen en su degradación .............................................................14

Gravedad específica de las partículas ............................................................................................. 15 Relación entre la GEF y el tamaño de las partículas....................................................................... 15 El pasaje de las partículas sólidas ......................................................................................................................................16 Digestión ruminal ................................................................................................................................................................17 Digestión microbiana de los hidratos de carbono...............................................................................................................17 Digestión de los compuestos nitrogenados..........................................................................................................................18 Digestión ruminal de los lípidos..........................................................................................................................................18 Pasaje intestinal. ....................................................................................................................................................................18 Conclusiones...........................................................................................................................................................................19 Bibliografía a consultar.........................................................................................................................................................19

Introducción La principal función del tracto gastrointestinal (TGI) de los animales es proporcionar los nutrientes para la absorción y la excreción de ciertos productos de desecho. Aunque las funciones pueden ser similares en muy diversas especies, existen marcadas diferencias en la naturaleza de su alimentación, así como en la estructura de su TGI. La mayor parte de los carnívoros y omnívoros tienen un estómago relativamente simple que se conoce como estómago monogástrico. En tales animales el estómago es esencialmente una estructura en forma de bolsa que contiene glándulas secretoras de ácido clorhídrico y pepsinógeno, el precursor de la pepsina y en los animales jóvenes también secreta renina y lipasa. En contraste, los rumiantes presentan una serie de características en su tracto digestivo que difieren del resto del los animales, gracias a lo cual pueden utilizar los carbohidratos celulósicos procedentes de las plantas, que el hombre ni los animales monogástricos pueden aprovechar, por carecer de las enzimas digestivas capaces de romper las uniones β1-4 de la glucosa en las cadenas de los polisacáridos estructurales. La utilización de estos alimentos fibrosos es posible, gracias a la existencia de un preestómago en los rumiantes que constituye una cámara de fermentación continua donde una gran población microbiana,

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productora de enzimas celulasas, vive en simbiosis con el animal y le permite aprovechar de forma indirecta la energía almacenada en las plantas y convertirlas en alimento (carne, leche, etc.). Esta conferencia recoge algunos aspectos relevantes de la fisiología digestiva de los rumiantes con el propósito de realizar una mejor explotación del potencial del rumen a favor de una mayor eficiencia productiva y económica en la explotación de esta especie animal. El tracto digestivo del rumiante. Los rumiantes ocupan un lugar destacado dentro de la cadena alimenticia, puesto que ellos pueden digerir las paredes celulares de las plantas, a través de la fermentación ruminal. La fermentación tiene lugar en el estómago pluricavitario, una región especial de amplia capacidad donde los alimentos permanecen un cierto tiempo y sufren la acción de una densa población microbiana que fermenta los carbohidratos y otros materiales de las plantas para producir principalmente ácidos grasos de cadena corta (AGV), metano, dióxido de carbono y energía (ATP). El estómago pluricavitario se ubica en el lado izquierdo de la cavidad abdominal y ocupa casi las 3/4 partes. Está formado por cuatro partes netamente distinguibles: el retículo, el rumen, el omaso y el abomaso (Fig. 1). Las tres primeras partes están cubiertas por papilas, que forman un epitelio estratificado escamoso queratinizado y que es el sitio principal de absorción de nutrientes.

Figura 1. Diagrama esquemático del estómago de un rumiante.

En estos compartimentos no hay glándulas ni se segrega mucus y la digestión ocurre gracias a las enzimas microbianas. La verdadera digestión ocurre en el abomaso que es el estómago glandular propiamente dicho. El tamaño, forma y capacidad de los distintos compartimentos gástricos de los rumiantes dependen de la alimentación, la edad y la talla de los animales. Al año o año y medio de vida el estómago debe alcanzar un desarrollo adecuado. En este momento el retículo rumen (RR) representará entre el 62-80 7

% de la capacidad total del complejo gástrico y al omaso y el abomaso corresponden el 5 y el 7 %, respectivamente. El retículo rumen. Características generales. El retículo y el rumen, debido a su continuidad anatómica y a la no diferenciación fisiológica entre ellos, son considerados usualmente como un órgano simple: el retículo rumen (RR). El epitelio del retículo presenta pliegues que forman celdas poligonales. Una gran cantidad de pequeñas papilas están presentes en la superficie de celdas. El contenido del retículo se mezcla con el del rumen casi continuamente (una vez por minuto). El RR es el órgano principal del sistema digestivo de los rumiantes. En el animal adulto se encuentra situado en la región abdominal izquierda del animal, desde las costillas sexta y octava costillas hasta la pelvis. Ocupa prácticamente toda el área, extendiéndose además sobre el plano medio ventral y en su centro. En sentido dorso ventral se expande desde las vértebras sacro-lumbares hasta muy cerca de la línea media del cuerpo. El límite superior constituye la llamada curvatura dorsal y el inferior la ventral. Los laterales son la cara parietal (izquierda) y la visceral (derecha). El rumen está dividido por medio de pilares o tabiques en cuatro sacos. Los sacos mayores, el dorsal y el ventral, tienen comunicación entre sí y con el retículo, mientras que los sacos pequeños caudales no tienen comunicación con el exterior y se les denominan sacos ciegos dorsal y ventral (Fig.2). Figura 2. Diagrama del retículo-rumen por su parte interna

Por su parte interior, el RR tiene apariencia rugosa por la presencia de las papilas. Estas papilas son mayores en los sacos dorsal y ventral lo que incrementa la superficie de absorción. Esto constituye una forma de adaptación a las necesidades absortivas del órgano que como se dijo anteriormente, no posee capacidad secretora (Van Soest, 1982). El RR se puede considerar como un sistema de fermentación continua, cuya capacidad requiere que todas las sustancias que entren con los alimentos o se produzcan por la fermentación salgan del órgano 8

y la entrada y la salida deben estar balanceadas. El rumen puede contener hasta 100-120 Kg. de materia en digestión. Y las partículas de fibra permanecen en él, de 20 a 48 horas porque la fermentación bacteriana es un proceso lento (Watiaux et al,. 2000). Con alimentos fibrosos de baja calidad este tiempo suele ser aún mayor. El ambiente ruminal está controlado por el tipo y la cantidad de alimentos consumidos, el mezclaje periódico debido a las contracciones ruminales, la salivación, la rumia y la difusión o secreción hacia el rumen (Preston y Leng, 1987). El ambiente sólo se perturba bajo condiciones anormales drásticas. Los rumiantes producen grandes cantidades de saliva, en vacas adultas entre 100-150 litros/día y 8.5-12.5 litros/día en los ovinos; además de sus cualidades conocidas, la saliva del rumiante posee funciones importantes: Mantiene un pH constante. Debido a que es rica en fosfatos y bicarbonatos tiene la facultad de actuar como amortiguador, controlando el efecto de los ácidos que se producen durante la fermentación. Es una fuente de nitrógeno no proteico (NNP). La urea sintetizada en el hígado se secreta en la saliva para nutrir a la microbiota ruminal. Ciertos hechos del rumen son comunes a casi todos los rumiantes y situaciones alimentarias. Por lo general, se observa un ambiente anaeróbico con muy bajo potencial redox (250-450 MV) temperatura entre 39-41°C y una presión osmótica de 260-340 mosm. El pH se mantiene casi constante entre 6-7, gracias a la alta capacidad buferante de la saliva y a la absorción de los productos finales de la fermentación a través de la pared celular. El rumen está densamente poblado por una gran variedad de bacterias, hongos y protozoos (Hungate, 1966; Van Soest, 1994 y Jonany et al, 1995) que son responsables de los procesos digestivos que tienen lugar en el órgano. El contenido del RR es heterogéneo y comprende una fase gaseosa, una fase líquida y una sólida, íntimamente ligadas con un alto por ciento de agua (85-90 %) y una densidad ligeramente inferior a 1. El gas, en su mayor parte, proviene de la fermentación de los alimentos y se acumula en la parte superior del saco dorsal. En un bovino adulto se producen cerca de 30-50 litros/hora de diferentes gases y en un borrego, 5 litros/hora; estos se eliminan a través del eructo. Los principales gases son: Bióxido de carbono (60-70%), Metano (30-40%), Nitrógeno (7%), Oxígeno (0.6%), Hidrógeno (0.6%) y Ácido Sulfhídrico (0.01%). La fase líquida está compuesta principalmente por el agua de bebida, la saliva y por sustancias solubles, principalmente los AGV, el NH3, los glúcidos y las materias nitrogenadas solubles de los alimentos. En la fase sólida presente en el rumen, las partículas de los alimentos y la biomasa microbiana forman una suspensión de estructura compleja que será revisada en detalle posteriormente. El canal reticular o gotera esofágica. El rumen está conectado con el omaso, a través de un cuello corto y estrecho que termina en el llamado orificio retículo omasal (ORO) que se extiende desde el cardias hasta el omaso. El ORO está formado por dos pliegues musculares que se cierran para dirigir los alimentos líquidos desde el esófago hasta el abomaso sin pasar por el rumen.

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El cierre se produce por un reflejo que inicialmente se atribuyó a algunas sustancias presentes en la leche, sin embargo, en la actualidad existen evidencias de que el patrón de comportamiento, unido con la estimulación táctil de la teta que proporciona la leche, son los responsables del cierre del canal (Orskov, 1990). Se ha demostrado que el estímulo es necesario para el cierre, ya que aunque los receptores presentes en la boca se sobrepasen por introducción del líquido directamente en el esófago, si el animal se estimula enseñándole el biberón o la vasija donde se alimenta normalmente, el fluido entra al abomaso. Por el contrario, si el animal lactante se fuerza para que ingiera la leche, sin que haya un estímulo previo, ésta entra al rumen y se produce fermentación láctica, lo que conduce a acidosis y parcial destrucción de la proteína. El cierre del canal reticular no es perfecto, lo que posibilita que una pequeña parte de los alimentos que ingiere el ternero vaya cayendo directamente en el rumen. Esto sirve de inóculo inicial para que se establezca la microflora en el órgano. El canal reticular es más funcional en los animales lactantes que lo utilizan para pasar la leche directamente desde el esófago hacia el abomaso. En el rumiante adulto sólo funciona si se ha mantenido el estímulo para el cierre, suministrando los nutrientes con teteras o algunas soluciones minerales de cobre y de sodio que provocan un efecto similar. El Omaso. El omaso tiene forma elipsoidal, presenta papilas longitudinales y anchas en forma de hojas o láminas que emergen de las paredes del órgano y se disponen en orden de tamaño en varias hileras. La función del omaso aún no se comprende totalmente, pero parece ser que atrapa las partículas pequeñas de la ingesta, comprime los alimentos y extrae líquido. Además en este órgano se absorbe agua y otras especies moleculares pequeñas (NH3, AGV, electrolitos inorgánicos, etc). El omaso, contrarresta, por absorción, el exceso de carga ácida, osmótica, acuosa o amoniacal de dicho contenido con lo que protege al abomaso y al duodeno de la llegada de un quimo anormal y asegura una buena digestión (Asocras, 2000). El abomaso. El abomaso es un saco alargado que se encuentra en su mayor parte en el suelo del abdomen. Constituye la región glandular del estómago de los rumiantes y es equivalente al estómago de los monogástricos. En esta región ocurre la verdadera digestión ante la presencia de ácido clorhídrico y enzimas. Intestinos. El abomaso y el intestino delgado (duodeno, yeyuno e íleon) parecen tener funciones similares en los rumiantes y en los monogástricos. Es en estos órganos donde los residuos no fermentados de los alimentos y los microorganismos ruminales se someten a la digestión enzimática y sus productos se absorben (Preston y Leng, 1987 y Forbes y Frences, 1994). Es muy importante saber que la velocidad de digestión de los alimentos en los rumiantes es más lenta que en los monogástricos, pero también, los sustratos (alimentos) son modificados con mayor intensidad). 10

El intestino grueso (ciego y colon) se une al íleon, a través del orificio ileocecal. El ciego y el colon son áreas de colonización microbiana y fermentación de aquellas fracciones alimentarias que sobrepasan la fermentación ruminal y la digestión en el intestino delgado. Las bacterias presentes en el intestino grueso difieren muy poco de las del rumen. La producción de AGV que se absorbe desde el intestino grueso representa una fracción muy variable, de 4 a 26 % de la energía total digerida. Desarrollo del estómago del rumiante. El desarrollo del epitelio ruminal, depende de estímulos químicos (absorción de los ácidos orgánicos liberados de las fermentaciones, principalmente) y mecánicos (masticación y rumiación) que se inician con el consumo de alimentos sólidos (Fig. 3). Figura 3. Estimulación fisicoquímica para el desarrollo ruminal

Estimulo quimico AGV, NH3

Estimulo mecánico

Desarrollo Estructural Actividad metabólica

NH3 y Ac. Butírico

Flujo sanguíneo

Epitelio

Músculo

Motilidad

Ac. acético y propiónico

Habilidad absortiva

Ac. acético y propiónico

Las proporciones de los AGVs que se producen durante la fermentación dependen de la dieta consumida. El ácido butírico y, en menor grado, el ácido propiónico, derivados de la degradación de los hidratos de carbono, son los responsables del crecimiento, desarrollo, mantenimiento, reposición y de la correcta funcionalidad del epitelio de los preestómagos. Para que estos ácidos, sean efectivos, deben mantener un ritmo de producción adecuado y, alcanzar una determinada concentración. Por último, las concentraciones de AGV deben estar equilibradas entre sí. El periodo crítico de formación del epitelio para adaptarse a la función de la rumia, se inicia a las 3-5 semanas, alcanzando su madurez funcional a los 3-4 meses de vida. Microbiología del rumen. Aunque los datos de los efectos de la dieta en la población bacteriana son limitados y hay una gran variación entre animales. Murphy (1990) hizo algunas generalizaciones referentes a las principales especies presentes en el rumen. 11

Las bacterias más importantes para la digestión de la fibra son el Ruminococcus albus, el Ruminococcus flavefaciens, el Fibrobacter succinogenes y el Butyribibrio fibriosolvens. En dietas basadas en granos predominan el Streptococcus bovis, particularmente a pH bajos y en dietas con sustratos altamente degradables. Los lactobacilos bajo estas condiciones son también un grupo importante. Los microorganismos actúan una vez que el alimento llega al rumen. La colonización de la fibra por los microorganismos ocurre muy rápidamente ( heno corto > heno molido y dietas mezcladas. La preñez y la adaptación se asocian con aumentos del flujo y parece que es más alto en vacas que en ovejas (Faichney, 1993). En general, se puede plantear que el contenido duodenal de los poligástricos tiene una composición muy estable. Al intestino entran alrededor de 250 litros de digesta y de ellos 220 litros se absorben para nutrir al animal hospedero. Este representa 3-4 veces el alimento junto con el agua ingerida. En el intestino delgado se absorben 62-75 % de la digesta contra 17-25 % en el intestino grueso. La cantidad de fósforo es el doble que el que se ingiere, la del sodio 7 veces y la del cloruro 10 veces, debido fundamentalmente, al aporte endógeno de la secreción abomasal y la saliva. Conclusiones Son mucho los procesos y las interacciones que intervienen en la fisiología digestiva del rumiante y resulta imposible abarcarlos todos en una conferencia con la profundidad que se requiere. En este trabajo se recogen aquellos aspectos relevantes que diferencian esta especie de los monogástricos y cuyo conocimiento puede contribuir a mejorar la eficiencia de los alimentos disponibles en el trópico y evitar las alteraciones que se producen por las condiciones de manejo, lo cual implica una ganadería más ecológica y sostenible. Bibliografía a consultar. Akin, D.E.; Gordon, L.R y Hogan, J.P., 1983. Rumen bacterial and fungal degradation of Digitaria petzii grown with and without sulfur. Appl. Env. Microbial 46: 701 Asanuma, N.; Iwamoto, M y Hino, T. 1999. Effect of the addition of fumarate on methane production. J. Dairy Sci. 82: 780 Asocras, 2000. Digestive Anatomy in Ruminants. Internet. Beever, D.E. 1993. Rumen Function. En Quantitative Aspects of Ruminant Digestion and Metabolism. Eds. Forbes, J.M. y France, J. CAB International, UK. 19

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II Anatomía comparada y digestiva de los animales monogástricos: aves, cerdos y conejos DMV Luis E. Digo Cutis Contenido Introducción.............................................................................................................................................................................22 I. Clasificación de los animales domésticos según hábitos alimentarios ...........................................................................22 II - Características generales del TGI y su importancia..........................................................................................................22 III- Aparato digestivo del cerdo, comparación con las aves y el conejo.................................................................................23 Sistema digestivo................................................................................................................................................................23 El hígado.............................................................................................................................................................................29 El páncreas. ........................................................................................................................................................................29 Bibliografía a consultar............................................................................................................................................................31

Introducción El estudio de la fisiología de los órganos del tracto gastrointestinal (TGI) de los animales tiene una gran importancia si se toma en consideración que este interviene en la degradación de los alimentos consumidos por el animal. Asimismo la utilización que de ello pudiera realizar el organismo depende de la eficiencia de los procesos digestivos (digestión, absorción y excreción). En los animales superiores el sistema digestivo presenta un esquema estructural semejante (boca, faringe, esófago, estómago e intestinos). Sin embargo los hábitos alimentarios han modificado algunas de estas estructuras adaptándolas al tipo de alimento preferido y como respuestas a las condiciones impuestas por la naturaleza. Los mamíferos conjuntamente con las aves son los vertebrados que más han evolucionado. Ambos ofrecen importantes particularidades en el estudio de su fisiología digestiva. En la presente conferencia se desarrollará un breve análisis anátomo-fisiológico de las analogías y diferencias entre las aves cerdos y conejos. I. Clasificación de los animales domésticos según hábitos alimentarios Herbívoros y No Herbívoros

Rumiantes y No rumiantes

Vaca Carnero

Carnívoros Omnívoros Granívoros

Conejo Caballo

II - Características generales del TGI y su importancia.

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El sistema o aparato digestivo está constituido por órganos a los que concierne directamente la recepción, digestión y absorción de alimentos y la expulsión por el recto del material no utilizado. Este conjunto de órganos se divide en dos grupos principales: el conducto alimentario y los órganos accesorios. El conducto alimentario se prolonga desde la boca hasta el ano. La longitud y tamaño de los órganos digestivos varía con la edad, especie, tamaño del animal así como con la cantidad y tipo de alimento suministrado. El conducto se halla revestido interiormente por una membrana mucosa y cubierta externamente por una capa muscular lisa. La membrana mucosa que reviste el tracto digestivo forma pliegues temporales o permanentes y rugosidades. Esta permanece humedecida por el mucos que se deriva de las glándulas o células caliciformes del epitelio. Esta membrana tiene una función secretora y protectora. La membrana mucosa tiene por fuera una túnica muscular representada por una musculatura lisa y en la vecindad de los orificios una musculatura estriada. La porción abdominal del TGI esta cubierta en gran parte por una membrana serosa el peritoneo visceral. La mezcla de los alimentos con los jugos digestivos se obtiene por medio de movimientos u ondas peristálticas. El transporte del contenido intestinal se realiza en dirección caudal y a su paso por el intestino se produce la absorción de la mayoría de los nutrientes La microflora presente en el TGI de los animales se caracteriza por su extensa actividad y desempeña un papel importante en la digestión. III- Aparato digestivo del cerdo, comparación con las aves y el conejo. Sistema digestivo. En el aparato digestivo del cerdo se destacan diferentes órganos cuyas características y funciones se describen literalmente comparadas con las aves y los conejos. En las tres especies la constitución de su aparato digestivo comienza a partir de la boca. El aparato digestivo del cerdo concuerda perfectamente con el de un animal omnívoro con una dentición completa. Esto permite una verdadera masticación de los alimentos que entran al estómago completamente triturado por lo que el TGI es normal. En las aves que nos ocupan que son en lo fundamental granívoras su pico ejerce sólo una función recolectora, la que al tener un estómago glandular pequeño justifica la presencia del buche. En el caso particular de los conejos (Fig. 1) vamos a encontrar que presentan un desarrollo de los incisivos, los que crecen constantemente, de ahí la necesidad de roer para provocar un desgaste continuo.

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Figura 1. Esquema del tracto digestivo de los conejos.

La saliva en los mamíferos tanto en el cerdo como en el conejo provienen de la secreción de las glándulas submaxilares, sublinguales y parótidas que se hallan en la mucosa bucal. La saliva de los mamíferos contiene enzimas digestivas, la más importante es la amilasa salival que realiza la hidrólisis parcial de los almidones. El cerdo contiene una saliva que contiene suficiente amilasa la que desempeña un papel importante en la digestión. Contrariamente en el ave como el alimento permanece poco tiempo en la cavidad del pico, las glándulas salivares suministran saliva como secreción mucosa para lubricar los alimentos ingeridos y por tanto el no haber una manifiesta actividad enzimática no tienen lugar todavía procesos digestivos. La faringe se comunica con el esófago, que es el órgano que se conecta con el estómago. En las aves se detecta un ensanchamiento a la entrada de la cavidad toráxica llamado buche. Se plantea que el buche puede segregar enzimas y existe la duda si esas enzimas provienen de los mismos alimentos de la regurgitación del contenido intestinal, molleja, proventrículo o de las bacterias existentes allí. En el conejo adulto el tubo digestivo tiene una longitud total de 4.5-5m con un esófago corto. El estómago es simple (Fig. 2) y presenta una diferenciación anatómica y fisiológica con las aves. En el cerdo es monocavitario, voluminoso, su capacidad fluctúa entre 5 y 8 litros aproximadamente (Tabla 1). Esta situado en posición transversal con la curvatura mayor en posición ventral, posee una disposición especial por dentro y tiene una bolsa ciega cónica y aplanada. La extremidad pilórica se comunica con el intestino mediante el esfínter pilórico. La membrana mucosa se divide en 4 regiones: esofágica, cardíaca, glandular fúndica y pilórica.

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Región de las glándulas cardiaca

Región de las glándulas fúndica

Región esofágica

Región de las glándulas pilórica

Figura 2. Estómago del cerdo

Tabla 1. Volúmenes del tracto digestivo de varias especies de animales (% del PV). Especies Rumiantes Vaca Cabras No rumiantes Conejo Caballo Cerdo

Contenido total

Estómago

Intestino delgado

Ciego

Colon recto

13-18 12-19

10.6-16 9.8-14.9

0.9-2.3 1.0-1.6

0.8 0.9-1.6

0.8-1.5 0.5-0.7

7-19 16.4 10.4

2-7 1.3 3.6

0.6-1.8 2.6 1.9

2.5-7.8 2.4 1.6

0.7-1.3 8.8 3.4

La región esofágica es blanda y glandular, la cardíaca se caracteriza por secretar un mucus no enzimático, cuya función es proteger físicamente y lubricar la mucosa gástrica. La zona fúndica tiene tres tipos de células, pariétales u oxínticas que segregan ácido clorhídrico, células principales que segregan pepsinógeno y células del cuello que segregan mucus. La región pilórica se caracteriza por segregar pepsinógeno y mucina que actúa como antiséptico. El estómago del cerdo se presenta como un reservorio de alimentos, los retiene mientras estos sufren cambios mecánicos y químicos, además de controlar la salida de alimentos digeridos hacia el intestino (duodeno) El contacto de los alimentos con la mucosa gástrica sirve como estímulo directo de las funciones iniciadas por el vago y la hormona gastrina especialmente para la producción del jugo gástrico. En el caso de los rumiantes alimentados de forma tradicional entre s 36 y 56 días de edad desarrollan los llamados preestómagos que son tres: omaso, retículo y rumen. Además también se encuentra el abomaso o verdadero estómago. El rumen (Fig. 3) constituye el órgano fundamental desde el punto de vista digestivo y anatómico, pudiendo alcanzar en el rumiante alrededor del 80 % del volumen del estómago en tanto que el abomaso no pasa del 5-7 %. En el rumiante tienen lugar procesos digestivos y fermentativos entre los que se puede mencionar la celulolisis ruminal que permite la solubilización del 70 al 90 % de todas las formas de celulosas.

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Figura 3. Esquema del rumen de la vaca.

Las aves poseen un estómago de dos posiciones fácilmente distinguibles: el estómago glandular o proventrículo y el estómago muscular o molleja. La mucosa del proventrículo contiene glándulas bien desarrolladas que producen jugo gástrico y ácido clorhídrico, que a diferencia con los mamíferos estas se producen por una misma célula, es por ello que el proventrículo se considera el verdadero estómago de las aves. La molleja tiene como función fundamental triturar y moler la ingesta proveniente del buche (realiza la función de la dentadura ausente en esta especie) ayudados por las piedrecitas grit. El estómago del conejo tiene un peso aproximado de 20 g un contenido entre 90 -100g y un pH 1.52.0. El contenido de estómago se inyecta progresivamente en el intestino delgado mediante pequeñas descargas merced a las poderosas contracciones del estómago. Respecto a los intestinos el conducto intestinal del cerdo mide aproximadamente quince veces la longitud de su cuerpo y posee gran cantidad de grasa. Se divide en intestino delgado y grueso los que constituyen la parte digestiva donde terminan la transformación de los alimentos. El intestino delgado mide de 15 a 20 m de largo los primeros 60 cm constituyen el duodeno el cual se continúa con el yeyuno y el ileón sin que exista una línea de demarcación entre estos dos. En toda la superficie del intestino la mucosa posee pliegues y presenta un aspecto a terciopelado debido a las prolongaciones digestiformes llamadas vellosidades. Entre las vellosidades se hallan numerosas glándulas intestinales llamadas de Lieverkuhn que conjuntamente con las glándulas de Brunner segregan el jugo entérico. Los conductos biliares y pancreáticos se abren en el duodeno a una distancia del píloro de 5 y 10 cm respectivamente. En las aves el intestino delgado también consta de duodeno yeyuno e ileón pero el duodeno sale del estómago muscular en su parte anterior derecha y se dirige hacia la parte posterior y luego hacia delante formando el asa duodenal característico de a gallina (Fig.4). 26

Esófag Buche Proventrícu Molle

Híga Intestino delgado

Páncre Ciegos

Cloa Figura 4. Esquema del tracto gastrointestinal de la gallina doméstica.

El duodeno en las aves está considerado como el sitio de acción principal de la digestión gástrica. Esto se hace posible debido a las características anatómicas que posibilitan que se mantenga bajo el pH de los jugos gástricos. En el duodeno se encuentran válvulas conniventes, y las vellosidades están muy desarrolladas y entre ellas se encuentran criptas de Lieberkuhn manifiestas. No se encuentran glándulas de Brunner y además el tejido linfoide no es abundante; al igual que el cerdo, no hay demarcación entre el yeyuno y el ileón. El yeyuno comienza en una de las ramas en U del duodeno y se aparta de la otra. El ileón está estirado y se localiza en el centro de la cavidad abdominal donde desembocan los ciegos. La motilidad del intestino delgado es variable y existen contracciones peristálticas, cambios tónicos y movimientos pendulares de las vellosidades. La importancia de estos diferentes tipos de movimientos no es la misma en todas las especies. En el cerdo son más características los movimientos pendulares que mezclan los alimentos con los jugos digestivos y los pone en contacto con la mucosa para su absorción y contribuye al movimiento del contenido intestinal a través del tracto. En el conejo el ID mide aproximadamente 3 m de longitud por un diámetro aproximado de 0.8-1cm. El contenido del mismo es líquido, sobre todo en la primera parte. Además es normal encontrar porciones de una decena de centímetros, vacíos de todo contenido.

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El intestino grueso del cerdo tiene una longitud de 4 a 5m. Es más grueso y más ancho que el delgado. Está constituido por el ciego, colon y el recto terminando en el esfínter anal. Las secreciones de las glándulas mucosas no producen enzimas y las que se hallan a esté nivel provienen del intestino delgado. La secreción del intestino grueso es clara, viscosa con altos contenidos de mucus y de reacción alcalina. No se encuentran vellosidades en el intestino grueso del cerdo. La función del intestino grueso es continuar la digestión del material que escapa a la absorción en el intestino delgado. La presencia de bacterias en aquellos tramos del TGI donde el vaciado es incompleto (ileón, ciego y colon) brinda condiciones idóneas para el desarrollo y multiplicación de estas y favorecen su acción química en el contenido intestinal completándose así la digestión en este nivel. Otra función fundamental del IG es devolver a la sangre el agua vertida por medio de las secreciones de las glándulas digestivas, así como los electrolitos, vitaminas y aminoácidos. En las aves el IG consta de dos ciegos y el colon. No existe una línea de demarcación entre el recto y el colon como en los mamíferos. Es un órgano corto y su contenido digestivo es vertido a la cloaca. Con relación al ciego en los cerdos es un saco cilíndrico de 20 a 30 cm de largo localizado a la izquierda del plano medio del ijar. Su extremidad dorsal se comunica con el colon. El ileón se une con el ciego oblicuamente, así un pliegue muscular que pasa de uno a otro lado del orificio ileocecal actúa como válvula. La función de esta válvula es no permitir el retroceso del material intestinal. Normalmente permanece cerrada, pero cuando llega una onda peristáltica se abre brevemente dejando pasas pequeñas cantidades de quimo al ciego. Los ciegos en las aves son dos sacos e unos 7 cm de largo cuya superficie se encuentra cubierto por pequeñas vellosidades similares a las del colon, aunque hay autores que opinan que no hay vellosidades en los ciegos de las aves. En los ciegos continúa la degradación de los principios nutritivos. La flora presente en el ciego de los cerdos actúa en los almidones que han escapado a la digestión, teniendo acción limitada con materiales fibrosos, como producto de la fermentación se producen ácidos grasos que son absorbidos por las paredes del ciego, sin embargo estos órganos no ejercen papel importante durante los procesos digestivos de las aves, sino que cumplen fines de absorción (agua) y de depósito bacteriano principalmente. Se han encontrado síntesis de vitaminas del complejo B. La siguientes porciones del IG, el colon se localiza en el cerdo a la derecha del plano medio detrás del estómago. Esta dispuesto en su mayor parte en 3 asa espirales dobles sus capas musculares presentan dos cintas longitudinales y dos series de saculaciones las que desaparecen gradualmente en la porción centrífuga. Los nódulos son numerosos y desaparecen en forma de prominencias redondas. El recto en los cerdos está ordinariamente circundado por gran cantidad de grasa. Ella constituye la última porción del intestino grueso y se comunica con el exterior mediante el esfínter anal. En cambio el segmento terminal del intestino grueso de las aves se caracteriza por terminar en una ampolla llamada “cloaca” que es común para el sistema digestivo, urinario y reproductor: Coprodeum donde se vacía el recto; Urodeum donde se abren los uréteres y Proctodeum porción final. 28

El ID del conejo desemboca en la base del ciego. Este segundo depósito mide aproximadamente 4050cm de longitud por un diámetro medio de 3-4 cm. Contiene 100-120 g de una pasta homogénea que tiene un contenido en materia seca del 22 %. En su extremidad, el apéndice cecal (10-12 cm) tiene un diámetro mas delgado. Su pared está constituido por un tejido linfoide. Muy cerca de su unión con el ID, es decir de la entrada de ciego, se encuentra el inicio del colon, la salida del ciego. El colon mide cerca de 1.5 m plisado y ondulado cerca de 50cm colon proximal y liso en su parte terminal colon distal. Hasta aquí el funcionamiento de tubo digestivo del conejo no difiere de los demás monogástricos. En cambio su originalidad consiste en el funcionamiento dual del colon proximal. El cual es el encargado de elaborar dos tipos de cagarrutas las duras y las blandas (cecotrófias) las que consume directamente del ano. Respecto a los órganos accesorios del tracto digestivo como se señalo antes realmente son dos “Hígado y Páncreas El hígado. Es relativamente voluminoso siendo su peso medio de 1.5 a 2 kg en el adulto la porción central es gruesa, pero su circunferencia es delgada. Está dividida por tres cisuras ínterlobulares profundas en cuatro lóbulos principales: lateral derecho, central derecho, central izquierdo y lateral izquierdo; este último es más voluminoso. El hígado en la gallina pesa de 30 a 50gr y su estructura no ofrece diferencias importantes con respecto a la de los mamíferos, pero en el caso de las aves resulta más evidente el carácter lobuloso de la glándula. Este órgano no produce enzimas es el encargado de elaborar la bilis y numerosas sustancias orgánicas necesarias para la digestión. El páncreas. En el cerdo se extiende a través de la pared dorsal de la cavidad abdominal por detrás del estómago. Es triangular la extremidad derecha se fija a la primera curvatura del duodeno y aquí su conducto excretor pasa al intestino mientras que la extremidad izquierda se relaciona con el estómago. En las aves el páncreas es un órgano alargado que se halla entre las dos ramas del asa duodenal cubierta por la serosa y fijada al duodeno por dos ligamentos pancreáticos duodenales. A diferencia del hígado produce una gran cantidad importante de enzimas digestivas que permiten la degradación de las proteínas (tripsina y quimotripsina), del almidón (amilasa) y de las grasas (lipasas) (Tabla 2). Tanto el hígado como el páncreas son órganos que cumplen misiones importantes para el desarrollo de los procesos vitales sobretodo el hígado considerado como el laboratorio central en el organismo por su participación en el metabolismo de casi todos los nutrientes.

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Tabla 2. Principales enzimas presentes en el TGI de los animales domésticos. Boca Estómago Intestino delgado

Amilasa salivar cerdos Pepsina, CLH y jugo gástrico Tripsina, Quimotripsina Carboxipeptidasa Lipasa y Amilasa

Renina o fermento lab

Lipasa gástrica(lactantes)

Carboxiamino Endopeptidasa Sacarasa,maltasa, lactasa y enterosinasa

lecitinasas, Fosfatasas, prolinasas,nucleosida-sas

Tabla 3. Enzimas de mayor importancia en la digestión de los carbohidratos en los monogástricos (Álvarez, 1984). Órgano de secreción Boca (saliva) Estómago (jugo gástrico)

Intestino delgado (jugo entérico)

Páncreas (jugo pancreático)

Enzima

Sustrato

Especificidad

Productos finales

Alfa-amilasa

Almidón Glucógeno

Enlaces 1,4 alfaglucosídico

Oligosacáridos (6-7 moléc de glucosa, maltosa y alfa-dextrina)

No

hay

Maltasa Alfaglucosidasa Sacarasa

secreción

de

Maltosa Sacarosa

Lactosa Lactasa Dextrina Betagalactosidasa Alfa-dextrinasa Amilasa Almidón pancreática Glucógeno

carbohidrasas Glucosa

Enlace 1,4 alfaglucosídico Enlace 1,2 alfaglucosídico Enlace 1,4 betaglucosídico Enlace 1,6 alfaglucosídico Enlace 1,4 alfaglucosídico

Glucosa Fructosa Glucosa Galactosa Glucosa

Maltosa, maltotriosa, glucosa dextrina

Tabla 4. Localización y acción de las enzimas proteolíticas de mayor importancia. Órgano y secreción

Sustrato

Especificidad

Pepsina

Proteínas

Mezcla de polipéptidos

Quimosina Tripsina

Caseína Proteínas y polipéptidos Proteínas y polipéptidos Péptidos y proteínas Péptidos

-Fen/x-Tir/x-Fen/x-Lis/x-Arg/x-Fen/x-Tir/x-COO-terminal

Péptidos

Estómago

Páncreas (jugo Pancreático)

Intestino delgado (jugo entérico o mucosa intestinal)

Productos del desdoblamiento

Enzimas

Quimotripsina Carboxipeptidasa Aminopeptidasa Dipeptidasa

Dipéptidos

-NH3+ terminaldeterminados péptidos

p-caseína

Péptidos Aminoácidos y péptidos Aminoácidos y péptidos Aminoácidos

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III Los microorganismos del rumen y su actividad Dra. Juana Galindo Contenido Introducción.............................................................................................................................................................................32 Características generales del ambiente ruminal .......................................................................................................................33 El rumen como sistema de fermentación continua ..................................................................................................................33 Clases de microorganismos .................................................................................................................................................34

Características Generales de las bacterias del rumen ................................................................... 34 Grupos fisiológicos de bacterias del rumen ................................................................................... 35 Características Generales de los protozoos del rumen .................................................................. 38 Características Generales de los hongos del rumen ...................................................................... 40 Relación entre los microorganismos del rumen y el animal hospedero ...................................................................................41 Requerimientos nutricionales de los microorganismos del rumen...........................................................................................42 La dieta y su manipulación. .................................................................................................................................................43 Cantidad y frecuencia en el suministro de alimentos...........................................................................................................45 Cambios diurnos y estacionales...........................................................................................................................................46 Procesamiento de la dieta ....................................................................................................................................................46 Competencia entre protozoos y bacterias ............................................................................................................................47 Especie animal .....................................................................................................................................................................47 Edad.....................................................................................................................................................................................48 Fermentación microbiana de Nutrientes ..................................................................................................................................48 Fermentación microbiana de nutrientes en diferentes fuentes .................................................................................................48 Fermentación de fuentes energéticas ...................................................................................................................................48 Fermentación de compuestos nitrogenados .........................................................................................................................49 Fermentación de lípidos.......................................................................................................................................................50 Adaptación de bacterias a la dieta............................................................................................................................................51 Conclusiones............................................................................................................................................................................51

Introducción Los rumiantes ocupan una posición estratégica con respecto al hombre. En el proceso de digestión de los alimentos presentan particularidades en relación con el resto de los mamíferos, porque el rumen y el retículo, dos de los compartimentos pre estomacales, se encuentran habitados por millones de microorganismos, cuya acción enzimática hace posible la utilización de moléculas complejas. Estos animales, como vertebrados, no poseen enzimas capaces de atacar las uniones β 1,4 y 1,6 glucosídicas presentes en la celulosa y otros componentes que constituyen los carbohidratos estructurales de las paredes celulares de los vegetales. El conocimiento de las poblaciones de microorganismos del rumen, sus interacciones fundamentales y los productos finales de la fermentación constituyen la piedra angular de la fisiología digestiva de los rumiantes y posibilita su manipulación en función de obtener mejoras productivas. La presente conferencia tiene como objetivos presentar y discutir los aspectos básicos de la microbiología del rumen, las características de los microorganismos que habitan en ese reservorio, así como sus principales interacciones en el proceso fermentativo de nutrientes. Se prevé dotar a los estudiantes del tema de las herramientas necesarias para actuar y manipular, con conocimientos, los procesos fermentativos que se producen en el rumen.

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Características generales del ambiente ruminal El rumen es una gran cámara de fermentación, el que garantiza las condiciones necesarias para la existencia y reproducción de los microorganismos que lo habitan. Es el reservorio mas voluminoso del aparato digestivo de los rumiantes y representa del 70-75% del contenido total del tubo digestivo y del 50-60% de su volumen. En condiciones normales de manejo y alimentación, el contenido ruminal se mantiene relativamente constante y se caracteriza por • Concentración elevada de agua (85-90%) • Temperatura constante (39-40 º C) • Potencial de oxidación- reducción que varía entre –250 a –400mV. Este bajo potencial REDOX garantiza las condiciones de anaerobiosis necesarias para el desarrollo de los microorganismos. • PH generalmente comprendido entre 6-7, el que es regulado por varios factores, entre los que se pueden mencionar el aporte de bicarbonatos y fosfatos procedentes de la saliva, la cual posee un pH de 8.3. • Presión osmótica relativamente constante (290-320 mOsmol). • Aporte regular de nutrientes para los microorganismos y el animal hospedero, procedente de la ingestión de alimentos. • Eliminación continua de productos finales del metabolismo por absorción directa a través de las paredes del rumen o por pasaje hacia las partes bajas del tracto gastro intestinal y por la eructación. • Atmósfera relativamente constante de gases situados al nivel del saco dorsal. La fase gaseosa del rumen se compone principalmente de CO2, CH4, N2, H2S, e H2 Tabla 1. Composición de la mezcla de gases del rumen, % Gas

% de la mezcla

CO2 CH4 N2 O2 H2 H2 S

65.53 26.76 7.00 0.56 0.18 0.01

El rumen como sistema de fermentación continua El rumen es un sistema de fermentación continua en el cual están ingresando constantemente los alimentos frescos, solución nutritiva y saliva los cuales se mezclan con la masa que se encuentra en proceso de fermentación. Al mismo tiempo salen por el orificio retículo omasal líquidos, residuos de alimentos, productos finales de la fermentación y células microbianas en cantidades similares a las que ingresan. El volumen en fermentación se mantiene constante.

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Figura 1. Esquema del rumen

Clases de microorganismos El rumen normal de un rumiante adulto contiene una de las más variadas, densas y activas poblaciones microbianas conocidas en la naturaleza, la cual es responsable de la degradación de los principios nutritivos, al mismo tiempo que sintetizan proteínas, vitaminas y otros metabolitos útiles en la nutrición del animal hospedero. La población microbiana ruminal se encuentra integrada por bacterias, protozoos, hongos, bacteriófagos y ocasionalmente, levaduras. Estos mantienen estrechas inter- relaciones entre sí, tanto sinérgicas como mutualistas Características Generales de las bacterias del rumen 1. Forma y Representación de las bacterias del rumen Las bacterias constituyen la mayor y más diversa población microbiana que está presente en el rumen. El número total de bacterias del contenido del rumen, bajo condiciones normales de alimentación, es aproximadamente 109- 1010 ufc/ml. Se encuentran representadas por tipos morfológicamente variados: cocos, bacilos, vibrios, espirilos, espiroquetas, rosetas ovales y tetracocos. La forma y tamaño de las bacterias del rumen puede variar considerablemente en cultivos simples o en grupo de cepas, incluso si se observa en condiciones estrictamente uniformes, como en los trabajos con cultivos puros. Las bacterias del rumen son pleomórficas. Su tamaño oscila entre 0.1- 1 µ de diámetro y 1-3 µ de largo Las bacterias consiguen un ecosistema constante y permiten a los rumiantes el consumo de nutrientes inasequibles para otros animales. Por otra parte, también se establecen relaciones mutualistas entre los microorganismos del ecosistema ruminal. La mayoría de los microorganismos del rumen, específicamente las bacterias tienen relaciones de sinergismo, mutualismo o simbiosis.

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Tabla 2. Relaciones ecológicas entre microorganismos del rumen Nombre Neutralismo Comensalismo Sinergismo Mutualismo o simbiosis Parasitismo Depredación

Individuo 1º

Individuo 2º

0 + + + + +

0 0 + + -

Grupos fisiológicos de bacterias del rumen En dependencia de los sustratos que las bacterias pueden utilizar o fermentar, estas se han agrupado en: celulolíticas, hemicelulolíticas, amilolíticas, proteolíticas, fermentadoras de azúcares, bacterias que utilizan los ácidos, metanogénicas, lipolíticas, pectinolíticas, bacterias que sintetizan vitaminas, bacterias que utilizan aminoácidos como fuente de energía, y otras. Bacterias celulolíticas: Son las bacterias que producen el complejo de enzimas celulasas, que hidroliza la celulosa nativa u original. También pueden utilizar la celobiosa, disacárido que contiene el enlace beta. Gran número de bacterias celulolíticas son, también, hemicelulolíticas. Entre ellas se pueden citar Fibrobacter succinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Clostridium lochheadii, Ruminococcus albus y Ruminococcus Flavefaciens. Bacterias hemicelulolíticas: Son capaces de hidrolizar la hemicelulosa. Este compuesto se diferencia de la celulosa por contener pentosas, además de hexosas entre los azúcares que forman la molécula. Existen bacterias hemicelulolíticas que no son capaces de utilizar la celulosa. Butyrivibrio fibrisolvens, Bacteroides ruminicola y Lachnospira multiparus. Bacterias amilolíticas: Son bacterias que hidrolizan y digieren el almidón. Algunas bacterias amilolíticas son, también, celulolíticas, como por ejemplo Clostridium lockheadii, algunas cepas de Fibrobacter succinógenes, y Butyrivibrio fibrisolvens. Algunas especies no celulolíticas que digieren el almidón incluyen Streptococcus bovis, Bacteroides ruminicola, Succinomonas amylolytica y Bacteroides amylophilus. Muchas cepas de Selenomonas ruminantium también digieren el almidón. La población de bacterias amilolíticas se incrementa considerablemente cuando la dieta es a base de almidones. Bacterias proteolíticas: Son bacterias que hidrolizan las proteínas y las utilizan como fuente primaria de energía. Bacteroides amylophilus, Clostridium sporogenes, Bacillus licheniformis Bacterias sacarolíticas: Son las bacterias que utilizan los azúcares, mono y disacáridos. Muchas especies de bacterias celulolíticas, hemicelulolíticas, amilolíticas, proteolíticas, y otras, también son capaces de fermentar los azúcares. Bacterias lipolíticas: Son las bacterias capaces de utilizar e hidrolizar el glicerol en la molécula de grasa. También se encuentran en éste grupo los organismos que hidrogenan los ácidos grasos no saturados y los que metabolizan los ácidos grasos de cadena larga a cuerpos cetónicos. Bacterias metanogénicas: Son bacterias capaces de producir metano a partir de la reducción del dióxido de carbono o el ácido fórmico. Methanobacterium ruminantium. 35

Bacterias que utilizan los ácidos: A este grupo pertenecen las bacterias que utilizan diferentes ácidos orgánicos, como: láctico, succínico, málico, fumárico, oxálico. De forma general, estos ácidos no se producen en grandes cantidades en el rumen, aunque su concentración se encuentra relacionada, fundamentalmente con la dieta que reciben los animales. Bacterias que utilizan aminoácidos como fuente de energía: Son bacterias que incapaces de utilizar otra fuente de energía diferente a los aminoácidos. Generalmente se incluyen dentro de las bacterias proteolíticas. En las siguientes tablas se muestran las características morfológicas y fermentativas de algunas de las más importantes especies de bacterias del rumen. Como se observa, una misma bacteria es capaz de fermentar diferentes sustratos, aspecto éste que hace muy complejo el rumen como sistema ecológico.

Tabla 3. Características morfológicas y fermentativas de algunas bacterias del rumen Organismo

Morfología

Productos de fermentación

Sustrato

Fibrobacter succinogenes Butyrivibrio fibrisolvens

Bacilo Bacilo curvado

Celulosa Celulosa

Ruminococcus albus Clostridium lochheadii Ruminococcus Flavefaciens Clostridium polysaccharolyticum Bacteroides ruminicola Ruminobacter amylophilus Selenomonas ruminantium Succinomas amylolytica Streptococcus bovis Selenomonas lactilytica Megasphaera elsdenii

Coco Bacilo (espora) Coco Bacilo (espora) Bacilo Bacilo Bacilo curvado Bacilo ovalado Coco Bacilo curvado Coco

Succinato, acetato, formiato Acetato, formiato, lactato, butirato, H2 y CO2 Acetato, formiato, H2 y CO2 Acetato, formiato, butirato H2 y CO2 Acetato, succinato y H2 Acetato, formiato, butirato y H2

Viellonella párvula Lachnospira multiparus

Coco Bacilo curvado

Anaerovibrio lipolytica Eubacterium ruminantium

Bacilo Bacilo

Lactobacillus ruminis Lactobacillus vitulinus Methanobrevibacter ruminantium Methanomicrobium mobile Eubacterium oxidoreducens

Celulosa Celulosa Celulosa Celulosa y almidón Almidón Almidón Almidón Almidón Almidón Lactato Lactato

Bacilo Bacilo Bacilo

Formiato, acetato y succinato Formiato, acetato y succinato Acetato, propionato y lactato Acetato, propionato y succinato Lactato Acetato y succinato Acetato, propionato, butirato, valerato, coproato, H2 y CO2 Acetato, propionato y H2 Acetato, formiato, lactato, H2 y CO2 Acetato, propionato y succinato Formiato, butirato, lactosa y CO2 Lactosa Lactosa CH4 (de H2 + CO2 o formiato)

Azucares Azucares Metanógenos

Bacilo Bacilo

CH4 (de H2 + CO2 o formiato) Lactosa y H2

Metanógenos Aromáticos

Lactato Pectina Lipolitico Xilano

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Tabla 4. Algunas especies de bacterias que fermentan principios nutritivos en el rumen Celulolíticos Fibrobacter succinogenes Ruminococcus flavefaciens Ruminococcus albus Butyrivibrio fibrisolvens

Utilizadores de azúcar Treponema bryantii Lactobacillus vitulinus Lactobacillus ruminus

Pectinolíticos

Hemicelulolíticos Butyrivibrio fibrisolvens Bacteroides ruminicola Ruminococcus sp.

Utilizadores de ácidos Megasphaera elsdenii Selenomonas ruminantium

Utilizadores de lípidos

Butyrivibrio fibrisolvens Bacteroides ruminicola Lachnospira multiparus Succinivibrio dextrinosolvens Treponema bryantii

Anaerovibrio lipolytica Butyrivibrio fibrisolvens Treponema bryantii Eubacterium sp. Fusocillus sp.

Streptococcus bovis Amilolíticos

Micrococcus sp. Proteolíticos

Bacteroides amylophilus Bacteroides ruminicola Streptococcus bovis Succinimonas amylolytica

Bacteroides amyliphylus Bacteroides ruminicola Butyrivibrio fibrisolvens Streptococcus bovis

Productores de amoniaco Bacteroides ruminicola Selenomonas ruminantium Megasphaera elsdenii

Productores de metano Methanobrevibacter ruminantium Methanobacterium formicicum Methanomicrobium mobile

Ureolíticos

Succinivibrio dextrinosolvens Bacteroides ruminicola Selenomonas sp. Ruminococcus bromii Butyrivibrio sp. Treponema sp.

Fotos de algunas de las bacterias del rumen (extraído de Kaufmann) Rosetas

Rosetas y Selenomonas

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Cocos

Sarcinas

Características Generales de los protozoos del rumen Los protozoos fueron los primeros organismos que se descubrieron en el rumen, debido, fundamentalmente a su tamaño relativamente grande. Su tamaño oscila entre 38-195 micras de largo por 15-109 micras de ancho. De igual forma que las bacterias, requieren una temperatura de 39 a 40 0 C para vivir, ausencia de oxigeno, pH comprendido entre 5.5-8.0, con un rango optimo de 6.5-7.3 y un potencial de oxidación - reducción bajo. La mayoría de los protozoos del rumen son ciliados (aproximadamente 104 - 106 / g de contenido ruminal) y también se encuentran algunos flagelados (Ej.: Trichomonas spp, Monocercomonas. Sp y Chilomastix. Sp) están presentes en bajo número (103 - 104 / g). Aunque la clasificación de los ciliados no está determinada, es difícil refutar la existencia de dos grupos ciliados del rumen bien separados, los cuales fueron primeramente denominados: Holotricha y Entodiniomorfos El primer grupo incluye tres especies comunes: Dasytricha ruminantium, Isotricha prostoma, Isotricha intestinalis y algunos otros menos frecuentes. El segundo grupo contiene numerosos géneros juntos, todos incluidos en la familia Ophryoscolecidae (Entodinium, Diplodinium, Ostracodinium, Eudiplodinium, Epidinium, Epiplastron, Opisthotrichum, Ophryoscolex, Elytroplastron, Polyplastron, entre otros). Las evidencias experimentales han sugerido que los protozoos pueden afectar la velocidad de crecimiento del animal, la digestibilidad de la ración, la calidad y cantidad de la proteína microbiana disponible en el intestino. Los mayores cambios observados en la ausencia de protozoos del rumen parece ser un incremento en el número de bacterias ruminales y una ligera disminución en la digestibilidad del rumen

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Los estudios comparativos que se han efectuado entre animales faunados y defaunados han demostrado que los ciliados no solamente contribuyen a los procesos metabólicos en el rumen sino además sugiere que los protozoos son capaces de modular las características físicas químicas del ecosistema. También se ha demostrado que la presencia de protozoos influye en el volumen del rumen, la retención de la digesta, la composición y actividades de la población microbiana presente, las concentraciones y proporciones de productos finales de la fermentación microbiana y en el pH ruminal. Los cambios en uno de estos parámetros pueden influir en la función ruminal y como consecuencia, la digestión ruminal de proteína dietética y la materia orgánica y fibra son mayores en animales faunados. Por otro lado, la síntesis de proteína microbiana neta y el flujo de proteína a las partes bajas del tracto gastrointestinal se reducen cuando los protozoos están presentes en el rumen. La defaunación ofrece el potencial para mejorar la eficiencia de la ganancia de peso vivo y la producción de leche. El impacto de la presencia o ausencia de los protozoos ciliados del rumen para el hospedero puede depender de la dieta y del número y especie de ciliados presentes. En animales alimentados con dietas bajas en proteína los protozoos ciliados aparentemente tienen un efecto negativo en el crecimiento y en el desarrollo. Sin embargo, en animales alimentados con dietas ricas en granos, los protozoos ciliados pueden tener un papel beneficioso, debido a su habilidad de influir en la degradación ruminal del almidón y en el metabolismo del ácido láctico. La presencia de protozoos ciliados en animales alimentados con dietas en granos está asociada con una disminución de la acumulación y fermentación del ácido láctico. Debido a su influencia en la acumulación de lactato ruminal, existe la hipótesis de que los protozoos ciliados juegan un papel importante en la moderación de la fermentación ruminal en rumiantes alimentados con dietas ricas en grano. La defaunación frecuentemente resulta en una disminución en la producción de AGCC. Esto está de acuerdo con resultados obtenidos en la digestión de materia orgánica en el rumen. La desaparición de los protozoos está generalmente asociada con una disminución en la proporción de ácido butírico y la disminución de la concentración de N - NH3 en el rumen. Los Entodiniomorfos, por el contrario a Holotrichas, metabolizan el ácido láctico y limitan el riesgo de acidosis causado por el consumo excesivo de carbohidratos de fácil fermentación (almidón, azúcar) La baja actividad metanogénica que se observa después de la defaunación del rumen, disminuye las pérdidas de energía y se puede considerar beneficiosa para los animales productores de leche o carne que presentan un potencial de producción alto Los protozoos pueden transformar las toxinas que están presentes en los alimentos. Los animales defaunados son además sensibles a la toxicidad por cobre. Estos grupos microbianos mejoran la formación de sulfito de cobre que no puede ser absorbido en el tracto digestivo. Fotos de algunos integrantes de la población de protozoos del rumen (a Galindo, 2004) Diplodinium spa

Dasytricha ruminantiuma

Isotricha prostoma

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Características Generales de los hongos del rumen Los hongos anaerobios son el grupo más recientemente reconocido de los microorganismos del rumen, ya que primeramente eran incluidos como protozoos flagelados. Con el desarrollo de las investigaciones en microbiología del rumen, así como la inclusión de las técnicas de microscopia electrónica, se pudo demostrar que ciertas células flageladas que parecían ser protozoos eran, en efecto, zoosporas de hongos. Son organismos anaerobios estrictos que ataca, colonizan y crecen sobre fragmentos fibrosos de las plantas, por lo que son activos microorganismos celulolíticos. La magnitud de la degradación de la celulosa de los hongos del rumen sobre tiras de papel de filtro es de aproximadamente 60%. Las celulasas extracelulares de los referidos hongos atacan rápidamente los fragmentos de las plantas en el rumen y a las 2-3 horas ya tienen invadido el tejido vascular del vegetal. A las 3 horas se detectan en el tejido mesófilo y posteriormente el crecimiento es mayor con producción de esporangio. Debido a la forma de crecimiento de los hongos, penetran dentro de los tejidos vegetales hasta zonas que normalmente resultan inaccesibles a las bacterias. Inicialmente todos los hongos anaerobios aislados del rumen fueron de tipo monocéntrico. Existen tres géneros de hongos anaerobios monocéntricos: Caecomyces (Sphaeromonas), Neocallimastix y Piromyces (Piromonas), cada uno de estos géneros contienen numerosas especies. Los hongos existen en el rumen como zoosporas y esporangios. La creencia de que los hongos anaerobios son de importancia considerable para la nutrición de rumiantes está basada en la habilidad demostrada para colonizar paredes celulares lignificadas y para debilitar los tejidos fibrosos de las plantas en el rumen, así como en la degradación de los componentes estructurales de la pared celular de las mismas y la fermentación de los monosacáridos resultantes (fructosa, glucosa, xilosa) Estudios “in vitro” han demostrado que los hongos degradan extensivamente la fibra de las plantas en cultivos puros. Ellos producen un amplio rango de enzimas que degradan la fibra, muchas de las cuales son extracelulares. Los hongos anaerobios poseen endoglucanasas, exoglucanasas (incluyendo celobiohidrolasas) y β - glucosidasas las cuales actúan para degradar la celulosa (el mayor componente de la fibra) eficientemente. La hemicelulosa, el segundo mayor componente de la fibra, se degrada por β - xilanasas y β xilosidasas. La lignina, el tercer componente mayor de la fibra, es atacada por enzimas tales como 40

feruloil y curamoil esterasas que actúan para separar carbohidratos fermentables de la lignina más que para degradar la lignina extensivamente. Los hongos también tienen el potencial de contribuir al suministro de proteína al animal hospedero. Las células de los hongos están compuestas de proteínas con una combinación bien balanceada de aminoácidos las cuales son altamente digestibles y disponibles al animal hospedero. Relación entre los microorganismos del rumen y el animal hospedero El animal rumiante y aquellos microorganismos que viven en su tracto digestivo, particularmente el rumen, son un ejemplo excelente de mutualismo. El animal provee un nicho ambientalmente favorable, con un suministro continuo de alimentos y remoción de productos finales. Por su parte los microorganismos (bacterias, protozoos y hongos) proveen un servicio digestivo o función que proporciona grandes cantidades de energía disponible al animal hospedero la cual no puede obtenerse a través de sus propios procesos digestivos. Si los protozoos del rumen fueran meramente comensales entonces ni el hospedero ni los protozoos podrían ser beneficiados o dañados por la asociación. Sin embargo el hospedero se beneficia de la habilidad degradativa de los protozoos y estos satisfacen a través del hospedero sus requerimientos específicos para el crecimiento y multiplicación. Esto incluye un amplio rango de temperatura, pH, alimento, bajo potencial Redox, bacterias vivas. Los protozoos del rumen pueden ser considerados como simbiontes dependiendo del animal hospedero y otros microorganismos del rumen. El hecho de que las bacterias del rumen y posiblemente los hongos puedan proveer actividades metabólicas similares para el animal hospedero no afecta su clasificación. La información sobre la interrelación entre hongos y protozoos en el rumen es limitada. Las zoosporas individuales de hongos pueden ser ocasionalmente engolfadas por los protozoos ciliados del rumen. Es conocido que la defaunación conduce a una mayor población de hongos, aunque este incremento no es siempre significativo. El mecanismo por el cual la defaunación incrementa la población de hongos podría ser una reducción en el recambio de las proteínas de los hongos en el rumen, pero esta actividad predatoria es mucho menos aparente con hongos que con bacterias ruminales. La quitina, un componente común en la pared celular de los hongos, es un polisacárido formado por N – acetil – D – glucosamina y es extremadamente resistente a la degradación por microorganismos. La hidrólisis completa de la quitina se produce por un sistema quitinolítico, que consiste en dos hidrolasas, cuyas acciones se efectúan de manera consecutivas. La degradación de células de hongos. Diferentes investigaciones han demostrado que los protozoos del rumen poseen un sistema quitinolítico con actividad quitinasa y N – acetil - β - D- glucosaminidasa. Por otra parte la proteína fúngica parece, en parte, ser usada por los protozoos para construir sus propios componentes. Los ciliados del rumen engolfan bacterias, algunas veces selectivamente, con velocidades de consumo máximo de aproximadamente 105 bacterias / protozoos / hora. La velocidad de consumo bacteriano es especie dependiente y está influenciada por la densidad de la población bacteriana, la forma física de la bacteria, el estado nutricional de los protozoos y factores ambientales tales como el pH y concentraciones de sal.

41

Los protozoos engolfan las bacterias mediante vesículas citoplasmáticas y la mayoría son matadas y digeridas con alguna liberación de productos de la digestión en el medio. La actividad predatoria de los protozoos reduce el tamaño de la población bacteriana ruminal y puede influir en las proporciones relativas de los tipos de bacterias presentes. Por ejemplo, el número de bacterias celulolíticas incrementa en animales faunados mientras que el número de bacterias amilolíticas desciende. Requerimientos nutricionales de los microorganismos del rumen Los microorganismos del rumen, como todo organismo vivo, tienen requerimientos energéticos, proteicos y factores de crecimiento para la síntesis de protoplasma celular. Como fuente de energía, puede ser capaz de utilizar una gran variedad de carbohidratos, desde azúcares simples como la glucosa y la fructosa, hasta los más complejos como el almidón, la celulosa, pectina y hemicelulosa. Sin embargo, esto no significa que todas las bacterias sean capaces de utilizar todos los carbohidratos, sino que por lo general, cada bacteria tiene sus requerimientos específicos. Como fuente de nitrógeno, las bacterias son capaces de utilizar desde el nitrógeno no proteico, pequeños péptidos, aminoácidos y hasta proteínas. La posibilidad de utilizar fuentes de NNP para la síntesis de proteína microbiana es uno de los aspectos más importantes del metabolismo nitrogenado de los microorganismos del rumen. Muchas bacterias del rumen, fundamentalmente celulolíticas, requieren preferentemente amoníaco en relación a los aminoácidos o péptidos. Tabla 5. Factores nutricionales de los microorganismos del rumen ENERGIA as las fuentes energéticas en ser utilizadas por las erias: 9 glucosa, fructosa, sacarosa, xilosa, celobiosa, celulosa, almidón, glicerol, dextrana, lactato, pectina, etc.

NITRÓGENO 9 proteínas, 9 aminoácidos, 9 péptidos, 9 amoníaco

FACTORES DE CRECIMIENTO 9 9 9 9

AGCC: acetato, butirato, isovalérico, metilbutírico, caproico. Minerales: Mg2+, Ca2+, K+, Na+, PO4, Mn2+, Co, S, Hemina, etc. Vitaminas: biotina, p- aminobenzoico, tiamina, piridoxina, ácido pantoténico, etc. Otros: Factores no identificados

Entre los aminoácidos requeridos por las bacterias del rumen se encuentran los aminoácidos ramificados y los sulfurados, como la tirosina, metionina, y la cisteína. Esto se debe a la imposibilidad de sintetizar la cadena ramificada o sulfurada para la síntesis de novo de los aminoácidos. Otros compuestos requeridos por las bacterias del rumen, se agrupan bajo el nombre genérico de factores de crecimiento. Entre estos se encuentran los ácidos grasos de cadena corta, AGCC, algunos minerales, vitaminas del complejo B y otros factores no identificados y que se encuentran en el líquido ruminal clarificado. Los AGCC mas utilizados por las bacterias son el acético y los de cadena ramificada. Estos últimos son el resultado de la fermentación de las propinas y su importancia en la nutrición microbiana se debe a que las bacterias sintetizan sus aminoácidos a partir de estos y el amoniaco.

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Los minerales y las vitaminas, principalmente del complejo B, participan como co- factores enzimáticos en numerosas reacciones catabolizadas por las enzimas. Se ha demostrado que la inclusión en la ración para rumiantes de productos microbianos que contengan estas vitaminas, activa el crecimiento microbiano.

Factores que afectan la población de microorganismos del rumen. Existen muchos estudios acerca del desarrollo de la mejor población microbiana ruminal y los factores que controlan su balance. Algunos de estos factores están ligados a la fisiología de diferentes especies (máxima velocidad de crecimiento, afinidad por el sustrato, energía metabólica, resistencia a pH ácidos y compuestos tóxicos, habilidad para adherirse a las partículas de la planta, etc). Esto depende del hospedero y su alimento (composición de la dieta, frecuencia de comidas, cantidades ingeridas, aditivos del alimento, forma en la cual el alimento es presentado, etc.) y de la naturaleza de las relaciones establecidas entre las diferentes poblaciones durante la evolución, como la competencia, el sinergismo, la predación, el mutualismo, etc.). Generalmente se acepta que los principales factores que modifican la población de microorganismos del rumen son: • • • • • • •

La dieta y su manipulación Cantidad y frecuencia en el suministro de alimentos Cambios diurnos y estacionales Procesamiento de la dieta Competencia entre protozoos y bacterias Especie animal Edad

Existen otras variables, que pudieran ser factores, las que también influyen en el número y representación de especies microbianas, entre estas tenemos: El consumo y su velocidad, la selectividad al pastar, la fertilidad del suelo, la situación geográfica, el clima. Estos influyen en la cantidad y calidad de nutrimento que se ofrecerán a los microorganismos del rumen. La dieta y su manipulación. Uno de los principales factores que influyen en la población de microorganismos del rumen es la variabilidad de los componentes de los alimentos. Por otro lado, el tipo de carbohidratos preponderante en la dieta produce una fermentación característica, que a su vez influirá en la clase de microorganismos que se desarrollaran. Por ejemplo, las dietas ricas en carbohidratos solubles como las mieles presentaran una población mayor de protozoarios de los diferentes géneros y en total que las dietas de concentrados ricas en almidón. Las bacterias se presentan en menor cantidad en aquellas dietas que en las de concentrados. La presencia de grandes cantidades de almidón produce una rápida fermentación, lo que provoca un descenso rápido del pH. Este descenso ocasiona la muerte de los protozoarios. Esto afecta a las bacterias celulolíticas, y aumentan las amilolíticas. Sin embargo, se ha encontrado que la inclusión de 43

almidón en dietas fibrosas mejora el desarrollo de la población microbiana hasta cierto límite. Mas adelante, analizaremos esta respuesta cuando se estudie la celulolisis ruminal. Otro aspecto importante a señalar es que no solamente cambia la relación protozoo / bacterias, sino que también cambian las proporciones en que se encuentran los diferentes géneros protozoarios y especies de bacterias que se involucran en el proceso. La suplementación con proteínas, en dietas bajas en este nutrimento, también modifica la población microbiana ruminal. Las dietas ricas en azúcares como la caña deprimen la población de bacterias celulolíticas ruminales. A esto se une el hecho de que este alimento presenta un bajo contenido en proteína. Sin embargo, cuando se utilizan diferentes estrategias de suplementación a partir de suplementos activadores de la fermentación ruminal (SNA), en el cual se mantenga la relación NNP/PV adecuada, se incrementa la población y actividad de las bacterias celulolíticas. Este efecto, se obtiene, igualmente, a partir de una adecuada suplementación con leguminosas, entre ellas, Leucaena leucocephala El efecto depresivo que producen los azúcares en la representación de bacterias celulolíticas ruminales se demostró cuando se alimentaron a vacas Holstein con niveles de 20 y 30 l de guarapo. Esto se debe a la alta tasa de fermentación que presenta esta dieta, donde predominan microorganismos sacarolíticos, con una alta depresión de la flora celulolítica. Es evidente que niveles bajos como 10 l de guarapo producen un efecto activador de la referida flora microbiana. Tabla 6. Efecto de diferentes formas de suplementación bacterias celulolíticas ruminales

nitrogenada en la población de

Alimento

Bacterias celulolíticas, 10 –5 (ufc/ml)

Caña sin suplementar Caña + SNA-77 Caña + SNA-77 + Heno Caña + SNA-77 + 2.5% Forraje verde Caña + SNA-77 + 5% Forraje verde Caña + SNA-100% (NNP/PV =100:0) Caña + SNA- 85% (NNP/PV = 85:15) Caña + SNA-70% (NNP/PV = 70:30) Caña + King grass Caña + King grass + Leucaena leucocephala Caña biofermentada, 50% en pienso Caña biofermentada, 70% en pienso Caña biofermentada, 90% en pienso

0.5 1.56 2.45 18.4 15.6 97.7 97.3 101.7 13.1 416.7 131.6 133.9 50.0

SNA. Suplemento nitrogenado activador de la fermentación ruminal

Tabla 7. Efecto del nivel de guarapo en los principales grupos de bacterias del rumen Nivel de guarapo, % Medida (ufc/ml)

Bacterias celulolíticas, 10-6 Hongos celulolíticos, 10-6 Bacterias totales viables, 10-11

0

0.62ab 0.19 1.43

10

0.83a 0.15 0.93

20

0.41b 0.37 0.84

30

0.20b 0.40 0.85

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La suplementación con fuentes que aporten minerales propicia un mejor equilibrio microbiano en el rumen, debido a que los microorganismos requieren de minerales tales como K, Mg, Mn, Cu, Na, P, entre otros para su crecimiento y el desarrollo de los numerosos procesos fermentativos. Las zeolitas naturales son minerales que pertenecen al grupo de los alúmino silicatos y en su micela presentan iones minerales, que en el ambiente ruminal se intercambian tonel ión NH4. Este efecto incrementa la población de bacterias celulolíticas y reduce las proteolíticas, amilolíticas y protozoos, lo cual mejora la utilización digestiva de los nutrientes en los animales rumiantes. Tabla 8. Efecto del complejo mineral Zeolita en la población de bacterias del rumen Medida

Ensilaje

Ensilaje + 1% Zeolita

28.7

19.8

6

12.8

20.3

6

3.7

1.6

43.8

14.7

21.8

17.1

Bact. Viables totales, 1011 ufc/ml Bact. celulolíticas, 10 ufc/ml Bact. amilolíticas, 10 ufc/ml 6

Bact. proteolíticas, 10 ufc/ml 6

Protozoos totales, 10 cel/ml

El empleo de antibióticos como manipulador de la población de microorganismos en el rumen es otra práctica que se ha empleado en diferentes paíse, aún cuando en la acualidad numerosos países prohíben su uso debido a efectos residuales en los productos agropecuarios. Los antibióticos ionóforos en general, y el monensín en particular es capaz de reducir la población de bacterias metanogénicas y la producción de metano en el rumen. Con ello mejora el metabolismo energético de los rumiantes que lo consumen al reducir las pérdidas dee neregía por concepto de emisión de metano al ambiente. Al mismo tiempo se reduce la población de protozoos ruminales, pero peligrosamente también se deprime la población de bacterias celulolíticas Tabla 9. Efecto del Monensín en la población de bacterias viables totales, celulolíticas y metanogénicas del rumen Tratamientos Saccharina + monensín Forraje + monensín Almidón + monensín Saccharina Forraje Almidón EE±

Bacterias totales viables, 10-9ufc/ml 1.11bc 1.08c 1.51ab 1.34bc 1.37bc 1.77a 0.13**

Bacterias metanogénicas, Bacterias celulolíticas 10-6/ml 10-6/ml 0.73c 0.71c 0.83c 1.07b 1.50a 1.41ab 0.12***

0.13b 0.16b 0.05c 0.44a 0.18a 0.09c 0.15*

Cantidad y frecuencia en el suministro de alimentos La cantidad y frecuencia en el suministro de alimentos se ha encontrado que afecta a la población microbiana. La alimentación una vez al día produce grandes disminuciones en el pH y en los conteos de protozoos y bacterias. Por el contrario, un suministro de pequeñas cantidades varias veces al día, produce

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variaciones mas pequeñas, puesto que el rumen se asemejara mas a al modelo de fermentación continua que se presento a inicios de esta conferencia. Cambios diurnos y estacionales Los cambios diurnos y estacionales que se presentan en la población de microorganismos del rumen están basados, principalmente, en la entrada y salida de alimento. Cuando los animales se someten a un ayuno prolongado y se les suministra de nuevo alimentos, se observa, inicialmente, un incremento en el número de protozoos y bacterias, las cuales se multiplican rápidamente. A las 2 horas del suministro de alimento se observan los mayores conteos de protozoos y de las 4 a 6 horas el de las bacterias, cuando la alimentación es una vez al día. Los cambios estacionales que se presentan en nuestro clima afectan la población de microorganismos debido a los cambios en la calidad del alimento, principalmente, por deficiencia en le aporte proteico de las dietas. Si se suplementa en estos momentos con un nivel adecuado de nitrógeno, las variaciones debidas a la estación disminuirán y pueden desaparecer. Un ejemplo de efecto de las condiciones climáticas en la población de bacterias ruminales es el hecho demostrado que, bajo las condiciones edafo climáticas de Cuba, los animales rumiantes presentan en el rumen una flora microbiana capaz de degradar la mimosina, aminoácido tóxico presente en la leguminosa Leucaena leucocephala y el dihidroxipiridona (DHP), metabolito igualmente tóxico que se libera de la hidrólisis de la mimosina en el rumen. Esto posibilita que nuestros animales no corran riesgo de intoxicación cuando consumen esta planta. Tabla 10. Presencia de bacterias que degradan la mimosina y el DHP en diferentes especies de rumiantes Animal

Dieta

mimosina

3,4- DHP

2,3-DHP

Toro Carnero Vaca Carnero Carnero Carnero Carnero Cabra

Forraje+ 30% Leucaena Forraje+ Saccharina Caña +50% Leucaena Heno Heno:Leucaena(80:20) Heno:Leucaena(60:40) Heno:Leucaena(40:60) Pasto +50% Leucaena

24.0 1.67 7.0 1.67 12.0 2.0 4.0 2.1

24.0 1.67 40.0 2.0 0.67 1.30 3.30 1.8

3.6 1.5 17.0 3.0

Dilución 105 105 106 105 105 105 105 106

Los microorganismos ruminales tienen importancia como biodegradadores de compuestos xenobióticos, contaminantes ambientales debido a su gran capacidad metabólica. Esta potencialidad está siendo estudiada actualmente para su aplicación de forma controlada en procesos de biodegradación de contaminantes industriales. Procesamiento de la dieta El procesamiento de la dieta, también influye en la población ruminal. El molido, peletización y desecación de los forrajes produce una disminución de los protozoos y, en ciertos casos, pueden llegar a su eliminación total. Estas disminuciones se han planteado se deben a un aumento en el pasaje del contenido ruminal, un incremento en la fermentación con aumento de la acidez que atenta contra el desarrollo de los 46

protozoos. Por lo regular, las bacterias se ven menos afectadas por estos procesamientos y en ocasiones se ven incrementadas en numero. Sin embargo, se plantea que existen variaciones en los grupos fisiológicos que se establecen en un momento dado. En el caso de los almidones sucede algo parecido a lo que ocurre con los materiales fibrosos. El hacer del grano hojuelas, molerlo, peletizarlo o cocerlo, provoca un aumento de la fermentación. Esto trae consigo la desaparición de los protozoos y el aumento de bacterias. Competencia entre protozoos y bacterias El número de bacterias en los animales defaunados es mayor que en los que presentan fauna. Esta diferencia puede ser debida a la competencia por los nutrientes o al consumo de bacterias por los protozoos. También se señala que los protozoos realizan una selección de las bacterias que ellos ingieren. Esto hace disminuir y en algunos casos desaparecer las especies de las cuales se alimentan. El empleo de árboles y arbustos de leguminosas para manipular la fermentación microbiana ruminal y producir efecto defaunantes, es una práctica que ha tomado auge en los últimos años. Gliricidia sepium es uno de los arbustos de mayor empleo con estos propósitos. Reduce la población de protozoos ruminales e incrementa el número de bacterias y hongos celulolíticos ruminales. Las razones se encuentran en la presencia de metabolitos secundarios, fundamentalmente taninos condensados. Tabla 11. Efecto de Gliricidia sepium como defaunante su relación con otros grupos microbianos ruminales Medida

Niveles de G. sepium

Bacterias viables totales, 1011ufc/ml Bacterias celulolíticas, 106 ufc/ml Hongos celulolíticos, 106uft/ml Protozoos, 105 cel/ml AGV, mmol/ml Ácido acético, mmol/ml Ácido propiónico, mmol/ml Ácido butírico

0

15

30

EE±

70.791 6.31a 7.41a 45.71c 101.89 74.99 12.23 9.61

79.43 7.94a 8.34a 11.22b 103.64 78.08 16.36 9.20

26.92 13.90b 15.53b 2.57a 110.42 82.40 13.68 10.76

0.42 0.14* 0.29* 0.09*** 5.04 3.86 2.11 0.72

Especie animal El efecto de la especie y la raza de los rumiantes se ha encontrado que produce variaciones en la cantidad y especies de microorganismos presentes en el rumen. Estas variaciones parecen deberse a la cantidad y calidad del alimento que los diferentes rumiantes encuentran normalmente en su hábitat, lo cual produce especies mas adecuadas a las condiciones que se encuentran en el rumen. También se han señalado variaciones entre la población protozoaria del Cebú y su cruce con la Parda Suiza Brown Swiss). Diferencias, principalmente en la población protozoaria, se han encontrado entre el camello, el Suni el Antílope y otros rumiantes salvajes.

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Edad La edad es otro de los factores que afecta la población de microorganismos del rumen. Los terneros de pocos días de nacidos tienen escaso desarrollo en el rumen y la población que aparece son organismos capaces de utilizar la leche, único alimento que consumen. Entre los microorganismos más numerosos en esta etapa se encuentran los Lactobacillus y Streptococcus, grandes productores de ácido láctico, el que mantiene un pH muy bajo. En esta edad no están presentes los protozoos, los que se establecen mas tarde, cuando el consumo de alimento fibroso se incrementa y por el contacto con otros animales adultos o que tienen una fauna establecida. Al transcurrir el tiempo y entrar en contacto con alimentos fibrosos se desarrolla el rumen, aumenta el pH, comienza la aparición de los diferentes grupos fisiológicos de bacterias y se establecen los protozoos. 20 bacterias viables totales(10 ufc/ml

15 10 5 0

7

28

56

84

Figura 2. Efecto de la edad en la población de bacterias viables terneros, días

Fermentación microbiana de Nutrientes Los microorganismo al actuar sobre los nutrientes producen como resultado, producen como resultado de su metabolismo diferentes productos finales, los cuales son muy variados, según la naturaleza de los sustratos y de las especies de bacterias y protozoarios presentes. En la tabla se muestran de una forma esquemática las principales transformaciones que ocurren. Tabla 12. Fermentación microbiana de nutrientes en diferentes fuentes Fuentes

Sustratos

Energéticas

• • •

Carbohidratos de fácil fermentación Carbohidratos estructurales Lípidos

Proteicas

•

Proteínas, Péptidos y Aminoácidos

Productos Finales AGCC, ácido láctico y gases AGCC y gases Saturación de los no saturados, lípidos para la síntesis de membrana celular AGCC, NH3 y gases

Fermentación de fuentes energéticas De acuerdo con el sustrato prevaleciente en el alimento, los microorganismos producirán diferentes cantidades de AGCC y además, variaran sus proporciones relativas. En las dietas que presentan grandes cantidades de almidón, como son los concentrados energéticos, se observa un pH mas bajo, el cual es consecuencia de un rápido ataque microbiano al almidón, que produce ácido láctico, y AGCC. El ácido láctico, cuando los animales se adaptan previamente, se 48

presenta en pequeñas cantidades debido a que se desarrolla una microflora que es capaz de utilizar este ácido en la misma magnitud que se produce. Si los animales consumen dietas ricas en materiales fibrosos, que contienen grandes cantidades de material estructural, el pH del rumen es mas elevado. Estos componentes son atacados por las bacterias celulolíticas mas lentamente y la cantidad de ácidos formados, es también inferior. Las dietas ricas en azucares como las mieles y el jugo de cana presentan valores intermedios de pH, así como a la cantidad de ácidos formados. En esta dieta, los carbohidratos que abundan son los monos y disacáridos, los cuales son también rápidamente fermentados, pero el pH no desciende rápidamente. esto tal vez sea motivado por el hecho de que la formación de ácido láctico no es muy grande y o que la liberación de amoniaco procedente de la urea neutralice además los ácidos formados, conjuntamente en un patrón de consumo intermitente. Consecuentemente, la cantidad de carbohidratos que entran al rumen no es grande por unidad de tiempo. Resultan también importantes las diferentes proporciones de ácidos grasos individuales que se forman en las dietas. La dieta de concentrado presenta una proporción de ácido propicio alta, si se compara con las otras, y bajos valores de ácido acético y butírico. Por esta razón, el patrón de fermentación de una dieta rica en concentrado se acostumbra a decir que es alto en propiónico y bajo en acético. El heno y los alimentos fibrosos presentan un pH alrededor de 7, una producción de AGCC baja con altas proporciones de ácido acético, compensada con bajas proporciones de ácido propiónico y butírico. Por otro lado, las mieles presentan un patrón de fermentación intermedio, con pH cercanos al neutro, producción de AGCC intermedia entre los dos anteriores y se caracteriza porque es alta la proporción de ácido butírico. Tabla 13. Efecto de la dieta en el pH y patrón de fermentación ruminal % molar Dieta Concentrado Heno Miel/urea

pH 6.16 7.10 6.66

AGCC, acético propiónico butírico Isob. meq/l 157 82.0 132

44.9 76.0 49.7

42.8 15.0 21.3

5.83 7.46 25.7

1.83 0.41 0.30

Val. Isov. Cap 2.24 0.29 2.81

2.03 0.39 0.26

0.73 0.00 0.79

Fermentación de compuestos nitrogenados La fermentación de los compuestos nitrogenados en el rumen es muy complejo y en el intervienen gran numero de especies microbiana. La proteína y la urea u otra fuente de NNP que entra al rumen se degradan a NH3. La concentración de aminoácidos libres en el rumen es relativamente baja debido a que los mismos son desanimados. Las proteínas se degradan con una rapidez variable, en dependencia de su estructura y solubilidad y en el proceso de proteolisis intervienen bacterias, protozoos y hongos. Alrededor del 38% de las bacterias

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viables totales, aisladas del rumen de bovinos, son proteolíticas, lo cual puede variar en dependencia de la fuente de energía y proteína dietética. Bacteroides amylophilus, Selenomonas ruminantium y Bacteroides ruminicola son la bacterias de mas alta actividad proteolítica en el rumen. Otras bacterias proteolíticas de interés son, Streptococcus bovis, Sphaerophorus hypermegas y Peptostreptococcus sp. La actividad proteolítica no es la acción aislada de una sola especie microbiana, sino que existe sinergismo y relaciones estrechas entre las diferentes especies, lo cual se ha demostrado en los estudios que se han efectuado en cultivos puros, donde la actividad proteolítica es menor. La urea que se utiliza para suplir total o parcialmente la proteína verdadera, se hidroliza rápidamente a amoniaco y agua., sin embargo, en el rumen se han encontrado relativamente pocas especies de bacterias eminentemente ureolíticas, lo cual indica que la ureasa puede ser inducida en algunos grupos microbianos cuando la urea esta presente en el medio de fermentación. Tabla 14. Efecto de la urea en el pH y concentración de amoníaco ruminal Dieta pH ruminal N-NH3 ruminal (ppm)

Heno Heno c/urea Heno-maíz 7,3 35,4

7,2 110,6

7,0 1,7

Heno-maíz c/urea

Heno alfalfa

6,2 2,1

6,7 26,8

Heno alfalfa c/urea 6,8 27,3

Fermentación de lípidos Los lípidos, al entrar en el rumen sufren un proceso de hidrólisis debido al ataque microbiano a la molécula de grasa. Una vez liberados los ácidos grasos, estos sufren un proceso de hidrogenación, si no se encuentran saturados, que comienza siempre por los ácidos grasos que tienen un grado mayor de instauración, del modo siguiente Cx3 Cx2 Cx1 Cx0 En los forrajes se encuentran numerosos lípidos, los que se encuentran formando parte de las membranas de los cloroplastos, con un alto contenido de lípidos no saturados. En el proceso de hidrogenación de los ácidos grasos polinsaturados y monoinsaturados intervienen algunas cepas de Butyrivibrios, una cepa de Ruminococcus albus, dos cepas de Eubacterium sp, dos Fusocillus, un micrococo y Treponema sp Ventajas de la hidrogenación de ácidos grasos • • •

Aumenta el crecimiento bacteriano, ya que los ácidos grasos insaturados provocan cambios en la permeabilidad de las membranas microbianas Se reduce la producción de metano al haber menor cantidad de hidrógeno Aumenta la energía disponible, ya que los ácidos grasos saturados liberan más energía al oxidarse que los ácidos grasos insaturados.

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Anaerovibrio lipolytica es responsable de la hidrólisis de los triglicéridos, aunque ataca los galactolípidos directamente. Butyrivibrio fibrisolvens, bacteria eminentemente celulolítica, también interviene en la hidrólisis de los fosfolípidos, en la hidrogenación de los ácidos grasos polinsaturados y en la producción de butirato a partir de la interconverción del acetato en butirato. Adaptación de bacterias a la dieta Como se estableció anteriormente, los microorganismos que viven en el rumen son capaces de utilizar diferentes fuentes de carbohidratos y muchos son capaces dos o tres de esas fuentes. Un cambio de dieta, por ejemplo, de forraje o concentrado, es decir de una dieta de lenta fermentación ruminal a una de carbohidratos fácilmente fermentables, produce una acción rápida por parte de los microorganismos. Esos, atacaran rápidamente el concentrado y se desarrollaran mejor las bacterias amilolíticas. El gran desarrollo de estas bacterias producirá suficiente ácido, capaz de descender el pH del ruminal. Estos cambios pueden ser tan violentos que produzcan disturbios digestivos como la acidosis y timpanismo, que pueden llegar a ocasionar la muerte del animal. Si el cambio de dieta se hace lentamente y se aumentan las cantidades de alimento nuevo a introducir diariamente, los cambios en la población microbiana ruminal no serán tan bruscos. De esta forma se podrán desarrollar no solamente los microorganismos que utilizan las nuevas fuentes de energía, sino que también la de los microorganismos que utilicen parte de los ácidos orgánicos. Estos no permitirán que se acumule una cantidad que provoque intoxicación en el animal Conclusiones Como se ha podido apreciar, el rumen- retículo constituyen pre estómagos del aparato digestivo de los rumiantes en los cuales se produce un proceso de fermentación anaeróbica como resultado de la variada flora microbiana que lo habita. Los productos finales de la fermentación de estos microorganismos contribuyen de manera importante a la nutrición del animal hospedero. Conocerlos reviste una gran importancia debido a que se puede actuar sobre ellos y modificarlos para obtener mejoras productivas. Bibliografía a consultar • • • •

The rumen and its microbes. Hungate, R.E. 1966. New York: Academic Press. Book The roles of protozoa and fungi in ruminant digestion Editors. Armidale, NSW. 2351, Australia: Penambui Books The rumen bacteria of animal fed on a high molasses urea diet. Elías, A. 1971. Thesis Ph.D. Aberdeen. UK. Efecto de la Zeolita en la población de bacterias celulolíticas y su actividad en el rumen de animales que consumen ensilaje. Galindo, J. 1988. Tesis Dr Ciencia Veterinarias. Instituto de Ciencia Animal, La Habana, Cuba.

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La celulolisis ruminal y los factores que la modifican Dra. Juana Galindo

Contenido Introducción.............................................................................................................................................................................52 Partes de la célula vegetal........................................................................................................................................................53 Polisacáridos estructurales de las paredes celulares ................................................................................................................53 La celulolisis ruminal. Concepto .............................................................................................................................................55 Enzimas que intervienen en la celulolisis ruminal y modo de acción.....................................................................................57 Interacciones de microorganismos en la degradación de la fibra.............................................................................................57 Factores que modifican la celulolisis ruminal..........................................................................................................................59 Nivel de lignificación de las plantas ........................................................................................................................................59 Nivel de carbohidratos solubles de la dieta..............................................................................................................................60 Nivel de nitrógeno de la dieta ..................................................................................................................................................61 Utilización del nitrógeno no proteico (NNP)...........................................................................................................................61 Conclusiones............................................................................................................................................................................63

Introducción Uno de los materiales que más abundan en la naturaleza son los pastos y forrajes, naturales o artificiales y estos constituyen una de las principales y mas económicas fuentes de alimentación para los rumiantes. La alta variabilidad que existe entre especies y también dentro de una misma especie en relación con la degradabilidad de la fracción fibrosa, hace que se estudien los fenómenos responsabilizados con tales efectos. Se conoce que los animales rumiantes presentan un complejo sistema digestivo en el cual el rumen, el mayor de los cuatro compartimientos pre estomacales, es habitado por una densa población microbiana y constituye el sitio principal de degradación de la celulosa en los rumiantes. La conversión de la celulosa a glucosa en el rumen requiere de la acción cooperativa secuencial llevada a cabo por una familia de enzimas celulolíticas constituida, al menos por tres complejos enzimáticos básicos: endoglucanasas, exoglucanasas, nombradas celobiohidrolasas y glucosidasas. Este complejo de enzimas se produce por los microorganismos que habitan en ese reservorio, entre los cuales se incluyen las bacterias, protozoos y hongos. Las celulasas, que pueden estar unidas a la superficie celular o ser segregadas al medio, son enzimas inducidas cuya actividad se inhibe por varios factores como son: pH, fuerza iónica, temperatura, concentración de sustrato entre otros, lo que implica una disminución de la utilización de los alimentos fibrosos por el rumiante. El objetivo de la presente conferencia es informar y debatir los aspectos básicos relacionados con la fermentación microbiana ruminal de la celulosa, los principales factores que la modifican así como las estrategias para incrementar su actividad con vistas a alcanzar una mayor degradación y, consecuentemente, esperar mayor producción animal

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Partes de la célula vegetal. La célula vegetal se encuentra integrada por dos partes fundamentales: Contenido celular (núcleo y citoplasma) y Membrana celular o Pared celular El Contenido celular agrupa las fracciones de alta degradabilidad y disponibilidad nutritiva. Consiste fundamentalmente en: Proteínas, 1-35, Carbohidratos solubles, 30%, Lípidos y ácidos orgánicos >10%, Minerales 3-12% La membrana celular, pared celular, membrana esquelética o membrana pectocelulósica distingue a la célula de los vegetales. Es rígida o semirígida. Su espesor varía según la edad y tipo de célula. La estructura es compleja independiente a su espesor. La pared celular comprende del 30- 85% de la MS. del forraje. De forma breve se describen sus componentes: Polisacáridos estructurales de las paredes celulares Celulosa: Es prácticamente un polímero lineal de unidades de glucosa unidas entre si por enlaces β-14. Es el principal componente estructural de las paredes celulares de las plantas. Se considera relativamente insoluble en agua. Algunos polímeros pueden contener 10.000 unidades de glucosa. Los enlaces hidrógeno entre polímeros paralelos forman microfibrillas fuertes. Estas microfibrillas de celulosa proveen la fuerza y rigidez requerida en paredes celulares de plantas primarias y secundarías. Constituye el esqueleto de la pared celular. La celulosa existe en dos formas, una cristalina y otra amorfa. La primera se encuentra formada por cadenas lineares de celulosa orientada y en las cuales las moléculas se mantienen unidas lateralmente por puentes de hidrogeno. En la segunda, este ordenamiento es menor o no existe. El ordenamiento de las cadenas en la molécula produce una estructura conocida como micro fibrillas. Al formarse las micro fibrillas de celulosas en la pared celular, las hemicelulosas, lignina y otros componentes de la pared, como los minerales pueden concentrarse en los espacios entre las micro fibrillas y forman una matriz que envuelve la celulosa y se forman enlaces covalentes entre la celulosa, la hemicelulosa y la lignina. El porcentaje de celulosa en los pastos varía entre 15-50%.

Figura 1: Estructura química de la celulosa

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Hemicelulosas: Son un heterogéneo grupo de sustancias que contienen un número de azúcares en su columna vertebral y en los lados de la cadena xilosa. Mannosa y galactosa frecuentemente forman la estructura vertebral, mientras la arabinosa galactosa y ácidos urónicos están presentes en los lados de la cadena. Las hemicelulosas por definición son solubles en álcalis diluidos, pero no en agua. El tamaño molecular y el grado de ramificación son también altamente variables Una molécula típica de hemicelulosa contiene entre 50 y 200 unidades de azúcar. Se plantea que son polisacáridos matrices que se enlazan junto a las microfibrillas de celulosa y forman enlaces covalentes con la lignina. Su contenido en los vegetales varía entre 6-40% de la MS. El peso molecular es mas bajo que el de la celulosa. Pectinas: Son ricas en ácidos urónicos, solubles en agua caliente y forman geles. La estructura esqueletal consiste de cadenas no ramificadas de enlaces 1 ,4 de ácido galacturónico. Los lados de la cadena pueden contener ramnosa arabinosa, xilosa y fucosa La solubilidad es reducida por metilación de los grupos carboxilos libres y por formación de complejos de calcio y magnesio. Las pectinas similares a la hemicelulosa son polisacáridos matrices en las paredes celulares. β-Glucanos: Son polímeros de glucosa que contienen ambos enlaces (β1→3 y β1→4) en varias proporciones, dependiendo de la fuente, la cual hace a la molécula menos lineal que la celulosa y más soluble en agua. Polisacáridos no estructurales (no celulósicos) Son probablemente los que están en mayor proporción en la mayoría de los alimentos que la celulosa o lignina. Las frutas y verduras tienden a tener niveles más altos de celulosa que los cereales. Algunas frutas, en el cual la semilla es comestible tienen una proporción muy alta de lignina. La composición fibrosa de las plantas varía con la especie, la parte (esto es: raíz, tallo, hoja) y madurez. El contenido de celulosa y lignina por ejemplo, se incrementan significativamente con la madurez de la planta. De acuerdo a como varían las funciones dentro de la planta varía la composición química de cada fracción. Los polisacáridos no estructurales incluyen hidrocoloides tales como mucílago, gomas (asociadas con el endospermo y el espacio intercelular) y polisacáridos de algas. Los hidrocoloides son polisacáridos hidrofílicos que forman soluciones viscosas o dispersiones en agua fría o caliente. Las avenas y cebadas contienen mucílagos. Las gomas exudadas de plantas incluyen gomas arábigas, caraya, y tragacanto; mientras que los polisacáridos de algas incluyen agar, alginatos, y carragenina. Los polisacáridos de las paredes no celulares contienen una gran cantidad de azúcares neutros y ácidos uránicos. No polisacáridos estructurales (Lignina) La lignina es un polímero tridimensional, no-carbohidrato que consiste aproximadamente de 40 unidades de fenol con enlaces intramoleculares fuertes: La lignina es a menudo enlazada covalentemente a hemicelulosa. Contiene unidades de fenil propano derivadas de sipanil, coniferil y alcoholes p-coumarílicos. Son considerados muy inertes, insolubles y resistentes a la digestión. Su porcentaje en los pastos varía con la edad entre 2-15%. Su función es dar rigidez y dureza a los vegetales y su digestibilidad es escasa.

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Figura 2. Diagrama de la composición química de la fibra: Forma de deposición de la celulosa, hemicelulosa y lignina (Adaptado de Monje, 2004)

La celulolisis ruminal. Concepto La celulolisis ruminal es el proceso de transformación bioquímica de la celulosa en carbohidratos solubles Este proceso se lleva a cabo por algunos miembros de la microflora y microfauna ruminal que tienen la capacidad de segregar enzimas celulasas. Accesibilidad de las enzimas a la celulosa La capacidad de los organismos celulolíticos para digerir la celulosa varia grandemente con las diferentes especies de forraje o el grado de madurez en que se encuentren, aun cuando sus contenidos en celulosa no sean tan diferentes. Para apreciar completamente la influencia de la estructura de la fibra en la susceptibilidad o resistencia a la degradación enzimática, es necesario comprender la relación entre microorganismo celulolítico, sus enzimas extracelulares y la fibra propiamente dicha. Los organismos que degradan la fibra viven en la superficie o en el interior de la fibra. En estos lugares segregan enzimas extracelulares o superficiales que catalizan la dilución de los constituyentes de la fibra a productos que pueden ser asimilados y metabolizados por estos microorganismos.

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La susceptibilidad de la celulosa a la hidrólisis enzimática esta determinada en grado considerable por la accesibilidad de las enzimas producidas y el sustrato, celulosa, es pues un prerrequisito para la hidrólisis, pues la celulosa es estructuralmente compleja y a la vez insoluble. Este contacto puede ocurrir por difusión de las enzimas dentro de la compleja matriz de la celulosa. Debe esperarse, que la velocidad de la reacción deba ser función del área superficial de la celulosa que esta accesible a la enzima. Cualquier aspecto estructural que limite la accesibilidad de las enzimas del complejo celulasas a la celulosa disminuirá su susceptibilidad de la degradación. Aspectos estructurales que afectan el ataque enzimático Los aspectos estructurales que determinan la susceptibilidad de los materiales celulósicos a la degradación enzimática incluyen: • Contenido de humedad de la fibra • Tamaño de los poros microfibrilares • Los enlaces establecidos entre los diferentes constituyentes de la pared celular • Otros aspectos La humedad desempeña un importante papel en la degradación de la celulosa ya que el agua es necesaria para hinchar la fibra; prevé un medio adecuado para la difusión de las enzimas extracelulares y de los productos de la degradación parcial de la fibra de los cuales obtienen los microorganismos sus nutrimentos. Los elementos del agua se utilizan para producir el rompimiento de los enlaces entre las unidades de glucosa que forman la molécula de celulosa. La degradación enzimática de la celulosa requiere que las enzimas celulasas y otras enzimas extracelulares de los microorganismos se difundan desde los organismos productores hasta la superficie accesible, sobre o dentro de la fibra. Estas superficies accesibles se encuentran definidas por su tamaño, forma y propiedades superficiales en capilares microscópicos y sub microscópicos dentro de la fibra. Estos capilares se encuentran dentro de dos categorías: capilares gruesos, visibles al microscopio de luz y que tienen un diámetro que varía desde 2000 Å a 10 micrones y los capilares o poros de la pared celular, tales como los espacios entre las microfibrillas y las moléculas de celulosa en las regiones amorfas. La mayoría de los poros de la pared celular se encuentran cerrados cuando las paredes no contienen humedad, pero se abren otra vez cuando se absorbe agua. Cuando la fibra se encuentra completamente saturada de agua, los capilares de las paredes celulares alcanzan sus dimensiones máximas. Estos pueden alcanzar alrededor de 200 Å de diámetro, aunque comúnmente poseen un diámetro menor. En un cuerpo poroso el área superficial disponible para que el ataque de una enzima se realice dependerá de los tamaños relativos de los poros y la enzima. Los estudios realizados en este campo indican que la molécula del complejo celulasas posee un diámetro entre 30-40 Å. Cuando el volumen accesible al poro es cero, la reacción de disolución de la celulosa no ocurre; pero al incrementarse el volumen accesible del poro ocurre un incremento correspondiente en la velocidad de reacción. También existe una correlación entre la reactividad y el área superficial a una molécula con un tamaño dado. Esto se basa en que la velocidad de una reacción química heterogénea entre moléculas en solución y un sólido es, usualmente, proporcional a la superficie disponible.

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Existen algunas evidencias de uniones covalentes entre la lignina y algunos de lo polisacáridos de la pared celular. Estos enlaces posiblemente contribuyan a impedir el ataque enzimático de la fibra por inhibición estereoquímica. Sin embargo, también se plantea que ocurre un enrejamiento físico de la celulosa y la hemicelulosa. Otros aspectos que se cree influyen en la susceptibilidad de la fibra al ataque enzimático son, el grado de cristalinidad de la celulosa, su grado de polimerización, la asociación con minerales y otras sustancias.

Figura 3. Microfibrillas de celulosa en la pared vegetal

Enzimas que intervienen en la celulolisis ruminal y modo de acción El termino celulasas se utiliza para denominar las endoenzimas producidas por los microorganismos celulolíticos, que hidrolizan los enlaces β-1-4 glucosídicos presentes entre las unidades de anhidro glucosa y su nombre sistemático es β-1-4 glucan glucano hidrolasas. Las enzimas celulasas no son una sola enzima, sino que constituyen un complejo enzimático, el cual está formado por varias enzimas, entre ellas: endo ß-1-4 glucanasas (ß-1-4 glucan glucano hidrolasa, carboximetil celulasa ó Cx celulasa); exo ß1-4- glucanasas (exo celobiohidrolasa, ß1-4- glucanglucanohidrolasa ó C1 celulasa); exo ß1-4- glucosidasas (1,4 ß glucan glucohidrolasa); celobiasas (ß glucosidasas ó glucohidrolasa); celulodextrinasas; etc. La mayoría de los microorganismos celulolíticos del rumen se encuentran dotados de todas las enzimas y por esa razón, la celulolisis puede ser total cuando se estudia en suspensiones con cultivos puros. Sin embargo, se ha indicado que algunos microorganismos atacan solamente la forma nativa de la celulosa, mientras que otros, considerados de baja actividad o pseudo celulolíticos, intervienen en el proceso de degradación cuando la molécula de celulosa ha sido atacada previamente. Interacciones de microorganismos en la degradación de la fibra Para degradar la celulosa, los microorganismos se adhieren a las partículas de alimentos y reducen la celulosa en fragmentos con formación de productos intermediarios que son metabolizados por otros grupos microbianos. Los productos intermediarios de la degradación de la celulosa son, succinato, hidrógeno y formiato. Los productos finales son acetato y butirato. La fermentación completa de la celulosa se efectúa mediante la acción de una población mixta, que comprende los siguientes grupos fisiológicos • •

Microorganismos Celulolíticos Especies microbianas que fermentan los glúcidos producidos por la hidrólisis de la celulosa 57

• •

Especies que degradan los compuestos como ácido succínico y ácido fórmico Bacterias metanogénicas, que utilizan el hidrógeno metabólico o el formato para la formación de CH4.

Las bacterias celulolíticas mas comúnmente aisladas y estudiadas son: Fibrobacter succinógenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminococcus albus, Ruminococcus flavefaciens, Clostridium cellobiosparum, Clostridium lockheadii, Micromonospora ruminantium. Algunos protozoos Entodiniomorfos tienen actividad celulolítica y juegan un papel importante en la fermentación de la lignocelulosa. Polyplastrom multivesiculatum es el protozoo mas activo en la celulolisis y su presencia puede incrementar hasta en un 10% la digestibilidad de la lignocelulosa. Otros protozoos, Entodinium, están dotados de una poliglucosidasa de tipo C Otros protozoos con actividad celulolítica son, Eudiplodinium maggii, Epidinium ecaudatum. Los protozoos Holotrichos Isotrichas y Dasytrichas, reducen la degradabilidad de la fibra. Todos los hongos del rumen, aislados e identificados hasta el presente, son celulolíticos. Entre ellos tenemos, Neocallimastix frontalis, Sphaeromonas comunis y Piromonas comunis Entre las diferentes especies y cepas de microorganismos celulolíticas existen numerosas Inter.relaciones metabólicas y asociaciones. Cada especie se caracteriza por una forma particular de penetrar, atacar y colonizar el vegetal. Así, por ejemplo, R. Flavefaciens penetra al vegetal por las zonas dañadas, pero se adhiere a las células de la pared celular del vegetal para producir la degradación del mismo. Otros microorganismos se adhieren más rápidamente a la epidermis del vegetal, esclerénquima, floema y mesófilo, pero no degrada la pared celular a través del esclerénquima. La presencia de grandes concentraciones de lignina en la pared celular inhibe tanto la adhesión como la digestión. En sentido general, se puede señalar que los primeros organismos que se adhieren a la fibra proporcionan las condiciones para el ataque por los otros. La colonización de la fibra en el rumen es rápida y ocurre en minutos.

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Celulosa

Fibrobacter Fragmentos de celulosa

Fibrobacter

Selenomonas

CO2

Propionato + Acetato + CO2

+ Acetato + Formato

Acetato + CO2 + H2

+ succinato

CH4 CO2

CO2

Figura 4. Interacciones entre Fibrobacter succinógenes y Selenomonas ruminantium en el proceso de fermentación de la fibra

Factores que modifican la celulolisis ruminal La degradación de los componentes estructurales de la pared celular es extremadamente variable y depende de varios factores, entre ellos. • • • • • • •

Inherentes al vegetal. Naturaleza de los carbohidratos estructurales, edad del vegetal, origen botánico de la planta, contenido de lignina, tipo de tejido predominante, parénquima, esclerénquima, estado vegetativo, aspectos estructurales del vegetal. Referente a la ración Naturaleza y cantidad de proteína en el alimento Disponibilidad en minerales, los cuales condicionan directamente la actividad y el potencial enzimático Contenido de carbohidratos de fácil fermentación Estado físico del alimento, tratamientos tecnológicos, acción de agentes químicos o biológicos, etc

Cualquier factor que modifique la temperatura y el pH de acción de las enzimas celulasas o interfiera en la formación del complejo enzima- sustrato (ES) Nivel de lignificación de las plantas Cuando las plantas que ingieren los animales son jóvenes, los microorganismos pueden obtener todos los nutrimentos necesarios para cubrir requerimientos, pero a medida que esta envejece aumenta la necesidad de tejidos de sostén y con ellos aumenta el contenido de carbohidratos estructurales, y de lignina., disminuye el contenido vegetal. No solamente ocurren cambios en la cantidad de los componentes químicos, sino que también ocurren cambios en la disposición espacial de los componentes y la formación de enlaces entre ellos.

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La lignina y las hemicelulosas forman un enrejado que aísla a la celulosa. Esto disminuye la superficie posible de ataque a la celulosa por parte del complejo enzimático celulasas. Los materiales lignocelulósicos presentan grados de digestibilidad diferentes en dependencia con la relación lignina/ celulosa que presente. Un ejemplo se muestra en la siguiente tabla. Las gramíneas templadas, que presentan un menor contenido de lignina, tienen una mayor digestibilidad. Tabla 1. Digestibilidad de la celulosa en diferentes materiales Material

Digestibilidad, %

Proporción lignina/celulosa

Alfalfa Gramíneas templadas Gramíneas tropicales Papa Papel Madera Vegetales

40-60 48-90 30-60 40-60 20-99 0-40 90-100

0.18-0.30 0.08-0.20 0.11-0.24 0.10-0.26 0.20-0.50 0.30-0.60 0-0.05

Las diferentes especies microbianas del rumen actúan, preferentemente, sobre un sustrato con especificidad relativa. Esta característica se encuentra estrechamente relacionada con los requerimientos nutricionales de cada especie, y con el grado de lignificación y contenido celular de los vegetales. Por ejemplo, Ruminococcus albus y Fibrobacter succinógenes solubilizan en mayor proporción el heno de Teff en relación a Butyrivibrio fibrisolvens, mientras que Fibrobacter succinógenes hace una mayor degradación de la mezcla de gramíneas. Tabla 2. Solubilización de paredes celulares de plantas por bacterias del rumen Microorganismo

Sustrato

Butyrivibrio fibrisolvens

Heno de Teff Mezcla de gramíneas Paja de Barley Heno de Teff Mezcla de gramíneas Paja de Barley Heno de Teff Mezcla de gramíneas Paja de Barley Heno de Teff Mezcla de gramíneas Paja de Barley

Ruminococcus albus

Ruminococcus flavefaciens

Fibrobacter succinógenes

Solubilización de paredes, % 25 31 20 74 42 26 63 30 35 80 61 42

Nivel de carbohidratos solubles de la dieta Para asegurar una actividad normal de la microflora y para que exista una buena actividad celulolítica en la dieta, deberá estar presente cierta cantidad de carbohidratos solubles o fácilmente fermentables. Pequeñas cantidades de éstos carbohidratos producen un aumento en la digestibilidad de la celulosa, pero cantidades muy grandes la deprimen. Se aduce que estas diferencias en digestibilidad se debe a un aumento en la proliferación de los organismos que utilizan estos carbohidratos y producen un incremento en la fermentación de los mismos, con un consecuente cambio en el pH (disminución) y en el patrón de fermentación. Esto afecta el normal desarrollo de los microorganismos celulolíticos, y por 60

ende, la actividad de las enzimas también disminuye. Se debe señalar que generalmente, los pastos a la edad en que aproximadamente se debe utilizar, alrededor de 6-7 semanas de edad, presentan cantidades adecuadas de carbohidratos fácilmente fermentables. Nivel de nitrógeno de la dieta Uno de los Nutrientes más limitantes en la utilización de la fibra es el nitrógeno. La deficiencia de nitrógeno disminuye la digestibilidad de la fibra, ya que las bacterias necesitan de este nutriente para sintetizar las enzimas necesarias para su crecimiento y metabolismo. Además la formación del conjunto de enzimas que constituyen el complejo celulasas requieren un gasto de energía y nitrógeno alto. Utilización del nitrógeno no proteico (NNP) Se conoce que para cubrir los requerimientos de nitrógeno los organismos celulolíticos necesitan que parte del nitrógeno esté en forma de NNP, porque aunque ellos requieren de aminoácidos que le son esenciales, pueden utilizar el amoníaco (NH3) para sintetizar sus aminoácidos. Asimismo se ha encontrado que parte del nitrógeno total de la dieta debe encontrarse en forma de proteína verdadera, ya que ésta produce un efecto beneficioso en la digestión de la celulosa. Se han utilizado numerosos compuestos para suministrar el nitrógeno que se requiere en las dietas. En los últimos años se ha incrementado la utilización de compuestos que liberan NH3 en el rumen, como una forma de suministrar el nitrógeno en la dieta. Los más utilizados se presentan en la tabla. Todos estos productos tienen en común la presencia del grupo amonio (NH+ 4) o el amino (NH2), los que se hidrolizan a NH3. Uno de los componentes mas utilizados es la urea, la que se ha encontrado que produce un aumento en la digestibilidad de la celulosa cuando se suministra a los animales que consumen alimento fibrosos de baja calidad. Es importante señalar que con los materiales fibrosos de baja digestibilidad la adición simultánea de pequeñas cantidades de carbohidratos de fácil fermentación, ayuda a un mejor desarrollo de los microorganismos ruminales. Los AGCC que se forman de la fermentación de los carbohidratos, junto al NH3 contribuyen a la síntesis de proteína microbiana La inclusión de urea incrementa la digestibilidad de la celulosa en la paja de trigo y mazorca de maíz. Como se aprecia, los valores de inclusión de 50mg Urea/100ml de líquido ruminal, bajo condiciones in vitro, no se traducen en una mayor degradación de la celulosa en la paja de trigo, aunque sí en la mazorca de maíz. Esto nos conduce a informar que la suplementación con urea con el propósito de incrementar la digestibilidad de la celulosa, depende de la fuente de celulosa específica, además de otros factores como son el nivel de carbohidratos solubles de la ración. La suplementación nitrogenada, ya sea en forma de nitrógeno no proteico (NNP) o de proteína verdadera incrementa la digestibilidad y la eficiencia de utilización de los forrajes de baja calidad, como resultado de un efecto directo en la población de microorganismos del rumen. Esta afirmación se fundamenta en que los microorganismos del rumen degradan la urea a amoníaco y como resultado, prolifera una amplia gama de microorganismos cuyos requerimientos simples de nitrógeno se cubren por la presencia de NH3. El amoníaco así formado y las cadenas carbonadas presentes en el líquido de rumen, provenientes del resto de la dieta, se utilizan para la síntesis de proteína microbiana. 61

La máxima síntesis de proteína microbiana en el rumen se alcanza cuando la concentración de amoníaco se encuentra entre 5-8 mg/100ml. A su vez, estos niveles de amoníaco se alcanzan cuando la concentración de proteína bruta (PB) en la dieta es de aproximadamente 12 %. Sin embargo, resulta evidente que los microorganismos del rumen requieren de fuentes de proteína verdadera, aminoácidos, péptidos y otras formas nitrogenadas. Los aminoácidos aportan las cadenas carbonadas para la síntesis de ácidos grasos volátiles en el rumen, fundamentalmente, de cadena ramificada o isoácidos conocidos como ácido isobutírico, ácido isovalérico y ácido 2-metilbutirato Es bueno señalar que solo los tres aminoácidos de cadena corta ramificada (valina, leucina e isoleucina), permiten la producción de estos isoácidos. Las vitaminas del complejo B también actúan como activadores en el proceso de degradación de la celulosa en el rumen. Así en investigaciones que se realizaron bajo condiciones in vitro, se demostró que la mezcla de ácido valérico, Biotina, ácido para amino benzoico (PABA) y vitamina B12, producen incrementos en la digestibilidad de la celulosa. Igualmente, el uso de productos biofermentados con base a levaduras también incrementa el número de microorganismos celulolíticos y la actividad de las enzimas secretadas por los mismos. Tabla 3. Efecto de la urea en la actividad celulolítica ruminal % digestibilidad de la celulosa Tratamiento

Paja de trigo

Mazorca de maíz

Control Control + 5mg Urea/100ml Control + 10mg Urea/100ml Control + 25mg Urea/100ml Control + 50mg Urea/100ml

30.3 31.6 32.5 36.6 36.6

19.9 21.2 24.7 25.7 29.9

*

* 2g de paja + líquido de rumen

Tabla 4. Efecto de la urea en la actividad celulolítica del rumen Medida

Paja sola

Paja + Urea

Paja + Urea + Sacarosa

Consumo de MS, Kg/día Digestibilidad de la MS, % Digestibilidad de la celulosa, % Proteína bacteriana, mg/100ml Amoníaco ruminal, mg/100ml

2.06 31.1 50.0 11.3 1.8

2.54 45.4 59.5 17.8 18.2

2.35 40.9 56.3 18.8 10.5

Tabla 5. Efecto de las vitaminas en la digestibilidad de la celulosa Adiciones al medio de cultivo Biotina y PABA Ácido Valérico Ácido valérico + Biotina Ácido valérico + PABA Ácido valérico +Biotina + PABA Ácido valérico +Biotina + PABA + B12 Líquido de rumen centrifugado

% digestibilidad de la celulosa 22.8 41.8 44.3 36.4 56.9 54.6 61.4

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Los rumiantes pueden ser capaces de utilizar diferentes fuentes de NNP. A continuación se presentan algunas de las fuentes. Tabla 6. Fuentes de NNP para rumiantes Fuentes Acetato de amonio Bicarbonato de amonio Carbonato de amonio Formiato de amonio Lactato de amonio Solución de poli fosfato de amonio Sulfato de amonio Biuret puro Biuret comercial (alimento) Fosfato di básico de amonio Dicianodiamino Glutamina Glicina Guanidina Fosfato monobásico de amonio Sarcosina Urea pura Urea comercial (alimento) Fosfato de urea

Fórmula NH4 CH3 CO NH4 CO3 (NH4 )CO3 NH4 H CO3 NH4 CH3 CHOHCO2 (NH4 )2SO4 NH2 CONHCONH2 H2 O (NH4)2HPO4 NH2CO(:NH)NHCN NH2CO(NH2)2CHNH2CO2H NH2CH2CO2H NH:C(NH2)2 NH4H2PO4 CH3NHCH2COOH (NH2)2CO (NH2)2COH2PO4

Contenido de N, % 18 18 36 22 13 9-11 21 40.8 37 21 67 19 19 71 12 15 46.7 42-45 17.7

Conclusiones Los animales rumiantes están preparados para degradar los materiales fibrosos debido a que presentan una variada población microbiana en el rumen capaz de segregar enzimas celulasas. La importancia de manipular esa población y liberar la energía que potencialmente se encuentra dentro de la molécula de celulosa es una de las acciones que requiere mayor destreza dentro de la fisiología ruminal. La acción de las enzimas celulasas se puede afectar por numerosos factores, tales como adsorción de la enzima al sustrato, inactivación de la enzima con el tiempo, pH, temperatura, concentración de nitrógeno, inhibición de la enzima con el tiempo de la reacción, presencia de proteasas producidas por microorganismos, entre otros. Bibliografía a consultar • • • •

The rumen and its microbes. Hungate, R.E. 1966. New York: Academic Press. Book The roles of protozoa and fungi in ruminant digestion Editors. Armidale, NSW. 2351, Australia: Penambui Books The rumen bacteria of animal fed on a high molasses urea diet. Elías, A. 1971. Thesis Ph.D. Aberdeen. UK. Efecto de la Zeolita en la población de bacterias celulolíticas y su actividad en el rumen de animales que consumen ensilaje. Galindo, J. 1988. Tesis Dr Ciencia Veterinarias. Instituto de Ciencia Animal, La Habana, Cuba. 63

Microecología del tracto gastrointestinal de monogástricos. Dr. Ramón Boucourt Contenido Introducción.............................................................................................................................................................................64 1. Principios ecológicos. ..........................................................................................................................................................65 2. Microecología del tracto gastrointestinal.............................................................................................................................66 2.1. Composición de la microflora del TGI. ........................................................................................................................67 2.2. Desarrollo de la microflora intestinal. .........................................................................................................................68 2.3. Papel de la microflora en el TGI. .................................................................................................................................68 2.4. Factores que afectan la correlación microbiana..........................................................................................................70

2.4.1. Factores alogénicos. .............................................................................................................. 70 2.4.2. Factores autogénicos. ............................................................................................................ 72 3. La microflora del TGI y desórdenes intestinales. ................................................................................................................73 4. Influencia de la microflora intestinal para el hospedero ......................................................................................................74 Conclusiones............................................................................................................................................................................75

Introducción El tracto gastrointestinal (TGI) está habitado por una microflora diversa con más de 500 especies diferentes, varias de las cuales ejercen efectos positivos sobre el hospedero y que hoy en día son denominadas bacterias probióticas. La flora bacteriana intestinal de los animales domésticos juega un importante papel en la absorción e ingestión del alimento ingerido por el hospedero. Ellas intervienen en el metabolismo de los nutrientes de la dieta tales como: carbohidratos, lípidos, minerales, así como en la síntesis de vitaminas. Además de este efecto fisiológico en la nutrición, las bacterias brindan protección contra ciertas enfermedades e infecciones mediante la supresión del crecimiento de microorganismos patógenos. Las infecciones gastrointestinales constituyen uno de los principales problemas de salud que afectan, a nivel mundial, tanto a los animales como a los niños y adultos. De ahí que, el establecimiento de una microflora intestinal completa es esencial para un buen estado y funcionamiento del TGI. Por lo tanto,

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es sumamente necesario conocer todos los mecanismos y relaciones que se establecen en el ecosistema del TGI para poder mejorar la calidad de vida del ser humano y de los animales. La Ecología Microbiana es la ciencia que se dedica al estudio de este ecosistema altamente complejo, el cual constituye el tema de análisis abordado en esta conferencia. Para ello, primeramente haremos un breve recuento de los aspectos más importantes de la ecología moderna para posteriormente abundar en la ecología del TGI. 1. Principios ecológicos. La ecología microbiana abarca todo lo concerniente con las interrelaciones que se establecen entre los microorganismos y el ambiente en que estos se desarrollan (Alexander, 1971). El complejo de organismos en un ambiente específico y los factores abióticos con los cuales estos organismos están asociados son conocidos como un ecosistema. El ecosistema incluye el ensamblaje de especies y los constituyentes orgánicos e inorgánicos caracterizando el sitio en particular. Cada ecosistema diferente tiene una colección de organismos y componentes abióticos únicos para él. Los organismos que habitan un sitio dado constituyen una comunidad. Dentro de esta es posible distinguir varias categorías de microorganismos. Los verdaderos habitantes, frecuentemente designados como especies indígenas o autóctonas, son nativos del lugar y en una etapa u otra ellos crecen, se multiplican y contribuyen al metabolismo de la comunidad. La mera presencia de una especie en particular por sí misma no garantiza que esta sea un miembro permanente o funcional de la comunidad. Muchos microorganismos son fácilmente diseminados y muchos invasores o alóctonos se originan en cualquier parte y pueden ser transportados a un ambiente en estado vegetativo o resistente. Ciertas especies no indígenas pueden crecer por cortos períodos de tiempo debido ha que son depositados en su nuevo domicilio temporal con nutrientes o tejidos derivados de su viejo ambiente y algunos son capaces de explotar una parte de los recursos del nuevo hábitat. En la comunidad existe una especie dominante que es la que exhibe la mayor talla poblacional aunque frecuentemente las comunidades contienen 2 o más codominantes. Cada microorganismo ocupa un hábitat determinado, el cual está dado por el espacio físico que ocupa en el ecosistema. El papel que

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juega cada microorganismo en su hábitat se denomina nicho. El nicho no es una connotación de la posición de un organismo sino más bien de la función que este desempeña en la comunidad.

2. Microecología del tracto gastrointestinal. Después del tracto respiratorio, el TGI constituye la mayor superficie del cuerpo (250-400m2) que comunica a este con el mundo exterior y es habitado por una rica microflora con más de 500 especies bacterianas diferentes, muchas de las cuales ejercen importantes funciones en el organismo. Estas bacterias pueden ser clasificadas en dos tipos: aquellas nativas del lugar denominadas indígenas y otras capaces de vivir por cortos períodos de tiempo denominadas microorganismos transientes. Por ejemplo, nuestro cuerpo contiene 10 veces más bacterias indígenas protectoras que células eucariotas y se ha sugerido que la misma pudiera ser considerada como parte del cuerpo humano. La microflora que habita el tracto gastrointestinal forma un ecosistema altamente complejo que a pesar de ser abierto es muy estable (Jonsson, 1985, Fuller, 1989). Existen interacciones entre el animal y su microflora y entre los microorganismos que componen esta última. Aquí se cumplen los dos postulados de la ecología bacteriana: la inoculación de especies exóticas no puede cambiar el número y la composición de un ecosistema abierto; y la composición de número y la composición dentro de la microflora pueden ser cambiados por variaciones en el ambiente (Hungate, 1984). Según el autor el número de la microflora intestinal puede cambiar en el tiempo sin que ocurra una variación discernible en el ambiente. Es decir, las condiciones no son estáticas sino que fluctúan. Las cepas mutantes aparecen constantemente, algunas encuentran un nicho y reemplazan a otras, más tarde estas son reemplazadas y así sucesivamente. En el TGI las bacterias se encuentran provistas de un suplemento constante de nutrientes y mantenidas a una temperatura estable por el hospedero. Ellas tienen que luchar contra el lavado que efectúa el flujo de la digesta, contra los mecanismos de defensa del hospedero y competir con otros microorganismos por nutrientes y espacio (Jonsson, 1985). Cuando el alimento es ingerido, el oxígeno también puede entrar al sistema y ser consumido por la microbiota de la parte anterior del tracto. Aunque la anaerobiosis incrementa hacia las secciones posteriores de este, aquellos microorganismos que están estrechamente asociados con el epitelio pueden disponer del oxígeno, el cual difunde desde la sangre.

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Las bacterias pueden ser encontradas viviendo libremente en el lumen, unidas a las partículas del alimento o al epitelio. La unión al epitelio puede ser por asociación con el mucus o por la adhesión verdadera a las células del epitelio escamoso estratificado o al epitelio columnar (Savage, 1980). Aquellas bacterias que viven libremente en el intestino pueden permanecer aquí siempre y cuando su velocidad de crecimiento sea mayor o igual a la velocidad de pasaje de la digesta, de lo contrario son expulsadas al exterior. La unión al epitelio constituye un recurso que le permite al microorganismo mantenerse en el intestino aún a una velocidad de multiplicación baja, así como, tener acceso a otros nichos.

2.1. Composición de la microflora del TGI. El número y la composición de la microflora varían considerablemente a lo largo del TGI (Salminen et al., 1998). El conteo de bacterias totales en el contenido gástrico está por debajo de 103/g, debido al pH ácido del lumen. En el intestino delgado el número oscila entre 104/g a 107/g en la región ileocecal, los principales factores limitantes del crecimiento aquí son el rápido tránsito de la digesta y la secreción de bilis y jugo pancreático. El intestino grueso constituye el sitio ideal para el crecimiento microbiano. Varios cientos de especies se encuentran presentes con un número típico de alrededor de 1011-1012/g. En los organismos saludables la microflora se encuentra en un estado de balance denominado eubiosis, lo que le permite crecer en una simbiosis beneficiosa con el hospedero. Según Gedek (1989) existen tres tipos de microflora que caracterizan el estado eubiósico de la flora gastrointestinal de los animales de granja. •

Flora principal: representa más del 90% de la flora total, principalmente anaerobios obligados, predominan las bacterias formadoras de ácido láctico: Bifidobacterium y Lactobacillus y las formadoras de ácidos grasos de cadena corta (AGCC): Bacteriodiceae y Eubacterium.

•

Flora satélite o secundaria: ocupa menos del 1%, son anaerobios facultativos, fundamentalmente E. coli y Enteroccoci.

•

Flora residual o secundaria: representa menos del 0,01%. Se ubican aquí: Clostridium, Proteus, Staphilococcus, Pseudomonas, levaduras del género Cándida, bacterias no patógenas y facultativas

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Cualquier cambio del balance a favor de la flora secundaria o remanente trae consigo un estado desbalanceado denominado disbiósico el cual afecta el funcionamiento del organismo. La composición de la flora gastrointestinal humana ya establecida en un individuo sano aparece en la tabla 1. Tabla 1. Composición de la flora normal del tracto gastrointestinal (Salminen et al., 1995).

Microorganismos

Microorganismos (UFC/ml oUFC/g) Estómago Yeyuno Ileon Colon

Conteo total Bacteroides Bifidobacterium Lactobacilos Estreptococos (anaerob) Clostridios Eubacterias

0-103 0-103 -

0-105 0-103 0-104 0-103 0-103 -

103-109 0-103 103-109 102-105 102-106 102-104 -

1010-1012 103-107 108-1011 104-109 1010-1012 106-1011 109-1012

Enterobacterium Estreptococos (aerobio) Levaduras

0-102 0-103 0-102

0-103 0-104 0-102

102-107 102-105 102-104

104-109 104-109 104-106

- No detectados o muy raramente.

2.2. Desarrollo de la microflora intestinal. La formación de la microflora intestinal normal comienza en el nacimiento cuando el recién nacido es contaminado por los microorganismos del tracto urogenital de la madre. Las bacterias comienzan a aparecer en las heces en los primeros días de vida. Los primeros microorganismos son usualmente microaerofílicos y aerobios lactobacilos, estreptococos y otras bacterias productoras de ácido (Mikelsaar y Mändar, 1993). Escherichia coli y enterococos son aislados frecuentemente en meconio. Bacteroides y Bifidobacterium colonizan el intestino dentro de unos pocos días (Lejeune et al., 1984). Después del nacimiento, el tracto gastrointestinal desarrolla una compleja y diversa microbiota con un perfil de bacterias anaerobias dominantes el cual es alcanzado dentro de los primeros cuatro años de vida (Mikelsaar y Mändar, 1993).

2.3. Papel de la microflora en el TGI. El principal papel de la microflora intestinal es salvar la energía de los carbohidratos no digeridos en el intestino superior, a través de la fermentación (Salminen et al., 1998). Los principales sustratos para la

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fermentación son los carbohidratos de la dieta que escapan a la digestión por las enzimas del hospedero, estos incluyen almidones resistentes, polisacáridos no almidonados (celulosa, hemicelulosa, pectina y gomas), oligosacáridos no digestibles, varios azúcares y azúcares-alcoholes (Cummings et al., 1997). Los principales productos de esta fermentación son los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) fundamentalmente acetato, propionato y butirato los cuales constituyen los principales aniones en el intestino. Otros productos finales de la fermentación de los carbohidratos incluyen lactato, etanol, succinato, etc. Los AGCC son rápidamente absorbidos del intestino y estimulan la absorción de sales y agua. Ellos son entonces metabolizados principalmente por el epitelio intestinal, hígado y músculo con virtualmente ninguna aparición en la orina y pequeñas cantidades en las heces. Una de sus propiedades más importantes la constituye su efecto trófico en el epitelio, siendo el butirato el más efectivo en este sentido. El acetato es el principal AGCC en el intestino. Este es tomado por el epitelio y aparece en la sangre portal, posteriormente pasa a través del hígado a los tejidos periféricos donde es metabolizado por el músculo. Esta constituye la principal ruta por la cual el cuerpo obtiene energía de los carbohidratos no digeridos y absorbidos en el intestino delgado. En las especies rumiantes, el propionato es el principal precursor de la glucosa pero este no es un papel importante en especies como el hombre. En experimentos in vitro el propionato inhibe la entrada de acetato en la vía de síntesis de colesterol, y en ratas y cerdos, la inclusión de propionato en la dieta disminuye los niveles de colesterol en sangre, pero en humano existen muy pocos reportes de que esto ocurra (Stephen, 1994). El butirato es el más interesante de loa AGCC, además de su efecto trófico en la mucosa, constituye la principal fuente de energía para el epitelio del colon y regula el crecimiento y la diferenciación celular (Salminen et al., 1998). Las proteínas y aminoácidos también son efectivos como sustratos de crecimiento de las bacterias del colon. Estos incluyen elastina, colágeno y albúmina, proteínas bacterianas liberadas luego de la lisis celular, enzimas pancreáticas, células epiteliales descamadas y mucina, entre otros. Como productos finales del metabolismo bacteriano de las proteínas se encuentran los ácidos grasos de cadena ramificada como el isobutirato, isovalerato y otros productos como aminas, indoles, fenoles, amoníaco, los cuales pueden tener propiedades tóxicas para el organismo (Macfarlane & Marcfarlane, 1995).

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La microflora también influye sobre el metabolismo de los lípidos. Se conoce que las bacterias sintetizan ácidos grasos de novo y modifican los ingeridos en la dieta. Por otra parte, desconjugan las sales biliares, disminuyendo de esta forma su absorción, afectando por tanto, el metabolismo del colesterol, lo que provoca la disminución de sus niveles en sangre, aspecto este ventajoso para el hospedero. Sin embargo, otros autores plantean también que los ácidos desconjugados pueden ejercer efectos nocivos como son: la inhibición de las funciones de las células mucosales incluido el transporte activo de los azúcares y aminoácidos. En adición a su papel fermentativo, los microorganismos intestinales pueden contribuir a la salud de otras maneras. El desarrollo de esta microflora provee las bases para una barrera que previene la invasión del tracto gastrointestinal por microorganismos patógenos, por otra parte, las bacterias intestinales están involucradas en la síntesis de vitaminas (especialmente vitamina B y K) y en el metabolismo de xenobióticos. En los últimos años ha tenido un gran impacto el hecho de que los microorganismos indígenas promuevan la estimulación del sistema inmune en el TGI (Perdigón et al., 1995).

2.4. Factores que afectan la correlación microbiana. La microflora del TGI está sujeta a diversos factores los cuales influyen en su composición y número, ya sea por restricción del crecimiento de unos microorganismos o por favorecer este en otros. Estos factores pueden ser agrupados en dos grupos: alogénicos y autogénicos (Savage, 1984). Los primeros son aquellos que están relacionados con el hospedero mientras los segundos están vinculados a la propia microflora.

2.4.1. Factores alogénicos. Entre los factores incluidos en este grupo se encuentran: Estrés: Según Ito (1981) se entiende por estrés al conjunto de reacciones las cuales son causadas por múltiples hormonas secretadas bajo la influencia de estresores,

los cuales pueden ser de origen

biológico (inanición, fatiga bacterias), físico (calor, frío), químicos entre otros. Estas hormonas secretadas alteran las condiciones fisiológicas del organismo, afectando por lo tanto, la flora intestinal del mismo. Susuki et al., (1989) sometieron pollos a un estrés calórico y demostraron que este ejercía 70

cambios en la composición de la flora del TGI

favoreciendo el desarrollo de microorganismos

patógenos. pH: Cada microorganismo requiere de condiciones específicas para su óptimo desarrollo y crecimiento, y una de ellas es el pH. Se conoce que a valores bajos de pH la mayoría de las bacterias entéricas mueren, debido a la destrucción de las enzimas o a la pérdida de la función de las mismas, así como a afectaciones en el transporte intracelular (Newman y Jackes, 1995). Las bacterias ácido lácticas son las más resistentes. Si se obstruye la secreción de HCl, entonces el número de bacterias capaces de pasar hacia el intestino delgado incrementa. En el intestino grueso donde los niveles de pH son mayores, se favorece el desarrollo de los microorganismos. Dieta: El tipo de dieta es uno de los factores que controla grandemente la composición de las especies microbianas presentes en TGI (Salminen et al., 1995). Así por ejemplo, la flora fecal de los bebés alimentados con pecho es dominada por bifidobacterias, en contraste con los bebés alimentados con fórmulas que presentan una microbiota más compleja compuesta de bifidobacterias, bacteroides, clostridios y estreptococos, todos dominantes. Muchos estudios se han realizado, en los cuales se compara la composición de la flora intestinal entre individuos con diferentes hábitos alimentarios encontrándose diferencias en cuanto al número de microorganismos Edad: En dependencia de la edad del individuo varían las características fisiológicas del mismo y esto, a su vez, repercute en la microflora. Cuando se explicaba como se desarrolla la flora gastrointestinal se mencionaba como durante los primeros cuatro años de vida, la microflora intestinal se iba desarrollando progresivamente hasta alcanzar un perfil típico del estado adulto. Bertazzoni-Minelli et al., (1993) estudiaron la relación entre la composición fecal y la edad en la mujer. En las mujeres posmenopáusicas las muestras fecales contenían más hongos, clostridios y lactobacilos cuando se comparaban con muestras de mujeres fértiles, sugiriéndose que los patrones esteroides pueden influir en la flora fecal. Sistema inmune: Este tiene probablemente como efecto más importante en el TGI la producción de IgA, una inmunoglobulina que posee un componente secretorio, el cual le permite la asociación con el mucus del epitelio y le confiere resistencia a la degradación enzimática. Esta IgA actúa cubriendo la superficie de la bacteria, impidiendo de esta forma la adhesión de las mismas al epitelio y facilitando su identificación por células fagocíticas.

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Peristalsis: Es un factor importante que permite al hospedero mantener la microflora en un rango determinado. Una detención de este movimiento provocaría un sobrecrecimiento de las bacterias en el intestino, lo que conllevaría severos problemas para el hospedero como son: mala absorción de lípidos, daños a la mucosa etc. Antibióticos: La terapia antimicrobiana induce rápidos y profundos cambios en la microflora intestinal (Salminen et al., 1995). Los antibióticos no son selectivos, por lo que el uso de los mismos daña la flora protectora y predispone a enfermedades posteriores (Bengmark, 1998). Varios estudios indican que el desarrollo de infecciones sépticas con especies gram-negativas aerobias está precedido por el uso de antibióticos (Bennet et al., 1987). Se ha observado que la diarrea asociada a C. Difficile ocurre como una secuela al tratamiento de antibióticos como metronidazol y vancomicina (Bennet et al., 1996).

2.4.2. Factores autogénicos. Los factores autogénicos, los cuales permiten la autorregulación de la microbiota son menos entendidos. Entre ellos se encuentran: Competencia por nutrientes: La hipótesis que se refiere a la competencia por nutrientes como responsable para la exclusión de microorganismos no indígenas está basada en una serie de observaciones que indican que los mecanismos de control de las poblaciones bacterianas en el intestino, concuerdan con la teoría del quimiostato, la cual plantea que en una mezcla de bacterias en un cultivo de flujo continuo, las mismas compiten por los nutrientes esenciales para el crecimiento (Hentges, 1992). En 1983, Freter et al., demostraron que la multiplicación de E. coli, Fusobacterium spp y Eubacterium spp fue grandemente suprimida cuando los microorganismos fueron inoculados individualmente en un filtrado de un cultivo continuo

de flora cecal de ratones. El principal factor limitante de la

multiplicación de estos microorganismos fue la escasez de una fuente de carbohidratos utilizable. Producción de metabolitos inhibidores: Existen evidencias de que los metabolitos tóxicos tales como: H2S, ácidos biliares libres, AGCC, H2O2, amonio, proteínas antimicrobianas impiden el desarrollo de las bacterias patógenas ya sea por actuar directamente sobre los microorganismos o por crear condiciones ambientales desfavorables a este como son la disminución del pH y del potencial redox. Se sabe que los AGCC son tóxicos para las bacterias gram (-) (Newman et al., 1990).

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Competencia por los sitios de asociación: Para sobrevivir en el ecosistema del tracto, muchos microorganismos están obligados a asociarse con la mucosa intestinal. Según Fuller (1990), esta unión permite a los microorganismos impedir que sean lavados del intestino por el flujo peristáltico. Se ha planteado que dos o más cepas bacterianas que compiten por un mismo nutriente limitante pueden coexistir si la cepa menos eficiente metabólicamente encuentra algún sitio de adhesión disponible en el epitelio (Freter et al., 1983). Existen evidencias de que las bacterias ácido lácticas tienen la habilidad de competir exitosamente por sitios de adhesión con patógenos como E. coli (Newman y Jacques, 1995). No todas las relaciones que se producen son adversas, sino que también se desarrollan relaciones de cooperación como por ejemplo: un microorganismo convierte un sustrato no disponible a otro microorganismo, en un producto que si puede ser asimilado por este último. Tal es el caso de las bacterias celulolíticas que descomponen la fibra hasta glucosa, la cual si puede ser degradada por las demás bacterias del intestino. Además, muchos microorganismos sintetizan vitaminas que pueden ser aprovechadas por otros que también la necesitan pero no son capaces de producirlas. Todas estas interrelaciones hacen posible la regulación de la microflora intestinal de forma tal que esta se mantenga en condiciones de equilibrio. 3. La microflora del TGI y desórdenes intestinales. Una variedad de cambios en la flora intestinal normal han sido descritos durante los desórdenes intestinales (Tabla 2). Los principales patógenos causantes de esta infecciones son virus y bacterias tales como E. Coli, Campilobacter sp, Vibrio cholerae, S. aureus, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Salmonella sp, Shigella sp entre otras. Estos microorganismos pueden secretar enterotoxinas o invadir la pared intestinal. Tabla 2. Ejemplos de diferentes desórdenes intestinales y cambios ocurridos en la microflora intestinal. (Salminen et al., 1995). Desorden Colitis pseudomembranosa Diarrea aguda Diarrea crónica Costipación Gastritis

Cambio característico en la microflora fecal Sobrecrecimiento de Clostridium difficile productor de toxinas. Patógenos entéricos o virus en heces. Decrecen los anaerobios totales e incrementan los anaerobios facultativos. Decrecen las bacterias productoras de ácidos. Helicobacter pylori en la mucosa gástrica. 73

Radioterapia pélvica/colitis

Invasión de bacterias intestinales a la mucosa.

Un interesante estudio fue realizado con niños de Kenya en el cual se compara la composición de la microflora intestinal y otras características en niños aquejados de diarrea infecciosa y una vez recuperados (Tabla 3). Los datos demuestran como se afecta la microflora intestinal durante el transcurso de la infección, con una disminución de la flora protectora. Tabla 3. Características físico-químicas y microorganismos de muestras fecales en niños de Kenya durante la diarrea y después de recuperados (Salminen et al., 1995). Característica ph Contenido de agua AGCC Acidos biliares Conteo total de anaerobios Conteo total de aerobios Conteo de lactobacilos Conteo de bacteroides

Recuperados 5.4 60% Solamente pocos tipos Conjugadas primarias Alto Bajo Alto Alto

Diarrea 6.8 85% Varios tipos Libres secundarias Decrece Incrementa Decrece Decrece

4. Influencia de la microflora intestinal para el hospedero El uso de animales libres de gérmenes ha mostrado que la presencia de los microorganismos en el tracto gastrointestinal provoca cambios en la morfología y función del tracto, así como cambios en la fisiología del hospedero. En el TGI de los animales convencionales se ha observado un estado inflamatorio benigno, con mayor cantidad de tejido conectivo en la lámina propia y mayor cantidad de elementos retículos endoteliales en el intestino delgado que en los animales libres de gérmenes. La estructura de las vellosidades es también modificada. Los animales libres de gérmenes tienen los vellos más alargados (en forma de dedos) y más regulares. En estos animales además, las células mucosales son más grandes y contienen mayores niveles de enzimas digestivas (Savage y Whitt, 1982). Estas mismas células en los animales convencionales cambian su forma de columnar a más cuboides y el borde de brocha está menos definido y con microvellosidades cortas. La velocidad de pasaje de la digesta es mayor en este estado.

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Por otra parte, la acidez y el potencial redox son más elevados en los animales libres de gérmenes, lo cual afecta la absorción de minerales. El hierro se absorbe poco mientras el calcio es absorbido y retenido a niveles superiores (Jonsson, 1985).

Conclusiones •

La microflora del TGI forma un ecosistema abierto y de gran complejidad en el cual se cumplen los

principios de la ecología moderna. •

El número de microorganismos incrementa a lo largo del TGI y la composición varía en las diferentes

partes. Las bacterias pueden ser encontradas en el lumen tanto de forma libre como adheridas a las partículas del alimento o al epitelio. •

Los microorganismos que habitan en el TGI realizan diversas funciones que pueden repercutir tanto

de forma negativa como positiva en el hospedero. Por lo que el estudio y comprensión de este ecosistema es de gran valor para la salud y producción animal. •

La microflora del TGI está regulada por dos tipos de factores: los que ocurren dentro de la propia

microflora y aquellos que son inherentes al hospedero. BIBLIOGRAFÍA ¾ Alexander, M. 1971; Microbial Ecology; John Wiley y Son, Inc. New York, London, Sydney, Toronto. ¾ Bengmark, S. 1998; Ecological control of the gastrointestinal tract. The role of probiotic flora; Gut, 42: 2-7. ¾ Bennett, R.; Erikson, M. & Zetterstrom, R. 1987; Bacterial etiology of neonatal septicemia in relation to prior antibiotic treatment; Acta Paediatr. Scand. 76:673-674. ¾ Bennett, R. G.; Gorbach, L. S.; Goldin, B. R.; Chan, T.W.; Laughon, B. E.; Greenough, W. B. & Bartlett, J.G. 1996; Treatment of relapsing Clostridium difficile diarrhea with Lactobacillus GG; Nutri. Today 31(6): 35S-38S. ¾ Bertazzoni-Minelli, E.; Benini, A.; Beghini, A.; Cerrutti, R. 6 Nardo, G. 1993; Bacterial flora in healthy women of differnts ages; Microb. Ecol. Health Dis. 6:43-52.

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Sección II Digestión y Asorción de Nutrientes

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VI Metabolismo de los carbohidratos y absorción de los ácidos grasos volátiles (AGV) en el rumen Dra. Denia Delgado Fernández Contenido Introducción.............................................................................................................................................................................79 Los principales carbohidratos de las plantas............................................................................................................................80 Funciones de los carbohidratos................................................................................................................................................80 Carbohidratos no estructurales. ..........................................................................................................................................80 Carbohidratos estructurales ................................................................................................................................................81

Celulosa........................................................................................................................................... 82 Hemicelulosas ................................................................................................................................. 82 Sustancias pécticas.......................................................................................................................... 82 Lignina ............................................................................................................................................ 83 Digestión microbiana de los hidratos de carbono...............................................................................................................83 El metabolismo de los hidratos de carbono en los rumiantes. Formación de AGV.................................................................84 Formación de acetato. .........................................................................................................................................................85 Formación de propionato. ...................................................................................................................................................85 Formación de butirato.........................................................................................................................................................86 Metanogénesis .........................................................................................................................................................................86 Inhibidores de la metanogénesis ..............................................................................................................................................88 Metano.....................................................................................................................................................................................88 Interconversión de AGV en el rumen ......................................................................................................................................88 Succinato .............................................................................................................................................................................88 Patrón de fermentación ruminal...............................................................................................................................................89 Efecto del sustrato. ..............................................................................................................................................................90 Interrelación sustrato-PH-microorganismos.......................................................................................................................90 Utilización de los AGV ...........................................................................................................................................................91 Métodos para medir la producción de AGV en el rumen. .......................................................................................................92 Procesos fisiológicos que acompañan a la absorción..............................................................................................................92 Absorción de AGV ..................................................................................................................................................................93 Conclusiones............................................................................................................................................................................95 Bibliografía a consultar............................................................................................................................................................95

Introducción Las partes aéreas de las plantas consisten en fracciones ricas en fibra que no pueden ser utilizadas por el hombre porque no posee enzimas en su tracto digestivo capaces de romper los enlaces β que enlazan los azúcares sencillos en grandes cadenas para formar los polisacáridos estructurales celulosa y hemicelulosa. Los herbívoros, especialmente los rumiantes, son los animales más efectivos en degradar los materiales fibrosos debido a la estructura de su estómago donde habitan en su primera porción (rumen) una gran variedad de microorganismos que producen las enzimas necesarias para digerir los compuestos fibrosos y hacerlos aprovechables por el animal. La fermentación de los carbohidratos en el rumen produce fundamentalmente ácidos orgánicos de cadena corta (ácidos grasos volátiles, AGV) que son la principal fuente de energía de los rumiantes. Además estos compuestos son precursores de la grasa y la lactosa de la leche. 79

Existen interacciones entre la dieta, el manejo, el PH ruminal y otros muchos factores que determinan el patrón de fermentación que se establece en el rumen, lo cual influye grandemente en los indicadores productivos de los animales. El objetivo de esta conferencia está encaminado a profundizar en el conocimiento de la utilización de los carbohidratos de las plantas por el rumiante, el metabolismo ruminal y la manipulación de los patrones de fermentación con el fin de mejorar la eficiencia de los sistemas productivos tropicales. Los principales carbohidratos de las plantas Los carbohidratos son los compuestos más abundantes en las plantas. Ellos producen alrededor del 5080 % de la materia seca de los forrajes y son extremadamente importantes desde el punto de vista nutricional, porque constituyen la fuente primaria de energía en las dietas de los rumiantes (Moore y Hatfield, 1994). La palabra “Carbohidrato” se deriva del francés “hidrate de carbone” y en un principio se aplicó a los compuestos químicos neutros formados por carbono (C), hidrógeno (H) y oxígeno (O), en los que estos últimos elementos se encontraban en proporciones iguales que en el agua. Esta definición todavía es válida, pero en la actualidad se incluyen dentro del grupo cierto número de derivados de los azúcares y sus polímeros. Los carbohidratos según el número de moléculas que los componen se clasifican en: Monosácaridos: Azúcares sencillos. La mayoría de los monosacáridos naturales se dividen pentosas (5 átomos de carbono) y hexosas (6 átomos de carbono). Se caracterizan por tener sabor dulce, son solubles en agua y ópticamente activos. Los azúcares sencillos se pueden unir en grupos de dos (disacáridos), de tres, (trisacáridos), etc. Olisacáridos: (oligo = Poco). Son aquellas cadenas carbonadas formadas por la unión de un grupo de monosacáridos. Pueden tener hasta alrededor de 20 residuos de azúcares. Polisacáridos: Carbohidratos macromoleculares. Se clasifican de acuerdo con las clase de azúcar que producen al ser hidrolisados. Por ejemplo, las glucosanas son polímeros formados por cadenas de glucosa, las fructosanas, por cadenas de fructosa y así respectivamente. Entre los polisacáridos también se encuentran las pectinas, gomas, mucílagos y sustancias similares Heteropolisacáridos: Son polisacáridos mixtos que se producen por hidrólisis, son mezclas de monosacáridos y productos derivados. Funciones de los carbohidratos Los carbohidratos en las plantas tienen las funciones primarias de servir como sustancias energéticas de almacenamiento o como sostén en las estructuras rígidas de los vegetales, por lo que usualmente se clasifican en carbohidratos estructurales y no estructurales. Carbohidratos no estructurales.

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La glucosa, fructosa y sacarosa y los polisacáridos de almacenamiento almidón y fructosanas son los principales carbohidratos no estructurales presentes en los tejidos vegetales. Su concentración depende de la especies de plantas y de factores ambientales que afectan el crecimiento de éstas (luz, temperatura, estado nutricional). La sacarosa y otros azúcares solubles, generalmente, se encuentran en concentraciones más altas en las leguminosas que en las gramíneas y en pastos templados que en pastos tropicales Estos carbohidratos son solubles en agua y representan una fuente de energía rápidamente disponible para los microorganismos ruminales. El valor energético potencial de los carbohidratos es de 4 kcal de energía/gramo aproximadamente. Los forrajes con altos niveles de CHO solubles usualmente son los más digestibles. El almidón es la principal sustancia de almacenamiento de energía en las plantas. Es un polisacárido compuesto de unidades de α-D-glucosa y se presenta en dos formas: amilosa y amilopectina. La amilosa es una cadena linear de unidades de α-D-glucosa unidas por enlace 1-4. Tiene un peso molecular relativamente bajo, con menos de 2000 residuos de glucosa por molécula. La amilosa es soluble en agua y toma una conformación helicoidal en solución. La amilopectina es una molécula altamente ramificada con cadenas de α-D-glucosa unidas por enlaces 1-4 y 1-6. Es más pesada que la amilosa y generalmente contiene entre 2,000 y 220,000 residuos de glucosa. La solubilidad del almidón es variable en agua en dependencia de su contenido en amilopectina (Hacker, 1981). Los carbohidratos de almacenamiento, según su naturaleza, permiten dividir las plantas por especies: Las leguminosas tropicales y templadas (plantas C4) acumulan almidón y sacarosa. En las leguminosas el almidón se almacena en hojas y tallos, pero en las gramíneas tropicales las altas concentraciones de almidón se encuentran en las hojas. El almidón que se acumula en las hojas y tallos de las leguminosas y gramíneas tropicales es poco soluble en agua y en el fluido ruminal. Las gramíneas templadas (plantas C3) acumulan sacarosa y fructosanas más que almidón, fundamentalmente en los tallos. La presencia de estos carbohidratos solubles incrementa la densidad de energética de la dieta, por lo que mejora el suministro de energía en el rumen y determina la cantidad de proteína bacteriana producida. Sin embargo, no estimulan la rumiación o la producción de saliva y cuando se encuentran en exceso pueden inhibir la fermentación de fibra (Wattiaux y Armentano, 1996). Carbohidratos estructurales Los polisacáridos celulosa (β 1-4 D glucosa), hemicelulosas (β 1-4 D xilopiranosa, β 1-4 D- glucosa y D- manosa) y las sustancias pécticas (α 1-4 D-ácidos galacturónico, galactanos y arabanos) son los carbohidratos estructurales que forman las paredes celulares de las plantas. Ellos representan entre el 30-80 % de la materia seca del forraje y determinan su calidad. Los carbohidratos fibrosos constituyen la principal fuente de energía para los rumiantes. Sin embargo, para obtener esta energía, necesitan romper los enlaces β 1-4 que unen los azúcares en largas cadenas. Los animales superiores no producen las enzimas necesarias para realizar esta función, por lo que el proceso tiene lugar gracias a la gran población microbiana que habita en el rumen y que secreta estas enzimas. Las paredes celulares de las plantas también contienen en menores proporciones taninos, proteínas, minerales y lignina, los que afectan la digestión de la celulosa y las hemicelulosas en el rumen. 81

Celulosa. La celulosa es el carbohidrato más abundante en la naturaleza. Representa entre el 4-20 % de las plantas superiores. Se forma por unidades de glucosa que se enlazan unas a otras por el carbono 1 de una molécula y el carbono C4 de la otra, en posición β 1-4-glucósídicos muy estables. Los polisácáridos celulósicos pueden llegar a tener hasta 15,000 unidades de glucosa. Las asociaciones entre cadenas se estabilizan por puentes de hidrógeno. La celulosa pura es una rareza biológica en la naturaleza y sólo está presente en . algunas fibras, como por ejemplo el algodón. Las moléculas de glucosa están ordenadas en formas de microfibrillas y pueden contener además de los β 1-4-glucanos, pentosanas, cutina y sílice. El proceso de transformación bioquímica de la celulosa en COH solubles lo llevan a cabo los microorganismos ruminales y se conoce por celulolisis ruminal. La celulolisis es el hecho más sobresaliente de la digestión de los rumiantes. Las bacterias y los hongos celulolíticos producen un complejo de β 1-4 glucosidasas que hidrolizan la celulosa a cadenas lineales de anhidroglucosa, glucosa, oligosacáridos y celobiosa, la cual finalmente se degrada hasta glucosa 1-fosfato por un mecanismo fosforolítico (fig. 1 ). Los productos de la fermentación de la celulosa en el rumen varían en dependencia de los microorganismos predominantes, pero en general se reconocen los ácidos grasos volátiles (fórmico, acético, butírico, succínico, láctico ), etanol CO2 y H2. Hemicelulosas Las hemicelulosas son polisacáridos complejos. Su factor común es el enlace β 1-4 en el núcleo central del polímero de xilano, aunque las ramificaciones ocurren otros tipos de enlaces glucosídicos. En los forrajes de mala calidad, de la familia Grammineae, los xilanos son predominantes y también están presentes galactosa, manosa, y glucosa en pequeñas cantidades. Los microorganismos ruminales degradan las hemicelulosas. Su digestión transcurre de forma muy similar a la de la celulosa. Las enzimas de la hidrólisis de las pentosas catalizan la ruptura de los enlaces β 1-4 xilosídicos para producir xilosa, xilo-oligosacáridos y xilobiosa. La hidrólisis de la xilobiosa también produce xilosa. La xilosa se degrada por la vía de las pentosas hasta formar fructosa 6-fosfato y triosa- fosfato, los cuales se convierten vía glicolítixca, en compuestos de tres carbonos (Fig. 1).

Sustancias pécticas Son macromoléculas polisácaridas filamentosas de alto peso molecular , formadas fundamentalmente por arabanos, galactanos y mananos, enlzados con ácidos poliurónicos. Son más abundantes en las plantas dicotiledóneas, fundamentalmente en los frutos y en los forrajes de leguminosas. Son muy solubles. Se degradan fácilmente en el rumen y producen metanol, oligourónidos, ácidos galacturónicos (Acidos péctico y pectínico) y azúcares simples. La poligalacturinasa cataliza la 82

hidrólisis de los enlaces β 1-4glucosídicos de las sustancias pécticas para formar los ácidos galacturónicos. La posterior fermentación de estos involucra la formación de pentosas y su fermentación es similar a lo descrito anteriormente para estos compuestos Lignina La lignina es una macromolécula tridimensional cuyos principales precursores son compuestos fenólicos, principalmente los alcoholes p-coumaril, coniferil y sinapil. La lignina está enlazada a los polisacáridos estructurales. Es prácticamente indigestible. Su digestión requiere de un proceso oxidativo que no ocurre en el rumen, sin embargo, en la actualidad se reconoce que ella puede ser alterada. Su presencia en mayor o menor proporción en los materiales fibrosos, determina, en gran parte, su digestibilidad. A medida que la planta madura, el contenido de lignina se incrementa y el grado de fermentación de celulosa y hemicelulosa en el rumen se reduce. Los carbohidratos estructurales tienen un papel importante en el mantenimiento de las condiciones fisiológicas del rumen. La presencia de partículas fibrosas largas es necesaria para estimular la rumiación. Por otra parte, el equilibrio entre carbohidratos fibrosos y no-fibrosos es importante en la alimentación de los rumiantes para lograr altas producciones, fundamentalmente para la producción de leche. Digestión microbiana de los hidratos de carbono. A partir de los hidratos de carbono se obtienen los compuestos de mayor importancia energética para los rumiantes, los AGV. Estas sustancias se absorben desde el RR y producen entre el 50-80 % de la energía metabolizable (EM) que ingiere el animal. Los carbohidratos a su vez, son los precursores más importantes para la síntesis de grasa y azúcar (lactosa) de la leche en las vacas. Las vías para la fermentación de los principales carbohidratos de las plantas se presentan en la figura 1.

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En general los azúcares y los carbohidratos solubles se degradan rápidamente, mientras que los polisacáridos estructurales son atacados con rapidez variable. Los materiales de más difícil degradación son la celulosa y la hemicelulosa, cuya estrecha asociación con la lignina los hace menos asequible a la acción microbiana. Los mamíferos poseen enzimas en su tracto digestivo capaces de convertir el almidón y los azúcares solubles en glucosa que desde el punto de vista energético es superior que los AGV. Sin embargo, estos carbohidratos son fermentados en el rumen lo que constituye una pérdida energética inevitable para el rumiante. El metabolismo de los hidratos de carbono en los rumiantes. Formación de AGV. Durante la fermentación ruminal, la población de microorganismos, principalmente las bacterias, fermentan los carbohidratos para producir ácidos grasos volátiles AGV), gases (metano, CH4 y CO2) y calor. Las vías metabólicas de formación de los AGV y sus implicaciones para la producción de energía en forma de ATP, están bien descritas en la literatura. Los carbohidratos utilizan vías diferentes hasta convertirse en piruvato que es el intermediario universal en la síntesis de los AGV. La óxido reducción de piruvato seguida por una descarboxilación conduce a la formación de acetil-CoA que a su vez, se transforma en acetato. El butirato se forma por condensación de dos moléculas de acetil-CoA y el propionato tiene dos vías de formación; a partir del succinato y del ácido láctico (figura 2). Los ácidos acético, propiónico y butírico conforman la mayoría (>95%) de los ácidos producidos en el rumen.

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Figura 2. Esquema de la formación de los principales AGV en el rumen a partir del piruvato

Formación de acetato. El acetato se puede formar a partir del piruvato siguiendo más de un mecanismo. Sin embargo en el rumen parecen predominar dos: 1. Tipo clostridium Piruvato+ CoA + FD Acetil CoA + P Acetil-P + ADP

CO2 + acetil CoA + FDH2 Acetil-P + CoA Acetato + ATP

2. Tipo coli-aerógenes Piruvato + P Acetil-P + ADP

Formiato + Acetil-P Acetato + ATP + H2 + CO2

Formación de propionato. Se conocen dos vías para la conversión de piruvato en propionato. La primera involucra la formación de oxaloacetato y succinato y la segunda, la formación de lactato a acrilato. Ambas vías pueden ocurrir en el rumen, pero al parecer la vía del succinato es la principal. Sin embargo, su importancia individual depende del tipo de dieta. La vía del acrilato predomina en animales alimentados con dietas altas en carbohidratos de fácil fermentación y en presencia de una deficiencia de azufre, probablemente, por un cambio en la microflora ruminal. 85

Formación de butirato. La síntesis de butirato puede ocurrir en el rumen a partir del acetato o de compuestos que dan actilCoA, tales como piruvato o glutamato. La síntesis de butirato a partir de acetato utiliza dos vías, pero la que predomina más es la inversión de la beta- oxidación. La formación del acetil-CoA del acetato involucra una reacción de dos pasos con la formación de acetil fosfato por la acetoquinasa, que requiere 1 mol de ATP por mol de acetato activado y la transferencia de la función acetil a la acetil-CoA. En la segunda vía interviene el malonil-CoA que requiere 2 moles de acetato. Esta ruta es energéticamente más costosa que la primera que sólo requiere 1 mol de ATP. Metanogénesis Durante los procesos de fermentación ruminal se producen grandes cantidades de dióxido de carbono, metano y amoníaco, menores cantidades de nitrógeno sulfídrico y monóxido de carbono y probablemente, trazas de otros gases. De acuerdo con la estequiometría de la fermentación ruminal. (Tabla 1) es posible calcular las producciones de AGV, metano y ATP que se obtienen con diferentes raciones. Por cada mol de hexosa que se fermenta se producen 0,58 moles de metano (para el almidón y la celulosa pueden ser 162 g en peso seco). Tabla 1. Estequiometría de la fermentación ruminal 31 hexosa + 62 H2O 11 hexosa + 22 H2 16 hexosa 58 hexosa + 40 H2O 134 H2 + 33,5 CO2 58 hexosa + 40 H2O 38,956 cal

62 CH3COOH + 62 CO2 + 124 H2 CH2 22 CH3CH2COOH + 22 H2O 16 CH3 CH2CH2COOH + 32 CO2 + 32 H2 62 Hac + 22 HPr + 16 Hbut + 94 CO2 + 134 H2 35,4 CH4 + 67 H2O 62 Hac + 22 HPr + 16 Hbut + 60,5 CO2 + 33,5 CH4 +27 H2O 13 000 cal 8070 cal 8340 cal 7030 cal

El metano es un gas contaminante del ambiente. El metano constituye además, una pérdida energética considerable, ya que representa entre 7 y 8 % de la energía bruta consumida. Las pérdidas que originan la producción de metano pueden fluctuar entre 2,5-33 millones de t de alimento anuales (Ruiz y Dearriba, 1987). Se ha estimado que la población de rumiantes del mundo produce 77, 000 000 t de metano anualmente, lo cual constituye alrededor del 15 % de la emisión total del gas atmosférico (Mc Allister et al. 1996, Asanuma, 1999). Hasta la fecha la producción de metano por los rumiantes es una consecuencia inevitable de la fermentación de los carbohidratos en el rumen. El metano se forma por la acción de las bacterias metanogénicas que reducen el CO2 a CH4 a través de intermediarios reductores (formil, metenil, metilenil y metil). Se considera el ácido fórmico como la fuente más probable de hidrógeno para que ocurra esta reacción, aunque el formato, acetato, metanol y mono, di y tri- metilamina pueden servir 86

como sustratos para la metanogénesis. El ciclo propuesto para la reducción del CO2 a metano se presenta en la figura 3.

Figura 3. Ciclo de la urea

La cantidad de metano producida varía dependiendo de factores tales como la digestibilidad, el nivel de alimentación, y las características físicas y químicas de la dieta. La producción de metano se incrementa rápidamente después de la alimentación y llega al máximo en dos horas; poco después declina invariablemente. Asimismo, a medida que la digestibilidad de la ración es mayor, la producción de metano disminuye. La principal vía de excreción del metano producido en el rumen es la eructación, mientras que el metano producido en las partes bajas del tracto digestivo se expulsa a través de los pulmones y del recto. Aunque los metanógenos no producen enzimas fibrolíticas ellos aumentan la eficiencia energética y la magnitud de la digestión de la fibra de otros microorganismos ruminales porque previenen la acumulación de nucleótidos reducidos (ej. NADH) a través de inter especies que transfieren H2 (Joblin et al. 1989, Willians et al, 1994, Mc Allister et al. 1996). El clásico ejemplo de Interespecies en la transferencia de H2 es el co-cultivo de R. Albus, R. flavefaciens y un metanógeno

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Inhibidores de la metanogénesis Debido a la sustancial pérdida de energía de los alimentos como metano en los rumiantes, existe un marcado interés en reducir su producción. Varios compuestos, en particular, los ácidos grasos de cadena larga (AGCL) (tabla 2) y los halógenos de CH4 son efectivos. Sin embargo, in vivo la población microbiana se adapta o degrada muchos de estos compuestos y raramente se han encontrado efectos favorables en el comportamiento animal (Jouany, 1994, Mc Allister et al. 1996). Algunos metanógenos son sensibles por un corto tiempo a los ionóforos, pero se adaptan a ellos después de una prolongada exposición. Tabla 2. Inhibición de la metanogénesis por ácidos grasos de cadena larga Productos finales Metano Ác. Propiónico Ác. Butírico Total

Distribución del H marcado %) Experimento 1 Experimento 2 Control 60 µ de C-18 Control 60 µ de C-18 56.4 37.9 5.7 100.0

21.6 76.5 1.9 100.0

47.9 45.6 6.5 100.0

37.8 60.9 1.3 100.0

Se puede lograr una depresión en la metanogénesis si se logran altos niveles de fermentación y pasaje a través del rumen, lo que puede incrementar el porcentaje molar de propiónico y disminuir el acetato y los AGV totales. Interconversión de AGV en el rumen Durante la fermentación activa en el rumen, tiene lugar una interconversión sustancial entre los AGV. Esto refleja, sin dudas, el hecho de que un ácido, que es el producto final de un microorganismo pueda ser un sustrato útil para otra especie. Un ejemplo de lo anterior aparece en la tabla 3 donde se muestra el comportamiento de dos tipos de bacterias frente a la celulosa. Tabla 3. Interrelación metabólica entre dos microorganismos del rumen Ración

Succinato

Productos (mM) Propionato Acetato

Formato

0,2 % celulosa S. ruminantum B. succinógenes Ambos

0.0 13.5 0.0

2.8 0.0 15.9

4.5 6.2 10.1

1.2 2.8 0.2

0.0 6.5 0.0

0.0 0.0 8.5

0.0 5.3 5.4

0.0 4.9 1.7

0,1 % celulosa S. ruminantum B. succinógenes Ambos

Los datos que se presentan en la tabla 4 indican que del acético pueden producirse cantidades considerables de butírico (40-80 %), probablemente por condensación de dos moles de acético para formar un mol de butírico. Estos datos indican también que cantidades muy pequeñas de acético proviene del propiónico (0-5 %) y propiónico del butírico (2-5 %). En cambio considerables 88

cantidades de acético proceden del butírico, lo que parece ser ventajosa, puesto que hay una ganancia neta de energía en forma de ATP. Sin embargo, parece haber una pérdida de energía cuando se sintetiza butirato a partir del acetato. Se ha calculado en dietas de forraje que el 14 % del acético que se produce en el rumen se convierte en ácido butírico y el 3 % del butírico en acético. Tabla 4. Interconversión de los AGV en el rumen Ración Heno de trigo Heno de Graminea Barcia de alfalfa Alfalfa y paja de trigo Maíz y Alfalfa

% acet. a partir del But. Prop.

%prop. a partir del Acet. But.

% butir.a partir del Acet. Prop.

6

3

27

4

80

13

20 11

4-5 0

14 4

4-5 3

61 47

4-5 0

6 12

0.2 0.2

3 6

2 3

40 44

0.3 0.2

Como se aprecia la S. ruminantum sola no produce succinato mientras que la B, succinógenes sí. Ahora bien, cuando ambos microorganismos se encuentran en el mismo medio con 0,2 % de celulosa no aparece succinato. En la misma tabla observamos que la S. ruminantum produce 2,8 moles de propionato y que el B. succinógenes no lo forma. Sin embargo, cuando aparecen juntos se producen 15,9 mM de propionato. Este resultado De esto indica que el succinato formado por el B. succinógenes es utilizado como fuente de energía por la S. Ruminantum y resulta en un incremento de la proporción de succinato en el sistema. Patrón de fermentación ruminal La concentración total de AGV en el rumen y las cantidades de cada uno de ellos dependen de la dieta y de las condiciones de manejo en que esta se consume. En dependencia de la fuente de carbohidratos variará la cantidad y la relación de AGV producidos. Esta proporción es característica para cada situación dada y recibe la denominación genérica de “Patrón de fermentación ruminal”. La concentración de AGV en el rumen oscila entre 60 y 120 Meq/litro. Los cambios en la dieta y la digestibilidad de los alimentos pueden modificar el patrón de fermentación, aunque el producto más abundante es siempre el acetato. El incremento de la digestibilidad ejerce un efecto positivo en la producción de AGV en el rumen. Cuando la digestibilidad aumenta hasta un 60 % se observa un incremento en los niveles de acetato. A mayores digestibilidades el acetato comienza a declinar a medida que el propionato y el butirato se elevan. Otros factores que influyen en la concentración de AGV en el rumen son : la absorción ruminal, la interconversión , la degradación y el pasaje a las regiones inferiores del tracto digestivo.

89

Efecto del sustrato. La concentración de AGV en el rumen y las cantidades de cada uno de ellos dependen en gran medida del sustrato que se ofrece la dieta. Con alimentos fibrosos el patrón de fermentación es predominantemente acético, con una proporción aproximada de 65 % de acético, 20 % de propiónico y 15 % de butírico. Raciones muy ricas en almidones (concentrados), incrementan la proporción de propiónico hasta alrededor de 40 %. En dietas altas en miel es característico encontrar mayores proporciones de ácido butírico. En la tabla 5 se presentan los patrones de fermentación que se obtienen con diferentes dietas. Tabla 5. Proporciones molares de AGV en diferentes dietas AGV, % MOLAR Dietas Caña de azúcar Miel/urea Granos de cereales Heno de alfalfa Pasto de gramíneas Saccharina pienso Heno molido/Concentrado (50/50)

Acético

Propiónico

Butírico

Otros

62.5 31.0 39.0 74.0 66.0 64.0 51.0

23.9 19.0 40.0 18.5 18.5 19.0 31.0

13.5 41.0 21.0 7.5 11.5 11.0 12.0

9 6.0

Por lo general, los carbohidratos no-fibrosos rinden más AGV. Sin embargo hay que tener en cuenta que dietas muy ricas en almidones provocan que el porcentaje de ácido acético disminuya por debajo de 40%, mientras el porcentaje de propionato aumenta en más de 40%. En estos casos, es posible aumentar la producción de leche porque el suministro de glucosa proveniente de propionato se incrementa, pero cuando la producción de propionato es demasiado alta produce un efecto negativo en la salud de las vacas porque tiende a producir hígado graso, distocia y cetosis ruminal, pero el aporte de ácido acético para el síntesis de grasa puede comenzar a ser limitante. Además, la reducción en disponibilidad de ácido acético se asocia con una reducción de producción de grasa y una bajo porcentaje de grasa en la leche. Por el contrario, cuando predomina en la dieta un forraje de muy baja calidad, se limita la energía y la producción de leche. (Wattiaux y Armentano, 2000). En resumen, un cambio en la proporción de forrajes y concentrado en una dieta provoca cambios importantes en las características de los carbohidratos que tienen un efecto profundo en la cantidad y porcentaje de cada AGV producido en el rumen y a su vez influyen en la producción. Interrelación sustrato-PH-microorganismos. En el establecimiento del patrón ruminal intervienen una serie de procesos que ocurren en ecosistema ruminal y que se interrelacionan entre sí. Se sabe que el pH que la actividad de los microorganismos ruminales se realiza óptimamente cuando el pH del medio se corresponde con sus características culturales. Así, las bacterias celulolíticas desarrollan su actividad en un rango de pH de 6.5 a 7.0 mientras las bacterias que atacan al almidón y los azúcares lo hacen a pH inferiores. 90

La digestión de los alimentos por la flora microbiana conforma el patrón de fermentación, el que a su vez modifica el ambiente ruminal, principalmente el pH. Esta modificación del pH puede afectar a grupos específicos de microorganismos e inclusive hacer desaparecer algunas especies a favor del predominio de otros que al utilizar vías metabólicas distintas para degradar el sustrato originarán productos metabólicos en cantidades cuantitativamente diferentes. En la figura 3 se presenta de forma resumida las interacciones entre diferentes factores que intervienen en el establecimiento del patrón de fermentación ruminal DIETA

Velocidad de recambio

Microflora específica

Ambiente ruminal PH

Equilibrio microbiano

Manejo del Sustrato para los Catabolismo

Patrón de fermentación

Producción Animal

Figura 3 . Representación esquemática de la interrelación entre diferentes aspectos del ecosistema ruminal en el establecimiento de los patrones de fermentación

Utilización de los AGV Hasta hace poco tiempo y sobre la base de la teoría de Blaxter (1962) se consideraba que en rumiantes alimentados con dietas normales, el ácido acético se utilizaba ineficientemente y que como en dietas fibrosas, este ácido estaba en altas proporciones en el rumen, esto podía explicar por qué los forrajes se utilizaban menos eficientemente que los concentrados. Recientes estudios de Orskov y McLeod (1990) demostraron (con el uso de la técnica intragástrica) que para objetivos prácticos los 3 principales AGV se utilizan por los rumiantes con igual eficiencia energética. Las diferencias en la utilización de la energía metabolizable entre dietas de forrajes y concentrados se asocia hoy al costo de energía en el consumo y la rumiación y a las actividades que

91

realiza el rumiante, tales como estar de pie muchas horas. El trabajo muscular que se asocia con la ingestión y la digestión es mayor para dietas de forraje (Orskov, 1997). Métodos para medir la producción de AGV en el rumen. La producción de AGV in vivo se puede medir por diferentes métodos. El más simple se basa en el cálculo de esta producción a partir de la cantidad de materia orgánica digerida en el rumen y que no se recobra en la materia orgánica microbiana, usando las relaciones estequiométricas y las proporciones de AGV. Este método requiere un simple requerimiento quirúrgico (cánula ruminal), pero se basa en la asunción de que las proporciones molares de los AGV en el fluido ruminal representan las proporciones producidas. En la mayoría de las situaciones este criterio no resulta válido. Durante muchos años se han utilizado las técnicas de dilución isotópica para medir el metabolismo y la producción de AGV. Las mediciones de las velocidades de producción de estos ácidos grasos con estas técnicas demuestran una amplia variabilidad y errores (Sutton, 1985). En particular, el método usado para la estimación de los AGV totales en el rumen, en el cual la velocidad de dilución de un ácido marcado infundido de forma continua, no da aproximaciones exactas de las velocidades de producción de los AGV (France et al. 1987). Por el contrario, los resultados de este método dependen de la velocidad de absorción de cada ácido siendo proporcionales a sus concentraciones el fluido ruminal. El aporte de AGV también se puede medir a partir de la absorción neta de AGV en el sistema portal. Debido al metabolismo de los AGV por la mucosas del tracto, especialmente del ácido butírico y en menor extensión del ácido propiónico, las medidas de formación de productos dentro del rumen proporcionan los estimados más altos del aporte de los AGV que los realmente presentados para la producción de tejidos. También como resultado de su metabolismo preferencial hay poca concordancia entre las proporciones molares en el líquido ruminal y en la sangre periferal. Por tanto los estimados de producción de AGV por cualquiera de estos métodos deberán ser tratados cuidadosamente (Dijkstra (1994). En sentido general, aún en la actualidad resulta bastante difícil determinar las producciones exactas de AGV en el rumen. Las variadas y complejas interacciones que se producen en el rumen y la falta de técnicas apropiadas son la causa fundamental de que así sea. No obstante en la actualidad las técnica de infusión intragástrica desarrollada por Ǿrskov y sus colaboradores han permitido avanzar en este campo.

Procesos fisiológicos que acompañan a la absorción. La absorción de los AGV, así como de otras moléculas pequeñas como el agua, el NH3, y algunos minerales en el rumen se debe a la presencia de las papilas, que varían en número y longitud en relación con la región en que se encuentren. Son más numerosas en las zonas craneales y ventrales donde existen altas concentraciones de nutrientes solubles. Se ha demostrado que, donde las papilas son más numerosas, existe mayor absorción de AGV. 92

Las papilas consisten en una masa central de fibras colágenas densamente empaquetadas, rodeadas por un epitelio estratificado plano cornificado. Existe una gran red de vasos capilares sanguíneos y linfáticos que se encuentran en la región central y que son los encargados de llevar los AGV por vía sanguínea hasta la vena porta que los conduce al hígado. La presencia misma de los AGV estimula su absorción por el incremento concomitante del flujo sanguíneo. Absorción de AGV Debido a las características lipofílicas del epitelio ruminal, solamente los AGV no disociados son los que se difunden a través de la membrana. Una vez dentro, el AGV se disocia rápidamente debido a su bajo PK (4.8), comparado con el valor normal de pH normal en la célula (7.0), de ahí que se trasladen iones H+ hacia el interior de la célula. Estos iones H+ se reciclan vía intercambio Na+/H+ y conducen al aumento de la utilización de Na+ en la célula. Paralelamente con el intercambio de Na+/H+ trabaja el intercambio Cl-/CO3Gabel y Martens (1991) propusieron un modelo para explicar la posible interacción entre el transporte de AGV y los iones en el epitelio ruminal. En este modelo es de particular importancia un aporte intracelular de protones (fig. 4)

Fluido Mucosal

+

-

Epitelio

-

+ Fluido seroso

Na+ AGV– H+

H+ AGV-

AGV

AGV

HCO3Cl -

HCO3–

? H2O

+

CO2

Figura 4. Modelo propuesto por Gäbel y Martens (1991) para explicar la absorción de Acidos Grasos Volátiles (AGV) a través del epitelio ruminal.

Los resultados de estudios realizados por Djikstra (1994) ayudaron a soportar este modelo. Las velocidades de absorción fraccional se redujeron con el incremento en el pH del rumen. A valores de pH por encima de 7.0, se observaron absorciones significativas de los AGV, aún cuando de acuerdo con la ecuación de Henderson-Hasselbach, más del 99 % de cada ácido debería estar en la forma no disociada y no podría difundirse hacia la célula.

93

Por tanto, estas altas velocidades de absorción se obtienen probablemente, a través del aporte de iones H+ en el rumen, por intercambio Na+/H+ con incrementos en la velocidad a medida que como el pH cae. El metabolismo de los AGV en el epitelio ruminal incrementa su velocidad de desaparición desde el contenido ruminal, pero disminuye su velocidad de transporte a la sangre (absorción). De esta forma su velocidad de desaparición desde el rumen es proporcional al largo de la cadena carbonada (butírico> propiónico>acético) y su aparición en sangre es a la inversa (acético>propiónico>butítico), a lo que contribuye la mayor concentración de acético en el contenido ruminal En la tabla 6 se observa que la absorción de AGV no es directamente proporcional a su concentración en el fluido ruminal (Djikstra et al. 1993), lo que en contrasta con los resultados obtenidos en otros experimentos (Hogan, 1961, Oshio y Tahata, 1984). Sin embargo, se debe notar que en los casos donde se redujo la absorción, las concentraciones estaban por encima de los rangos fisiológicos normales. Los autores sugirieron que la baja absorción del acético a bajas concentraciones, pudo deberse a su metabolismo, mucho menor que el de los otros AGV y a las relativamente altas concentraciones en sangre, lo que resulta en una baja difusión contra gradiente. Las reducciones en la absorción fraccional a altas concentraciones, pueden estar relacionadas con la acumulación de AGV dentro de las células o a la limitadas disponibilidades de iones para su transporte (Bergman,1990, Thornley y Johnson, 1990, Dijskstra, 1994). Tabla 6. Efecto del PH inicial y la concentración de AGV individuales de soluciones experimentales introducidas en el rumen de vacas lecheras en la velocidad de absorción de los AGV (adaptado de Dijkstra et al. 1993) PH 4.5

5.4

Concentración (mM) 6.3

7.2

100

Velocidad de absorción fraccional (/h)

50

20

Acido acético

0.35

0.35

0.33

0.21

0.32ab

0.43a

0.18b

Acido propiónico

0.67a

0.54ab

0.51ab

0.35bc

0.44

0.51

0.60

a

b

b

0.54

0.45

0.60

Acido butírico

0.85

0.53

0.28

En la actualidad se reconoce que los ácidos grasos de cadena corta se metabolizan extensivamente en el epitelio ruminal durante la absorción (Bergman, 1990; Rémond et al. 1995), pero los resultados parecen indicar que las proporciones relativas de los AGV que se encuentran en el rumen puede que no representen las velocidades de producción relativas, particularmente a bajos PH o a muy bajas o muy altas concentraciones de AGV individuales y que para la estimación de las velocidades de producción de los AGV se den tomar en cuenta las velocidades de absorción diferenciales y por tanto el aporte al metabolismo intermendiario. Sutton (1985) indicó que la relación entre las relaciones de AGV producidos y la relativa concentración en el rumen parece ser más cerradas cuando las dietas son altas en forrajes que en concentrados y también en ovejas que en vacas.

94

Conclusiones La fermentación de los carbohidratos en el rumen produce ácidos grasos volátiles (AGV), principalmente acético, propiónico y butírico. La importancia nutricional de los AGV está dada fundamentalmente por el aporte energético que hacen al animal. Producto del metabolismo de los carbohidratos en el rumen también se produce metano, que es un gas contaminante del ambiente y que representa una pérdida importante de energía en el proceso. Las proporciones en que se encuentran los AGV en el rumen conforman un patrón de fermentación característico, que depende de la composición de la dieta, la disponibilidad de los nutrientes, el PH ruminal, las especies microbianas que se establecen, el manejo animal, etc. Los AGV se absorben a través de la pared ruminal hacia el flujo sanguíneo. El PH y las concentraciones en que se encuentran influyen en su desaparición desde el rumen hacia el interior de las células. Hasta hace poco tiempo se asumía que las proporciones de AGV presentes en el rumen representaban las proporciones a las cuales ellos se producían, pero en la actualidad existen dudas acerca de si la producción real y la que se estima por diferentes métodos, (todavía insatisfactorios), son las mismas. Estudios de los últimos años del pasado siglo años parecen poner en duda la validez de estos criterios. Las futuras investigaciones deberán estar dirigidas a mejorar el conocimiento de los factores involucrados en la producción y estimación de los AGV, unido con el conocimiento en la utilización de Nutrientes y las variaciones entre los animales para poder mejorar las predicciones en el comportamiento productivo. Bibliografía a consultar. Hacker, 1981. Moore y Hatfield, 1994. Wattiaux y Armentano, 1996. Ruiz, R. y Dearriba, 1987. Mc Allister et al. 1996, Asanuma, 1999. Joblin et al. 1989, Willians et al, 1994 .Wattiaux y Armentano, 2000. Blaxter. 1962. Orskov y McLeod. 1990. Orskov, 1997. Sutton, J.D. 1985. Digestion and absorption of energy substrates in the lactating cow. J.Dairy Sci. 68:3376-3393 Dijkstra, J. 1994. Production and absorption of volatile fatty acids in the rumen. Livestock Production Science. 39:61-69 Dijkstra, J., Boer, H.van Bruchem, J., Bruining, M. & Taminga, S. 1993. Absorption of volatile fatty acids from the rumen of lactating dairy cows as influenced by volatile fatty acids concentrations, PH, and rumen liquid volume. BR. J. Nutr. 69:385-396. Gäbel, G & Martens, H. 1991. Transport of Na+ and Cl- across the forestomach epithelium: Mechanism and interactions whit short- chain fatty acids. In Tsuda, Y. sasaki and Kawashima, R. (Eds). Physiological aspects of digestion and metabolism in ruminants. Academy Press Inc. san diego, US, pp. 129-151 Hogan, J.P. 1961. The absorption of ammonia through the rumen of sheep. Aust. J.Biol. Sci. 14:448-460 95

Oshio, S. & Tahata, I. 1984. Absorption of dissociates volatile fatty acids through therumen wallof sheep. Can. J. Anim. Sci. (Supplem.):167-168 Bergman, E.N. 1990. Energy contributions of volatile fatty acids from the gastrointestinal tract in various species. Physiology Rev. 70: 567-590

96

IX Digestión y absorción de lípidos en especies monogástricas. MSc Madeleidy Martínez Contenido Los lípidos. Características generales. .................................................................................................................................97 Digestión de lípidos. ...............................................................................................................................................................99 Fosfolípidos...........................................................................................................................................................................101 Colesterol..............................................................................................................................................................................101 Absorción y transporte........................................................................................................................................................102 Metabolismo de las lipoproteínas del plasma (resumen)..................................................................................................102 Metabolismo .........................................................................................................................................................................104 Síntesis ..................................................................................................................................................................................105 Degradación .........................................................................................................................................................................106 Regulación del metabolismo lipídico..................................................................................................................................108 Metabolismo del colesterol..................................................................................................................................................108 Empleo del colesterol...........................................................................................................................................................109 Los probióticos en el metabolismo lipídico........................................................................................................................109 Inclusión de grasas y aceites en las dietas para animales monogástricos........................................................................110 Conclusiones.........................................................................................................................................................................112 Bibliografía a consultar.......................................................................................................................................................113

Los lípidos. Características generales. Los lípidos son biomoléculas orgánicas insolubles en agua, que pueden extraerse de las células y de los tejidos mediante disolventes no polares, por ejemplo, el cloroformo, el éter o el benceno. Desempeñan diversas funciones biológicas importantes dentro de las cuales podemos señalar: 1. Como componentes estructurales de las membranas; 2. como formas de transporte y almacenamiento del combustible catabólico; 3. como cubierta protectora sobre la superficie celular relacionados con el reconocimiento célulacélula, la especificidad de especie y la inmunidad de los tejidos; 4. Poseen una intensa actividad biológica ya que se encuentran entre ellas algunas vitaminas (A, B, K) y hormonas. Los lípidos están representados principalmente por los triacilgliceroles (grasas y aceites) y en menor proporción por los fosfolípidos, ácidos grasos, esteroles (colesterol), ceras, pigmentos y otros compuestos. La molécula de triacilglicerol consiste de un alcohol: el glicerol, al cual se han esterificado tres moléculas de ácidos grasos, formando un lípido neutro. Así las grasas neutras contienen muy baja concentración de ácidos grasos libres. Su función en el organismo es principalmente como almacenamiento de energía (Fig. 1).

97

Figura 1. Estructura de un triacilglicerol.

Los ácidos grasos son la unidad estructural básica de los lípidos y están compuestos de una cadena carbonada que varía en longitud. Presentan un grupo terminal metilo y un grupo carboxilo (fig. 2).

Figura 2. Dos ácidos grasos corrientes (a) ácido esteárico, (b) ácido oleico.

La cadena hidrocarbonada puede ser saturada o puede tener uno o más dobles enlaces. Los ácidos grasos difieren entre sí, en primer lugar, por la longitud de su cadena, y también por el número y la posición de sus dobles enlaces lo que determina sus propiedades físicas y funcionales. Los más abundantes poseen un número par de átomos de carbono, con cadenas de longitudes comprendidas entre los 14 y 22 átomos de carbono, aunque predominan los de 16 a 18. Los ácidos grasos insaturados 98

predominan sobre los saturados. En la tabla 1 se presenta una lista de los ácidos grasos más comúnmente encontrados en las grasas y aceites utilizadas en la alimentación animal. Tabla 1. Ácidos grasos frecuentemente encontrados en las fuentes de grasas/aceites utilizados en la alimentación animal (Castaldo, 1998). Nombre Laurico Mirístico Miristoleico Palmítico Palmitoleico Esteárico Oleico Linoleico Linolénico

Átomos De C: Dobles Enlaces 12:0 14:0 14:1 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 18:3

Las plantas, a diferencia de los animales, pueden insertar dobles enlaces adicionales entre el doble enlace n9 y el metil terminus de la molécula. Debido a que estos ácidos grasos (linoleico y linolénico) no pueden ser sintetizados a partir de otras familias, ellos son definidos como ácidos grasos esenciales. Los ácidos grasos esenciales o sus derivados metabólicos pueden definirse entonces como ácidos grasos requeridos para el crecimiento normal y la integridad fisiológica y no pueden ser sintetizados endógenamente, por lo que se requiere un aporte exógeno. Los síntomas de deficiencia de ácidos grasos esenciales en aves son retardo del crecimiento, aumento del consumo de agua, reducida resistencia a enfermedades, entre otros. En las gallinas ponedoras disminuye la talla del huevo así como el peso y cambia la composición en ácidos grasos de la yema del huevo. Estos ácidos grasos influyen en la fluidez, actividad receptora y función enzimática de las biomembranas. Además, son metabolizados in vivo a moléculas de mayor peso molecular como los eicosanoides. Estos son un grupo de compuestos de 20 átomos de carbono con alta actividad biológica y corta vida media (hormonas locales) producidos por las células para actuar en el micromedio inmediato más cercano. Incluyen a los prostanoides que mantienen una función vascular normal y leucotrienos que además son agentes quimiotácticos para células del sistema inmune. Digestión de lípidos. El paso inicial para la digestión de los lípidos lo constituye la hidrólisis efectuada por las lipasas. Se han aislado lipasa: ¾ Lingual; ¾ Gástrica: ¾ Pancreática; ¾ Sensible a hormonas; ¾ Lipoproteica. Las dos primeras tienen un papel fundamental en los cerdos y conejos recién nacidos donde no existe todavía una madurez del páncreas. Una vez que se alcanza, entonces el páncreas libera a nivel de intestino delgado la lipasa. La lipasa lipoproteica actúa sobre los lípidos que atraviesan la linfa y llegan a la zona cercana del tejido adiposo o muscular a través de las lipoproteínas. 99

Las lipasas hidrolizan los triacilglicéridos. Dentro de sus características fundamentales tenemos: ¾ Son biomoléculas solubles en agua; ¾ Actúan sobre la superficie de los glóbulos grasos; ¾ Son catalizadores interfaciales, es decir, su actividad catalítica se manifiesta porque exhibe su sitio catalítico cuando se encuentra en la interfase líquido-ácido graso; ¾ Requieren de Ca, Mg, Cl, K; ¾ Requieren de la colipasa que garantiza el anclaje a la interfase; ¾ pH entre 7 y 8; ¾ Su acción aumenta bajo la influencia emulsionante de la bilis. Se ha estudiado la influencia del grado de emulsificación en la hidrólisis. Los resultados han mostrado que la función de la bilis es de promover, estimular la emulsificación y solubilización de los lípidos y esta función es debido a las sales de los ácidos biliares. La velocidad de la digestión del triacilglicerol depende, por tanto, del área superficial de la interfase, una cantidad que aumenta mucho por los movimientos peristálticos de agitación del intestino combinados con la acción emulsionante de los ácidos biliares. Estos últimos son detergentes digestivos potentes que se sintetizan por el hígado y son segregados por la vesícula biliar al intestino delgado en el que tienen lugar principalmente la digestión y la absorción de los lípidos. El mayor sitio de la digestión de los lípidos es el intestino delgado. En el duodeno el bolo alimenticio se encuentra con la bilis y el jugo pancreático. Ellos son alcalinos y funcionan en parte como neutralizantes del quimo gástrico. La emulsificación de los lípidos por las sales biliares es esencial para la digestión.

Figura 3. Estructura de los ácidos biliares principales y sus conjugados glicina y taurina.

El flujo del jugo pancreático igual que las sales biliares se regulan hormonalmente antes de la entrada del quimo gástrico dentro del duodeno. Cuando se elevan las concentraciones de HCl en el mismo, existe una liberación de secretina lo que trae como resultado que aumente la secreción pancreática y bicarbonato. Estos al emulsionarse con los lípidos forman jabones que estimulan la secreción de colecistoquinina. Este péptido estimula la secreción de bilis y enzimas pancreáticas (lipasa, fosfolipasas, colesterol esterasa). 100

Fosfolípidos. Se encuentra establecido que los fosfolípidos pueden ser formados en cantidades apreciables durante la absorción de grasa. Las lecitinas y las cefalinas son los más importantes fosfolípidos que se forman. Con respecto a la hidrólisis se piensa que se comportan de manera bastante semejante a las grasas neutras. Los ácidos grasos constituyentes de los fosfolípidos de la dieta pueden ser encontradas en un 80% esterificando las grasas neutras de la linfa. Si los fosfolípidos son hidrolizados hasta incluir la preparación de la base nitrogenada del grupo fosfato, la molécula resultante α-glicerofosfato es un punto de partida en la síntesis de triglicéridos y un punto de contacto con el metabolismo endógeno de los carbohidratos a nivel de la mucosa intestinal. La fosfolipasa en el tejido animal efectúa la hidrólisis como sigue: Lecitina

1234-

1

lisolecitina + ácido graso

2

glicerol fosforil colina + ácido graso 3 glicerol fosfato + colina 4 glicerol + fosfato

Fosfolipasa A. Aislado en el páncreas u otros tejidos animales. Fosfolipasa B. Aislado en el páncreas y el hígado. Glicerol fosforil colina diesterasa. Fosfomonoesterasa.

La hidrólisis en el intestino se supone transcurre por la misma vía. Colesterol. El colesterol es un esteroide que está presente en todas las células del organismo y es necesario para la propia vida. En el cuerpo realiza funciones importantes: ª Forma parte de las membranas celulares; ª Interviene en la formación de ácidos biliares, necesarios para la digestión de las grasas; ª A partir del colesterol se forman ciertas hormonas, como las sexuales y las esteroideas; ª En la piel, el colesterol se transforma en vitamina D por la acción de los rayos solares. Además, protege a la piel de la acción de muchos agentes químicos y evita la deshidratación por la evaporación. Es por tanto, una sustancia importante y natural que sólo resulta peligrosa para la salud cuando se encuentra en concentraciones elevadas en sangre. La hidrólisis de los ésteres del colesterol es sencilla por tener un solo enlace éster en esta molécula. Existen evidencias de una hidrólisis completa del éster de colesterol antes de ser absorbidos. El colesterol absorbido aparece esterificado en la linfa. Como las sales biliares son productos finales del colesterol, son de gran importancia ya que no solamente tienen función emulsificante de los lípidos de la dieta sino que una pequeña fracción escapa a la absorción y se excreta vía heces fecales. 101

Absorción y transporte. La mezcla de ácidos grasos, mono y diacilgliceroles producidas por la digestión de los lípidos es absorbida por las células que recubren el intestino delgado (parte superior del duodeno, yeyuno e íleon) en un proceso que facilitan los ácidos biliares y dependiendo la relación absorción/ lugar de absorción de la especie. La mezcla de grasa y sus productos de hidrólisis una vez en contacto con la pared intestinal son absorbidos, metabolizados y transportados por dos vías diferentes a la circulación. La vía principal de transporte es vasos linfáticos- conducto torácico y la otra vía es el sistema portal. En este último son transportados los ácidos de cadena corta principalmente en forma libre. El sistema linfático intestinal del pollo está menos desarrollado y difiere en su estructura con respecto a los mamíferos. Se plantea que por lo menos el 90% de la grasa absorbida entra en el sistema portal como lipoproteínas de muy baja densidad y no se han detectado quilomicrones (Bell y Freeman, 1983). La composición de la linfa del conducto torácico es la siguiente: Tabla 2. Composición de la linfa. Componentes Glicéridos Fosfolípidos Éster de colesterol Acidos grasos libres no esterificados

% 82 10 2 6

Dentro de la fracción de glicéridos el 90% esta constituido por triglicéridos. El problema de transportar lípidos una vez absorbidos por el intestino al vehículo acuoso de la sangre se resuelve estabilizando las partículas de lípidos con una cubierta de compuestos anfifílicos: fosfolípidos y proteínas. Las partículas resultantes son las lipoproteínas que son consideradas como agregados o microemulsiones de lípidos y proteínas con un grado de organización estructural. Existen varios tipos de partículas con diferente composición química, propiedades físicas y funciones metabólicas, pero su papel común es transportar lípidos de un tejido a otro para abastecer las necesidades de lípidos de los tejidos. Por métodos de ultracentrifugación se han clasificado de menor a mayor densidad en: quilomicrones; lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL) y lipoproteínas de alta densidad (HDL). A medida que la densidad disminuye el tamaño de la partícula se incrementa. En las aves aparecen las lipoproteínas de muy baja, baja y alta densidad. La grasa dietética es absorbida como lipoproteínas de baja densidad y no en forma de quilomicrón.

Metabolismo de las lipoproteínas del plasma (resumen) Después de la digestión y absorción de una dieta que contiene lípidos, los lípidos resintetizados por el intestino son transportados a la sangre en los quilomicrones, cuya función es precisamente transportar 102

lípidos de intestino a sangre. Los quilomicrones en sangre se enlazan en la enzima lipasa de lipoproteínas. Esta enzima cataliza la hidrólisis de los triglicéridos del núcleo de los quilomicrones, reduciendo su tamaño y contenido en triglicéridos. Componentes de superficie de los quilomicrones son recuperados en la fracción HDL y la partícula remanente denominada resto de quilomicrón es captada por el hígado mediante un proceso mediado por receptor de membrana. Este sendero descrito es conocido como la vía de transporte de lípidos exógenos (provenientes de la dieta). La vía de transporte de lípidos endógenos se inicia con la secreción de VLDL por el hígado. De igual modo a los quilomicrones estas partículas son degradadas por la lipasa de lipoproteínas endotelial hasta convertirlas en otro tipo de lipoproteínas, ricas en colesterol, cuyo producto final son las LDL. Restos de apolipoproteínas y fosfolípidos de la superficie de VLDL son transferidos a HDL durante este proceso. Las LDL son captadas por receptores hepáticos. Una vez enlazada la partícula el complejo receptorLDL es endocitado y sus componentes degradados por enzimas lisosomales. Los esteres de colesterol transportados por las LDL son hidrolizados por la colesterol ester hidrolasa y cualquier exceso de colesterol libre desencadena eventos regulatorios encaminados a prevenir su acumulación ulterior. Las LDL también pueden transportar lípidos a los tejidos extrahepáticos para su almacenamiento o para su utilización como combustible energético. La función principal de las HDL es captar colesterol no esterificado de las membranas biológicas y transportarlo al hígado que es el único órgano capaz de promover la excreción de colesterol. Este proceso se denomina transporte reverso del colesterol. Una vez que el colesterol es captado por HDL, es esterificado seguido de la transferencia potencial del colesterol esterificado a lipoproteínas de menor densidad y finalmente es captado por el hígado (Fig. 4).

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Figura 4. Metabolismo de las lipoproteínas.

Metabolismo Todos los mamíferos pueden sintetizar ácidos grasos saturados (síntesis de novo) a partir de precursores simples como la glucosa y aminoácidos (fig. 5). El hígado y el tejido adiposo son los órganos más importantes. En las aves, el hígado es el asiento principal de la síntesis de los ácidos grasos, en contraste con el papel dominante del tejido adiposo en la lipogénesis de novo en los mamíferos. El bajo nivel de algunas enzimas activas en la lipogénesis, a saber, la acetilCoa carboxilasa, ATP citrato liasa, la enzima malato y hexosa monofosfato deshidrogenasa, explican la limitada capacidad del tejido adiposo para sintetizar los ácidos grasos. El papel dominante del hígado en la lipogénesis se mantiene durante toda la vida del ave, aunque influida por el contenido de grasa de la dieta y por algunos factores hormonales.

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Glucosa

Algunos aminoácidos Ácidos grasos

Piruvato Acetil CoA Malonil C A

Citrato Acetoacetil CoA CO2

Acetona

Acidos grasos β-hidroxi-β-metilglutarilC A Colesterol

Triglicérido

Fosfolípidos

Acetoacetat Ester de l t l

Esteroides D-β-hidroxibutirato

Acidos bili

Figura 5. Biosíntesis de lípidos, cuerpos cetónicos y esteroles a partir de precursores sencillos.

Síntesis El precursor común es el acetil CoA que es activado por la acetil CoA carboxilasa en presencia de CO2 para rendir malonil CoA. A continuación se suceden ciclos de adición de dos unidades de carbono por la acción concertada de un conjunto de enzimas en el complejo multienzimático ácido graso sintetasa. El ácido graso final usualmente es el ácido palmítico (16:0) o el esteárico (18:0). La introducción de dobles enlaces es catalizada por enzimas desaturasas. Como la posición inicial para introducir el doble enlace es entre los carbonos 9 y 10, esta enzima es llamada 9- desaturasa. El sustrato para esta enzima es el ácido palmítico que es desaturado a palmitoleico o el esteárico que es desaturado a oleico. Los animales, no pueden insertar dobles enlaces adicionales entre el doble enlace n9 y el metil terminus de la molécula. La síntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga ocurre a través de elongaciones y desaturaciones sucesivas y alternas.

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Degradación Los ácidos grasos se degradan a través de la β- oxidación, proceso que transcurre mediante cinco reacciones básicas: ¾ Formación del CoA tioester; ¾ α-β deshidrogenación del acil CoA ¾ Hidratación del enlace doble para formar 3-L- hidroxiacil CoA; ¾ Deshidrogenación del β- hidroxiacil CoA con formación del β- cetoacil CoA; ¾ Ruptura del enlace tiolítico del β- cetoacil CoA a fin de formar acetilCoA y un acil-CoA nuevo que contiene dos átomos de C menos que el original. La oxidación de los ácidos grasos no saturados y de los ácidos grasos de cadena con número impar de átomos de carbono también ocurre por la vía de la β oxidación, pero necesita de la participación de enzimas adicionales. La oxidación de los ácidos grasos de cadena impar generan propionil CoA que se convierte en succinil CoA para incorporarse al ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Este proceso ocurre tanto en mitocondrias como en peroxisomas. Este último se plantea que participa por la composición enzimática en el acortamiento de las cadenas de los ácidos grasos de cadena larga. Una fracción significativa del acetil CoA producido por la oxidación del ácido graso en el hígado se convierte en acetoacetato y D-β-hidroxibutirato que, junto con la acetona, se designan como cuerpos cetónicos. Los primeros dos compuestos se comportan como combustibles importantes para los tejidos periféricos. La biosíntesis del ácido graso se diferencia de la oxidación del mismo en varios aspectos. Mientras que la oxidación del ácido graso ocurre en la mitocondria empleando los ésteres acil graso CoA, la biosíntesis del ácido graso ocurre en el citosol, con la cadena en crecimiento del ácido graso esterificada a una proteína portadora de acilos (ACP). Las coenzimas redox son diferentes (FAD y NAD+ en la oxidación y NADPH en la biosíntesis) así como en la estereoquímica de las etapas intermedias de la ruta. La oxidación produce acetil CoA, mientras que el malonil CoA es el precursor inmediato en la biosíntesis. Se necesita HCO-3 en la biosíntesis pero no en la oxidación (Fig. 6).

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Figura 6. Biosíntesis y degradación de los ácidos grasos. Diferencias.

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Regulación del metabolismo lipídico. Existen dos mecanismos de regulación del metabolismo lipídico: • A corto plazo; • A largo plazo. La primera ocurre cuando la respuesta se produce en unos minutos o menos y está relacionada con el control de las actividades de los enzimas reguladores. La regulación a largo plazo se basa en la alteración de la cantidad de enzima presente por variaciones en las velocidades de síntesis y/o degradación de las proteínas. Este proceso requiere que transcurran horas o días. Las células pancreáticas α y β perciben los estados de dieta y energéticos del organismo a través de la concentración de glucosa en la sangre. Las células α responde a la concentración de glucosa baja de los estados de ayuno y de demanda de energía segregando glucagón. Las células β responden a la concentración de glucosa elevada en la sangre, de los estados alimentado y en reposo, segregando insulina. Estas hormonas regulan también, las velocidades de las rutas opuestas del metabolismo de los lípidos y controlan, por tanto, si se han de oxidar o sintetizar los ácidos grasos. Así, la acetil CoA carboxilasa, que cataliza el primer paso determinante en la síntesis de ácido graso es inhibida por la fosforilación dependiente de AMPc estimulada por glucagón y es activada por la fosforilación estimulada por la insulina. La relación glucagón – insulina es, por tanto, de importancia primordial en la determinación de la velocidad y de la dirección del metabolismo del ácido graso. Metabolismo del colesterol. Todos los átomos de C del colesterol derivan del acetato. Este se convierte primero en unidades C5 llamadas isopreno. Las unidades de isopreno se condensan a fin de formar un precursor lineal del colesterol (escualeno) y después se ciclan.

Figura 7. Todos los átomos de carbono del colesterol derivan del acetato.

El acetil CoA se convierte en isopreno por una serie de reacciones que comienza con la formación de hidroximetilglutaril CoA. Una de las etapas esta catalizada por la HMG-CoA reductasa que es

mediadora de la etapa determinante de la velocidad de la biosíntesis del colesterol y el enzima regulado de modo más elaborado de esta ruta.

Figura 8. Estructura del isopreno.

Empleo del colesterol. El colesterol es el precursor de las hormonas esteroides y de los ácidos biliares. Las hormonas esteroides se agrupan en cinco categorías: progestinas, glucocorticoides, corticoides minerales, andrógenos y estrógenos. La ruta más importante para la excreción del colesterol en los mamíferos es la formación de ácidos biliares (también llamadas sales biliares). Los probióticos en el metabolismo lipídico. La microflora intestinal influye en el metabolismo de los lípidos. Se conoce que las bacterias sintetizan ácidos grasos de novo y modifican los ingeridos con la dieta. Por otra parte, estas bacterias pueden inhibir la formación de micelas biliares y disminuye de esta forma la absorción del colesterol, lo que provoca la reducción de sus niveles en sangre. Asimismo, se ha demostrado que los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) pueden inhibir la síntesis de colesterol en el hígado. Se considera que el uso continuo de probióticos puede favorecer la producción de cantidades apreciables de estos ácidos, esta pudiera ser una de las causas por las que su empleo reduce los niveles de este metabolito (Ouwehand y col., 1999). Sanders y Huis in´t Veld (1999) plantean que los probióticos bacteriales presentan beneficios en la salud en cuanto a los lípidos sanguíneos y las enfermedades coronarias a través de tres mecanismos: • Asimilación del colesterol por las células bacteriales; • Alteración de la actividad de la enzima BSH; • Efecto antioxidativo. La utilización de probióticos en la dieta permite la eubiosis de la microflora intestinal y se obtienen mayores niveles de ácido láctico y AGCC totales (acético, propiónico y butírico) que son productos de la fermentación de los microorganismos del tracto. Los AGCC influyen en la disminución de los niveles de colesterol porque provocan inhibición de la enzima HMG-CoA reductasa (Endo y col., 1999). Sin embargo, Pérez (2000) obtuvo mayores niveles de ácido láctico y AGCC en el ileon y ciego de los grupos tratados con un hidrolizado de levadura con respecto al control en pollos de ceba y no se logró diferencias significativas en la concentración de colesterol entre los grupos estudiados. Ha sido demostrado que los Lactobacillus contribuyen a la eliminación de ácidos biliares y colesterol en las haces por su acción enlazante o unificadora y por la inhibición de la formación de micela. De

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esta forma, disminuye la absorción de ácidos biliares y causan un efecto inhibitorio en la absorción intestinal de micelas de colesterol (Susuki y col., 1991). La pérdida fecal de las sales biliares resulta, en un mayor requerimiento de colesterol como precursor para la síntesis de nuevas sales biliares y por tanto pueden reducirse los niveles de colesterol. Klaver y van der Meer (1993) sugirieron que la reducción de colesterol “in vitro” por algunos Lactobacillus sp. resulta de su coprecipitación con sales biliares desconjugadas. De Smet y col. (1994) sugirieron que especies de Lactobacillus que poseían la BSH altamente activas, reducen los niveles de colesterol del suero. La BSH activa de los Lactobacillus posee la ventaja de sobrevivir y colonizar el ID bajo donde el ciclo enterohepático tiene lugar (Du Toit y col., 1998). Jin y col. (1998), determinaron el efecto de los cultivos de Lactobacillus en varios parámetros productivos y en el colesterol en suero de broilers bajo condiciones tropicales. El nivel de colesterol en suero fue significativamente menor (P 1,063) Beta – LP con la LPBD (