AVANCES EN EL DIAGNOSTICO DE LABORATORIO DE TUBERCULOSIS EN GUATEMALA
Licda. Maria Remei Gordillo Jefe de Microbiología
Licda. Hilda Maria Ruiz Subcoordinadora TB y hongos
Septiembre 2013
Importancia del diagnóstico
Enfermedad infecto contagiosa de ALTO IMPACTO en salud pública (OMS) Atención inmediata a nivel global
Enfermedad reemergente debido a factores como Incremento de población en pobreza, desnutrición, hacinamiento Deterioro de los programas de control de enfermedad tuberculosa Epidemia de VIH/SIDA Multidrogorresistencia de cepas de Mycobacterium tuberculosis
Requisitos Para Un Diagnostico Adecuado
Determinación de la sintomatología del paciente. Establecer el sitio de infección Tiempo de evolución
Personal capacitado para dar indicaciones correctas para toma de muestra.
Insumos suficientes y adecuados para cada tipo de muestra.
Disponibilidad de insumos, horarios y personal para la recepción y procesamiento de las muestras.
Información adecuada del paciente y del sitio de la muestra Recaídas Pacientes nuevos Contactos
Tendencia De Los Métodos Diagnóstico
MEDIO SOLIDO
MEDIO LIQUIDO
MANUAL
AUTOMATIZADO
MAYOR TIEMPO
MICROBIOLOGIA
MENOR TIEMPO
BIOLOGIA MOLECULAR
Lo viejo Métodos convencionales
Lo Nuevo
Viejo no significa No útil
Utiles pero no esenciales
• Esta vigente
• Requieren desarrollo tecnológico.
• Accesible • Gol Stándar (cultivos, medio sólido)
• Mayor inversión y mas costoso.
• Tiene un mayor grado de sensibilidad. • En pruebas de susceptibilidad reducen el tiempo de resultados.
Unico diagnóstico certero por crecimiento de la micobacteria. Mayor sensibilidad. Permite tener viable la micobacteria para realización de test susceptibilidad.
Debilidades Crecimiento lento de 3 a 8
semanas. De no tener cuidado pueden haber contaminaciones que retrasan el resultado
Nuevas técnicas de Diagnóstico
Observación de Frotes • Tinciones de fluorescencia
Aislamientos primarios y Susceptibilidad • Sistemas automatizados con medios líquidos
Pruebas Moleculares • Pruebas de Tamizaje o diagnóstico presuntivo • Pruebas detección directa de especies de micobaterias
Observación de Frotes Tinciones de fluorescencia Tinción de Auramina Rodamina Ventajas Menor tiempo de observación Mayor sensibilididad Menor aumento para observación Desventajas Equipo técnico capacitado Confirmación con ZN Equipo mas costoso
Comparación entre la técnica tradicional de ZN y la tinción de Fluorescencia
Condicion
Auramina-rodamina
Fuschina
Aumento
400x
1000x
Maximo De Campos Observados
30
300
Tiempo Total Para Observar Un Extendido
3 Minutos S:96.5% E: 98%
15 Minutos S: 65-70%
La técnica de fluorescencia esta indicada para laboratorios que procesan un promedio de 25-30 frotes por técnico
Aislamientos primarios y Susceptibilidad Sistemas automatizados con medios líquidos Ventajas Detección más rápida, 2 semanas tanto para el aislamiento primario como para la sensibilidad. Mas sensible, detecta cantidades menores de bacilos. No requiere desarrollo tecnológico avanzado. No invasivos, no radioisótopos No necesita de subcultivos Desventajas
Es muy costoso
Sensibilidad Y Especificidad De Los Métodos Convencionales y Métodos Líquidos Método
Sensibilidad
Especificidad
MTD
86.0%
99.3%
Frote
64.9%
89.3%
BACTEC
84.2%
100%
Lowenstein Jensen
80.7%
100%
Microbiologia HR
Pruebas de Tamizaje o diagnóstico presuntivo
PRUEBAS MOLECULARES
Pruebas detección directa de especies de micobaterias
Otras pruebas
Pruebas De Tamizaje o Diagnóstico Presuntivo Sistema GeneXpert Identificación directa de la Muestra del Complejo M. tuberculosis y resistencia a Rifampicina
PCR EN TIEMPO REAL GENEXPERT Se basa en 3 principios: 1. Extracción de ADN 2. Hemi-nested PCR en tiempo real 3. Hibridación con 5 sondas complementarias de la región core del rpoB Detección de MTBC y mutaciones en rpoB (MDR)
1. 2. 3. 4.
Resistencia para RIF Manipulación manual 2-3 minutos PCR + hibridación simultánea (automatizada) Rápida, poco laboriosa y muy sencilla
Indicaciones para el uso adecuado según recomendaciones de la OMS
DESVENTAJAS GeneXpert • Esta metodología NO puede ser utilizada en pacientes con falla terapéutica. • Los pacientes con falla terapéutica deben tener 2 meses de no tomar ningún antifímico • Es una prueba bastante costosa • Para ciertos tipos de muestra es necesario realizar procesos de decontaminación
Pruebas Detección Directa De Especies De Micobaterias
• El bacilo es identificado por hibridación molecular en sondas de ADN marcadas con primers específicos • Resultados en dos o tres horas posterior a la preparación de la muestra • En muestras respiratorias • Sensibilidad 94.7% • Especificidad 100% Journal of Microbiology Pag 834-841 JAMA feb2 2002 VOL283 pag639-645
Pruebas Detección Directa De Especies De Micobaterias VENTAJAS
DESVENTAJAS
• Detecta y amplía secuencias genómicas de ADN y ARN • Gran sensibilidad puede detectar muestras con carga bacilar de 1-10 bacilos • Es Especifica: reconoce genero y especie en horas. • La sensibilidad en PLE y esputo va de 90-100%
• Problemas de contaminación ambiental con fragmentos libres de ADN o ARN (falsos positivos) • Costos elevados • Laboratorio especializado • Personal Capacitado
Identificación por hibridación en tiras Genotype Producto/ Genotype
Identificación
Tipo de muestra
Mycobacterium CM
Mycobacterias comunes
Cultivo sólido/liquido positivo
Mycobacterium AS
MTBC
Mycobacteria Direct
Especies Adicionales Diferenciación entre las especies del complejo M. tuberculosis •Complejo M. tuberculosis •M. Avium •M. Intracellulare •M. Kansasii •M. malmoense
Blanco
Sensibilidad
Especificidad
ADN
97%
93.5%
Cultivo sólido/liquido positivo
ADN
96%
94%
Cultivo sólido/liquido positivo
ADN
100%
100%
Muestras decontaminadas
ARN
Esputo 97.5% Esputo 83.3%
: :
Esputo 99% Esputo 99%
: :
Resistencia a Drogas por Genotype Hibridación reversa Genotype MTBDRplus • Detección simultánea del complejo M. tuberculosis y de las mutaciones más frecuentes a Rifampicina ( gen rpoB) e Isoniacida (inhA y KatG) • PCR + hibridación (manual) • Buena relación costo-beneficio
Hibridación reversa Genotype MTBDRsl • Resistencia a Fluoroquinolonas (gyrA), antibióticos inyectables (gen rrs) y Etambutol (embB) • PCR + hibridación (manual) • Buena relación costo-beneficio
Indicaciones para el uso de Genotype MTBDRplus Para el diagnóstico de pacientes: 1. Después de fracaso al tratamiento y recaída 2. Con anamnesis (signos y síntomas de la enfermedad) y que provengan de zonas de alta prevalencia de MDR-TB 3. En países con alta prevalencia de tuberculosis y de alta carga de TB-MDR
Beneficios y ventajas del uso de Genotype MTBDRplus 1. Permite brindar un tratamiento temprano adecuado, lo que reduce la transmisión y propagación de TB-MDR 2. Se puede realizar a partir de un frote positivo de muestras pulmonares y a partir de cultivo 3. Los resultados se obtienen en en comparación con los métodos convencionales que demoran de 1 a 2 meses
Indicaciones de uso para Genotype MTBDRsl Para el diagnóstico de paciente 1. Con TB-MDR para recibir información sobre resistencias a antibióticos 2. Después de fracaso al tratamiento y recaída 3. En países con un elevado uso de los medicamentos 4. En las regiones de elevada carga TB-MDR-XDR
nuevas
Beneficios y ventajas de Genotype MTBDRsl 1. Detección de TB-XDR en pacientes previamente diagnosticados como TB-MDR 2. Confirmación de resultado por pruebas de susceptibilidad a drogas 3. Minimizar los efectos secundarios extremos a través de un esquema de tratamiento adecuado 4. Es económico, si comparamos el costo del tratamiento (costo/beneficio)
Otras pruebas 1. Prueba de LAM 2. Prueba de ADA El test de ADA, es un ensayo colorimétrico rápido, sencillo y de bajo costo. 3. Método de la luciferasa
Es muy costoso y tarda alrededor de 55 días para un resultado.
4. QuantiFERON
5. Cromatografía líquida de alta presión HPCL para determinación de patrones de ácidos micólicos 6. INNO-LiPA RifTB
Detecta de manera simultánea complejo Mtb y la presencia de mutaciones en el gen rpoB
Otras pruebas Prueba de LAM El LAM, de naturaleza glicolipídica, es el principal componente antigénico de superficie de las micobacterias El LAM inhibe la acción estimulante del Interferon en el macrófago La prueba Alere Determine™ TB LAM Ag es un análisis inmunocromatográfico diseñado para la detección cualitativa del antígeno lipoarabinomannan (LAM) de las micobacterias en orina humana.
Otras pruebas QuantiFERON
Ensayo de liberación de Interferón –gamma (IGRA) Diagnóstico de infección tuberculosa latente No distingue entre la infección latente y la TB activa Un resultado positivo de IGRA no indica TB activa y un resultado negativo de IGRA no descarta TB activa
Ventajas
Desventajas y limitaciones
• El paciente solo tiene que ir una vez para la extracción de la muestra de sangre. • Los resultados pueden obtenerse en 24 horas. • No aumenta la reacción en pruebas posteriores, lo que sí puede ocurrir con la prueba cutánea de la tuberculina. • No hay un posible sesgo en su interpretación, lo que sí puede ocurrir con la prueba cutánea de la tuberculina. • Una vacunación previa con BCG (bacilo de Calmette-Guérin) no afecta los resultados.
• Las muestras de sangre deben procesarse dentro de las 12 horas posteriores a la recolección, • Existen pocos datos sobre el uso de la prueba QFT-G en niños menores de 17 años de edad, personas que han tenido una exposición reciente a M. tuberculosis o personas Inmunodeprimidos. • Los errores en la recolección o el transporte de las muestras de sangre o en la forma en que se realiza y se interpreta el análisis pueden disminuir la precisión de la prueba. • Existe poca información en cuanto al uso de la prueba QFT-G para determinar quién tiene riesgo de contraer la enfermedad de tuberculosis
Gerardo Jesus Barrera,/México/2010 Diagnóstico, evaluación y tratamiento integral de la TB latente http://www.cdc.gov/tb/esp/topic/testing/bloodtest.html
Cuándo Incorporar Nuevas Técnicas Diagnósticas • Diagnóstico de TB extrapulmonar • Diagnóstico de coinfección TB/VIH/SIDA • Pobre Carga Bacilar
SE DEBEN PRIORIZAR LAS PRUEBAS DE ACUERDO A LOS FACTORES DE RIESGO DE LOS PACIENTES