NB: Versión adoptada en la Asamblea Mundial de Delegados de la OIE en mayo de 2012

SECCIÓN 2.3.

AVES

CAPÍTULO 2.3.1.

CLAMIDIOSIS AVIAR

RESUMEN La clamidiosis aviar (CA) está causada por la bacteria Chlamydophila psittaci. Originalmente, la CA que afecta al hombre y a todo tipo de aves se denominó psitacosis, pero con posterioridad se introdujo el término ornitosis para referirse a la enfermedad adquirida de aves salvajes o domésticas o que se presenta en ellas, mientras que el término psitacosis se reserva para la enfermedad adquirida de aves psitácidas o que se presenta en ellas. Estas enfermedades son similares cuando las contrae el hombre. El género Chlamydia se ha dividido en dos, Chlamydia y Chlamydophila. Se está planteando la propuesta de combinarlos en un solo género Chlamydia, pero en este capítulo no se ha adoptado. Las cepas aviares de Chlamydophila psittaci incluyen al menos quince genotipos, algunos de los cuales se correlacionan con las especies de aves en las que se aíslan normalmente. La clamidiosis que se presenta naturalmente en las especies de mamíferos y que no se contrae de las aves está causada por otras especies del microorganismo. Dependiendo de la virulencia de la cepa de clamidia y de la defensa del ave hospedadora, las clamidias causan pericarditis, conjuntivitis, sinusitis, inflamación de los sacos aéreos, neumonía, adenitis nasal lateral, peritonitis, hepatitis e inflamación del bazo. Las infecciones generalizadas cursan con fiebre, anorexia, letargo, diarrea y, ocasionalmente un shock mortal. Las cepas aviares de clamidias pueden causar enfermedades graves y, ocasionalmente, la muerte en el hombre, por lo que su manejo en el laboratorio (nivel 3 de bioseguridad) debe hacerse con especial cuidado. Aunque la enfermedad en las psitácidas se conoce mejor, la infección en los patos y los pavos es particularmente preocupante puesto que es frecuente su transmisión al hombre durante el manejo y el sacrificio de estas aves. El diagnóstico de la CA requiere el aislamiento y la identificación del microorganismo, la demostración de las clamidias en los tejidos, o la demostración de un aumento de cuatro veces en los anticuerpos humorales específicos, además de los signos clínicos típicos. Identificación del agente: El aislamiento de clamidias requiere la inoculación de huevos embrionados, o de cultivos celulares, y la comprobación de la presencia de clamidias por tinciones citoquímicas o por métodos inmunohistoquímicos. Es preferible la inoculación de las muestras directamente en cultivos celulares, puesto que estos son tan sensibles como los embriones de pollo para el aislamiento de la mayoría de las cepas aviares de clamidias. Los cultivos celulares se tiñen mediante inmunofluorescencia o con otras tinciones apropiadas a los tiempos adecuados para demostrar la presencia de inclusiones. Por lo general, se aplica la tinción histoquímica de improntas de hígado, corazón y bazo. Esta técnica proporciona un diagnóstico rápido, pero su aplicación requiere cierta experiencia Para el diagnóstico de la clamidiosis en las aves se han utilizado enzimoinmunoanálisis elaborados para detectar el antígeno del tracoma causado por Chlamydophila en el hombre. Muchas de las técnicas iniciales utilizaban antisueros mono- o policlonales contra los epítopos del lipopolisacárido, algunos de los cuales eran compartidos por otras bacterias gramnegativas. Cuando se analizan aves aisladamente, su utilidad es dudosa, pues carecen de sensibilidad y especificidad.

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En los laboratorios de diagnóstico hoy en día se utilizan mucho las pruebas moleculares (como la reacción en cadena de la polimerasa, convencional o en tiempo real, el análisis del polimorfismo de fragmentos de restricción, y los chips o secuenciación de ADN) y la tinción inmunohistoquímica de cortes histológicos. Todas ellas son pruebas rápidas que no requieren que el agente esté vivo. Las pruebas actuales de la PCR tienen por objetivo al gen ompA o los genes del ARN ribosómico (16S–23S). Se dispone de protocolos validados y estandarizados de ambas pruebas específicos de especies y específicos de familia. La PCR anidada y la PCR en tiempo real pueden ser tan sensibles como el aislamiento. Debido a la reciente elaboración y disponibilidad de equipos automáticos de tinción, se ha registrado un aumento en la utilización de tinciones inmunohistoquímicas de cortes histológicos Pruebas serológicas: La prueba serológica estándar para detectar anticuerpos contra clamidias es la prueba de fijación del complemento (CF). El antígeno es un determinante de grupo presente en el lipopolisacárido de todas las cepas. La existencia de títulos altos por CF en la mayoría de los individuos de una población con signos clínicos es una prueba preliminar de una infección activa. La demostración de un aumento de cuatro veces en el título en un ave determinada se considera un diagnóstico de infección reciente. También pueden emplearse otras pruebas serológicas, como el ELISA, la aglutinación con látex, la aglutinación de cuerpos elementales, la micro-inmunofluorescencia, y la inmunodifusión en gel de agar. Estas pruebas tienen valor en los casos específicos y pueden sustituir a la técnica de CF; sin embargo todavía no se dispone de comparaciones sobre su fiabilidad y reproducibilidad. Requisitos para las vacunas: No existen vacunas para el control de la clamidiosis en las aves. El único método actual de control son los antibióticos. Chlamydophila psittaci es sensible a varios antibióticos. El agente antimicrobiano elegido varía de un país a otro.

A. INTRODUCCIÓN La clamidiosis aviar (CA) está causada por la bacteria Chlamydophila psittaci. En las aves la enfermedad se denominó inicialmente psitacosis, pero con posterioridad se introdujo el término ornitosis para diferenciar la enfermedad en las aves domésticas y en las salvajes de la enfermedad en las aves psitácidas. Actualmente se considera que ambos síndromes son uno solo (Andersen & Vanrompay, 2003). Su distinción inicial estaba basada en la suposición de que la ornitosis en el hombre era una enfermedad más leve que la psitacosis. Sin embargo, debe advertirse que la enfermedad contraída por el hombre a partir de los pavos y los patos es a menudo tan grave como la contraída a partir de las aves psitácidas. La infección de las aves por Chlamydophila psittaci es frecuente en todo el mundo y se ha hallado en unas 465 especies de aves (Kaleta & Taday, 2003). Los brotes de CA en las psitácidas y en explotaciones avícolas causan considerables pérdidas económicas (Comisión Europea, 2002). La infección puede comportar una enfermedad sistémica y en ocasiones mortal en las aves. Los signos clínicos en general son inespecíficos y muy variables por lo que respecta a la gravedad, y dependen de la especie y de la edad del ave, así como de la cepa de clamidia. La CA puede producir letargo, hipertermia, secreciones anormales, rinorrea y lagrimeo, y una disminución de la puesta de huevos. La mortalidad es muy variable. En las aves domésticas, los signos clínicos más frecuentes son conjuntivitis, anorexia y pérdida de peso, diarrea, deposiciones amarillentas, sinusitis, biliverdinuria, rinorrea, estornudo, lagrimeo y dificultad respiratoria (Mohan, 1984). En muchas aves, especialmente en las psitácidas viejas, se puede presentar sin signos clínicos; sin embargo, liberan el agente durante períodos largos de tiempo. En la necropsia de aves afectadas se observa con frecuencia esplenomegalia y hepatomegalia, inflamación fibrinosa de los sacos aéreos, pericarditis y peritonitis (Andersen & Vanrompay, 2003; Vanrompay et al., 1995). Las lesiones histológicas apuntan a la presencia de la infección, pero no son patognomónicas a menos que vayan acompañadas de la identificación de clamidias. La taxonomía de la familia Chlamydiaceae actualmente se está estudiando (Kuo et al., 2011), pero a efectos de este capítulo se ha mantenido la subdivisión en dos géneros, Chlamydia y Chlamydophila (Everett et al., 1999a). El género Chlamydia incluye C. trachomatis (humanos), C. suis (cerdos) y C. muridarum (ratón y hámster), C. psittaci (aves y otras especies), C. feli (gatos), C. abortus (ovejas, cabras y ganado bovino), C. caviae (cobayas), C. pecorum (ovejas y ganado bovino) y C. pneumonia (hombre y otras especies). Aunque la mayoría de estos microorganismos son muy específicos de hospedador, C. pneumonia y C. psittaci tienen una amplia variedad de hospedadores. Se ha observado que el segundo afecta no solo a las aves y al ser humano, sino también al ganado vacuno, a las ovejas, a los cerdos, a los caballos y a otros animales (Sachse et al., 2009a).

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Las cepas aviares relacionadas con la CA pertenecen a la especie Chlamydophila psittaci. Hasta hace poco, se han diferenciado claramente nueve genotipos distintos en base al gen ompA que codifica la principal proteína de la membrana externa (MOMP). Siete de estas “serovariedades clásicas” se considera que tienen lugar principalmente en un orden o clase específicos de aves y dos en hospedadores no aviares, es decir, el genotipo A en aves psitácidas, el b, en palomas, el C en patos y gansos, el D en pavos, el E en palomas, patos y otras aves, los E/B en patos, pavos y palomas, el F en periquitos, el WC en ganado vacuno, y M56 en roedores. La mayoría de genotipos aviares también se han identificado esporádicamente en cepas de casos de transmisión zoonótica al ser humano, sobre todo A, B y E/B (Gaede et al., 2008; Heddema et al., 2006; Vanrompay et al., 2007). Mientras tanto, se han introducido subgrupos para tres de los genotipos más heterogéneos, es decir, AVS1, A-6BC, A-8455, EB-E30, EB-859, EB-KKCP, D-NJ1 y D-9N, y se han sugerido seis nuevos genotipos provisionales para cubrir las cepas que previamente no eran tipificables, es decir, 1V, 6N, Mat116, R54, YP84, y CPX0308, de tal forma que el número total de genotipos asciende a 15 (Sachse et al., 2008). Indicios recientes sugieren que C. psittaci no es la única clamidia que afecta a las aves (Gaede et al., 2008; Laroucau et al., 2009). La clasificación taxonómica de estos nuevos agentes dentro o fuera de la familia Chlamydiaceae todavía no se ha definido y su importancia todavía no está clara. Parecen estar bastante diseminados en patos, pollos y palomas, y algunas cepas parecen actuar como agentes patógenos facultativos. Es importante emplear métodos de diagnóstico capaces de diferenciar entre estos microorganismos y C. psittaci. Actualmente, los antibióticos son el único medio de control. Chlamydophila psittaci es sensible a varios antibióticos: el fármaco de elección varía en función del país. La clortetraciclina, la doxiciclina y otras tetraciclinas son los más utilizados. El tratamiento tiene que mantenerse durante largos periodos de tiempo. En el caso de las aves mascota, se suelen recomendar 45 días (Smith et al., 2005; Vanrompay et al., 1995).

Riesgo zoonótico y requisitos de bioseguridad Las cepas aviares de clamidias pueden infectar al hombre y se deben manejar con cuidado en condiciones de nivel 3 de bioseguridad (Smith et al., 2005), como se indica en el Capítulo 1.1.2. Bioprotección y seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología y en las instalaciones de los animales. La mayoría de las infecciones tienen lugar por inhalación de aerosoles infecciosos. Aunque la enfermedad se conoce mejor en las aves psitácidas, la infección en patos y pavos preocupa especialmente, porque la transmisión al ser humano es frecuente durante la manipulación y sacrificio de estas aves (Dickx et al., 2010). El examen postmortem de las aves infectadas y la manipulación de los cultivos debe realizarse en cabinas de flujo laminar o con equipo protector adecuado. Deben aplicarse procedimientos adecuados de descontaminación de agentes zoonóticos, porque una mera exposición transitoria puede provocar la infección en el hombre. El período de incubación suele ser de 5–14 días, aunque se conocen períodos de incubación más largos. En el hombre, las infecciones varían desde una forma latente a una enfermedad sistémica grave con neumonía intersticial y encefalitis. En pacientes con un tratamiento adecuado, la enfermedad raramente es mortal; por tanto, son importantes el conocimiento del riesgo y un diagnóstico precoz. Típicamente, la infección en el hombre cursa con dolor de cabeza, escalofríos, malestar y mialgia, con o sin signos de implicación pulmonar. La manifestación pulmonar es corriente; no obstante, los resultados por auscultación pueden parecer normales o infravalorar el grado de la infección. El diagnóstico puede resultar difícil y, por lo general, se realiza mediante la prueba de fijación del complemento (CF) en sueros pareados para detectar la presencia de anticuerpos anticlamidia. Salvo contraindicaciones, la tetraciclina, la doxiciclina y la azitromicina son los compuestos más indicados en el caso de infección humana. La duración del tratamiento dependerá del antibiótico, pero, si es con tetraciclina, debe continuar por lo menos durante 14 días.

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1.

Identificación del agente

El método de elección para la identificación de la CA es el aislamiento e identificación del microorganismo. A menudo se utilizan otras técnicas debido al tiempo requerido, la necesidad de muestras de alta calidad y el peligro que supone para el personal de laboratorio. Estas incluyen la tinción histoquímica de frotis de exudados y heces, las improntas de tejidos, el marcaje inmunohistoquímico de preparaciones citológicas e histológicas, el enzimoinmunoanálisis por captura de antígeno (ELISA), la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional o en tiempo real, la RFLP (análisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción), la detección basada en chips de ADN y la secuenciación del ADN.

a)

Recogida y tratamiento de las muestras para el aislamiento Las muestras que se han de recoger dependen de los signos de la enfermedad. Deben tomarse de forma aséptica. Las bacterias contaminantes pueden interferir con el aislamiento de las clamidias. En los casos agudos, las muestras deben incluir exudados inflamatorios o fibrinosos del interior y la periferia de los

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órganos que presenten lesiones, secreciones oculares y nasales, frotis por impronta de hígado, sangre completa, y muestras de tejido de riñón, pulmón, pericardio, bazo e hígado. En los casos con diarrea, debe cultivarse el contenido del colon o las heces. En las aves vivas, las mejores muestras son los hisopos faríngeos y nasales (Andersen, 1996). También deben tomarse muestras de heces, hisopos de la cloaca, raspado conjuntival y exudado peritoneal. Es importante un manejo adecuado de las muestras clínicas para evitar la pérdida de infectividad de las clamidias durante el envío y el almacenamiento. Se ha desarrollado un medio especial para rickettsias que resulta satisfactorio para el transporte de las muestras de campo de clamidias y que está compuesto por sacarosa/fosfato/glutamato (SPG). El medio, tal como se recomienda para las clamidias (Spencer & Johnson, 1983), consiste en tampón SPG: sacarosa (74,6 g/litro); KH2PO4 (0,512 g/litro); K2HPO4 (1,237 g/litro); y ácido L-glutámico (0,721 g/litro), que se puede esterilizar en autoclave o por filtración. A esto se añade suero fetal bovino (10%), vancomicina, kanamicina y estreptomicina (200–500 µg/ml), anfotericina B y gentamicina (50 µg/ml). La adición de antibióticos reduce el efecto de la contaminación, incluso aunque las muestras se envíen a temperatura ambiente. En ausencia de un almacenaje en refrigeración, el microorganismo sigue viable durante incluso 30 días y a 4ºC durante incluso 34 días (Spencer & Johnson, 1983). Este medio también puede usarse como diluyente en el laboratorio y para congelar las clamidias. Las muestras contaminadas deben pre-tratarse antes de usarlas para inocular animales o cultivos celulares. Hay tres métodos básicos: el tratamiento con antibióticos (Bevan et al., 1978), el tratamiento con antibióticos junto a centrifugación a baja velocidad (Andersen & Vanrompay, 2003; 2005) y el tratamiento con antibióticos y filtración (Andersen & Vanrompay, 2005; Bevan et al., 1978). Se pueden utilizar varios antibióticos que no inhiben a las clamidias. Las muestras se homogeneizan en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2, que contenga como máximo lo siguiente: estreptomicina (1 mg/ml), vancomicina (1 mg/ml) y kanamicina (1 mg/ml). También se puede utilizar gentamicina (200 µg/ml). Se puede añadir anfotericina B (50 µg/ml) para controlar el crecimiento de hongos y levaduras. Se debe evitar el uso de penicilina, tetraciclina y cloranfenicol porque inhiben el crecimiento de las clamidias. Cuando la contaminación es escasa, se deben homogeneizar las muestras en una solución de antibiótico antes de su inoculación en embriones de pollo o en cultivos de tejidos. Las muestras se suelen dejar reposar en la solución de antibióticos durante 24 horas a 5°C antes de la inoculación. Las muestras muy contaminadas, como las fecales, deben homogeneizarse con los antibióticos y centrifugarse después a 500 g durante 20 minutos. La capa superficial y el sedimento se eliminan. Se recoge el sobrenadante y se vuelve a centrifugar. El sobrenadante final se utiliza para la inoculación. Si la contaminación persiste, las muestras se deben pasar por un filtro con un tamaño de poro medio de 450–800 µm.

b)

Aislamiento en cultivo celular El cultivo celular es el método más cómodo para el aislamiento de C. psittaci. Las líneas celulares más frecuentes son las células de riñón de mono verde de Buffalo (BGM), McCoy, HeLa, de riñón de mono verde africano (Vero) y L (Vanrompay et al., 1992). Las células se cultivan para conseguir el crecimiento en monocapa utilizando medios estándar de cultivo que contengan 5–10% de suero fetal bovino y antibióticos que no inhiban las clamidias (como se ha descrito anteriormente). Cuando se selecciona un sistema de cultivo celular es importante recordar que: i)

Las clamidias se pueden identificar mediante la inmunofluorescencia directa o indirecta o por otras técnicas de tinción adecuadas.

ii)

El inóculo se suele centrifugar sobre la monocapa para aumentar su infectividad.

iii)

La muestra puede requerir un pase a los 4–5 días para aumentar la sensibilidad del aislamiento.

iv)

Se debe examinar la muestra dos o tres veces en cada pase; y

v)

Las clamidias pueden ser infecciosas para el hombre.

Estos condicionamientos pueden cumplirse con los viales pequeños de fondo plano y con cierre (3,7 ml, 15 × 45 mm) o los frascos que contienen cubreobjetos de 12 mm de diámetro (Bevan et al., 1978). Se inoculan varios viales con cada muestra, normalmente cuatro o seis, para permitir la fijación y tinción a distintos tiempos y para hacer pases nuevos a los 6 días de la inoculación en el caso de las muestras que sean aparentemente negativas. Cuando se analizan muchas muestras, se pueden utilizar placas con 96 pocillos, que tienen la ventaja de ahorrar trabajo. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la contaminación cruzada entre muestras puede ser un problema. Las clamidias se pueden aislar en células que se están dividiendo normalmente, pero es preferible utilizar células que no se dividen, porque estas pueden suministrar más nutrientes para el crecimiento de las clamidias. Además, las células quiescentes se pueden observar durante períodos de tiempo más

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prolongados. La división de la célula hospedadora se puede inhibir por radiación o, más habitualmente, por agentes citotóxicos. Estos últimos pueden ser la 5-yodo-2-deoxiuridina, la citocalasina B, la cicloheximida y el hidrocloruro de emetina. La cicloheximida es la más frecuentemente utilizada y se puede añadir al medio a razón de 0,5–2,0 µg/ml al mismo tiempo que la inoculación de la monocapa (Andersen & Vanrompay, 2003; 2005; Bevan et al., 1978). La emetina se elimina tras el tratamiento y se sustituye por medio de cultivo. Primero se trata la monocapa con emetina (0,5 µg/ml) durante 5 minutos, después de lo cual se elimina y se sustituye por medio de cultivo; la monocapa queda entonces en condiciones de utilización. El crecimiento de la mayoría de las cepas de clamidias se estimula mediante el tratamiento de la monocapa con uno de estos compuestos. La unión de las clamidias a las células se incrementa cuando el inóculo se centrifuga sobre la monocapa a 500–1.500 g durante 30–90 minutos a 37°C. Después se elimina el volumen de inóculo y se reemplaza con medio de cultivo de tejidos que contenga un inhibidor de la división celular, incubándose a 37–39°C. Los cultivos se examinan para detectar clamidias a intervalos regulares utilizando un método de tinción apropiado. Normalmente se hace el día 2 o 3, así como el día 4 o 5. Los cultivos que parecen negativos al quinto día se recogen y se vuelven a inocular en medio nuevo. Cuando se hacen pases sucesivos de clamidias, se deben pasar tanto las células como el medio de cultivo, y se debe evitar la congelación y descongelación para romper las células, ya que esto destruiría las clamidias. Antes de teñir los cultivos, primero se elimina el medio, se lavan con PBS y se fijan con acetona durante 2– 10 minutos. El tiempo de fijación del cultivo depende del recipiente de cultivo utilizado. Como la acetona ataca a la mayoría de los plásticos, puede ser preferible utilizar una mezcla de 50% de acetona y 50% de alcohol metílico. Se pueden emplear varios métodos de tinción para demostrar las inclusiones de las clamidias. El método preferido es la inmunofluorescencia directa (Andersen & Vanrompay, 2005; Bevan et al., 1978; Moore & Petrak, 1985). Se aplica a las células infectadas un antisuero contra clamidias conjugado con fluoresceína y se incuba 30 minutos en una cámara húmeda a 37°C. A continuación se lavan los cubres tres veces con PBS, se secan al aire, se montan y se examinan. Las inclusiones de clamidias emiten fluorescencia de color verde. Existen preparaciones comerciales de conjugados muy específicos que emplean anticuerpos monoclonales (MAbs). También se pueden preparar sueros policlonales, pero es importante que sean antisueros específicos y de título alto. Los antisueros policlonales se pueden obtener en conejos, cobayas, ovejas o cabras. Las ovejas y las cabras son una fuente excelente dado el volumen y los títulos altos que se pueden obtener fácilmente después de la infección. Los conjugados se preparan utilizando técnicas estándar (Andersen & Vanrompay, 2003; 2005). Las inclusiones de clamidias también se pueden demostrar mediante técnicas de inmunofluorescencia indirecta y de inmunoperoxidasa (Andersen & Vanrompay, 2005; Page, 1974). Se puede hacer tinción directa mediante las técnicas de Giménez, de Giemsa, de Ziehl–Neesen, o de Machiavello. A diferencia de la inmunofluorescencia, estas técnicas tienen la ventaja de que permiten el uso de microscopios estándar de fondo claro.

c)

Aislamiento en huevos Para el aislamiento primario de clamidias todavía se utilizan los embriones de pollo. El procedimiento estándar consiste en inocular hasta 0,5 ml de inóculo en el saco vitelino de un embrión de 6–7 días libre de patógenos específicos (Andersen & Vanrompay, 2003; 2005). Los huevos se incuban a 39°C mejor que a 37°C, ya que la multiplicación de las clamidias es mucho mejor a temperaturas más altas. Generalmente la multiplicación del microorganismo causa la muerte del embrión a los 3–10 días. Si no ocurriera la muerte, se hacen dos pases adicionales antes de dar como negativa una muestra. Las infecciones por clamidias producen una congestión vascular típica de las membranas del saco vitelino. Los sacos se recogen y se homogeneizan para hacer una suspensión al 20% en tampón SPG, y se pueden congelar para mantener la cepa, o se inoculan en huevos o en cultivos celulares. El microorganismo puede identificarse preparando un antígeno de un saco vitelino infectado y examinándolo mediante la tinción directa de los frotis con colorantes apropiados o utilizando el antígeno en una prueba serológica. Los cultivos celulares en monocapa se pueden inocular con la suspensión del saco vitelino y observar la presencia de inclusiones de clamidias por inmunofluorescencia directa 48–72 horas más tarde. Las inclusiones típicas son cuerpos intracitoplásmicos, redondos, o con forma de sombrero. En el caso de algunas cepas virulentas, las inclusiones se rompen con facilidad y el antígeno de las clamidias se dispersa por el citoplasma.

d)

Diferenciación entre especies/cepas Chlamydophila psittaci puede identificarse empleando PCR-RFLP (Everett & Andersen, 1999) o PCR convencional (Messmer et al., 1997; Sachse & Hotzel, 2003; Van Loock et al., 2005) o en tiempo real (Everett et al., 1999b; Geens et al., 2005; Pantchev et al., 2009; revisado por Sachse et al., 2009b) específica de especie. Se ha observado que una prueba con microchip de ADN permite diferenciar entre las nueve especies de la familia Chlamydiaceae (Sachse et al., 2005).

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Dado que ningún proveedor comercial dispone de anticuerpos monoclonales específicos de serovariedad, casi nunca se lleva a cabo una serotipificación clásica (Andersen, 1991; 1997). En lugar de ello, el genotipificación es una alternativa práctica porque i) los genotipos clásicos A-F son equivalentes a los serotipos correspondientes, y ii) nueve de los genotipos definidos más recientemente no pueden caracterizarse mediante serotipificación debido a la ausencia de anticuerpos específicos. Los genotipos A-F pueden identificarse empleando PCR-RFLP (Vanrompay et al., 1997). Para el genotipificación de cepas de C. psittaci a partir cultivo celular y de muestras de tejidos puede emplearse un procedimiento con microchip de ADN, que se ha observado que diferencia entre todos los genotipos actualmente conocidos (Sachse et al., 2008; 2009a). Además, todos los genotipos pueden identificarse mediante la secuenciación completa del gen ompA. Como se ha mencionado anteriormente, C. psittaci no es la única clamidia que afecta a las aves. Las clamidias recién descritas (Gaede et al., 2008; Laroucau et al., 2009) deben tenerse en cuenta cuando una muestra aviar determinada da positivo en una prueba general de detección de clamidias, como una PCR o una inmunohistoquímica específicas de Chlamydiaceae, pero negativo en una prueba específica de especie para C. psittaci. En este caso, la secuenciación parcial o completa del gen ompA y del operón ARNr 16-23S pondrán de manifiesto la identidad de la cepa. La aparición de C. abortus en aves es muy infrecuente, pero también debe tenerse en cuenta como posible diagnóstico diferencial.

e)

Tinción histoquímica Las tinciones de Giemsa, de Giménez, de Ziehl–Neelsen y de Machiavello son las más utilizadas para detectar clamidias en frotis de hígado y bazo. En varios laboratorios se utiliza la siguiente técnica modificada de Giménez (Andersen & Vanrompay, 2005): 

Técnica modificada de Giménez o tinción de Pierce-van der Kamp



Reactivos: Solución 1: Se añaden H2O destilada (450,0 ml) y fenol (5,0 ml) a fucsina básica (2,5 g) y etanol al 95% (50 ml). Se incuba 48 horas a 37°C. Se filtra y se guarda en la oscuridad a temperatura ambiente. Solución 2: Na2HPO4 (11,65 g); NA2HPO4.H2O (2,47 g); H2O destilada, pH 7,5 (hasta un litro). Solución 3: Solución 1 (20,0 ml) y Solución 2 (25,0 ml). Se deja reposar 10 minutos, se filtra y se usa. Solución 4: Ácido cítrico al 0,5%. Solución 5: Verde rápido (Fast green) (0,2 g); H2O destilada (100 ml); y ácido acético glacial (0,2 ml). Solución 6: Solución 5 (20,0 ml) y H2O destilada (50,0 ml).



El procedimiento para los frotis es el siguiente:

i)

Se fijan en metanol durante 5 minutos.

ii)

Se tiñen con Solución 3 durante 10 minutos y se lavan con agua del grifo.

iii)

Se tiñen con la solución de contraste 6 durante 2 minutos.

iv)

Se lavan con agua del grifo y se secan al aire.



El procedimiento para los cortes en parafina es el siguiente:

i)

Se elimina la parafina y se hidratan con H2O destilada.

ii)

Se tiñen con Solución 3 durante 10 minutos y se lavan con agua del grifo.

iii)

Se sumergen en la Solución 4 hasta que el corte no suelte más color rojo. Se lavan con agua del grifo.

iv)

Se tiñen con la solución de contraste 6 mediante 20 inmersiones.

v)

Se sumerge la preparación en dos cambios de alcohol al 95%, con cinco inmersiones en cada caso. Se deshidratan, se clarifican y se montan.

Las clamidias aparecen rojas sobre un fondo verde.

f)

Tinción inmunohistoquímica Se puede utilizar una tinción inmunohistoquímica para detectar clamidias en preparaciones citológicas o histológicas. Esta técnica es más sensible que la tinción histoquímica, pero requiere cierta experiencia, ya que la existencia de reacciones cruzadas con algunas bacterias y hongos requiere considerar la morfología.

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Los procedimientos de tinción inmunohistoquímica más usuales se pueden adaptar para obtener resultados satisfactorios. Es muy importante la elección del anticuerpo primario. Se han utilizado anticuerpos tanto policlonales como monoclonales. Debido a que el formol afecta a los antígenos de las clamidias, es recomendable que los anticuerpos policlonales se obtengan contra clamidias purificadas e inactivadas con formol. La cepa de clamidia utilizada no es importante, pues los anticuerpos reaccionan principalmente con los antígenos de grupo. También deben seleccionarse MAb que reaccionen con clamidias fijadas con formol. Se puede utilizar un panel de MAb específicos de grupo.

g)

Enzimoinmunoanálisis El ELISA ha sido ampliamente introducido en formato de kits comerciales para su utilización en el diagnóstico de la clamidiosis humana. Estos kits detectan el antígeno del lipopolisacárido (LPS) (antígeno de grupo) y detectan todas las especies de Chlamydiaceae. Se han probado varios de estos kits para detectar clamidias en aves (Vanrompay et al., 1994), pero ninguno ha sido autorizado para la detección de C. psittaci. Un problema con algunas de estas pruebas es que el LPS de las clamidias comparte algunos epítopos con otras bacterias gramnegativas, y estos epítopos pueden originar reacciones cruzadas, dando lugar a un gran número de falsos positivos. En algunos kits elaborados más recientemente, este problema se ha reducido o eliminado mediante una selección cuidadosa de los MAb utilizados. Tales preparaciones, sin embargo, carecen aún de sensibilidad porque se requieren centenares de microorganismos para dar una reacción positiva. La opinión de los técnicos es que se puede realizar un diagnóstico de la CA cuando se obtiene un resultado fuertemente positivo mediante una reacción ELISA en aves con signos de psitacosis. Un resultado positivo en un ave individual sin signos de enfermedad no se considera relevante debido al número falsos positivos e indica la necesidad de llevar a cabo más pruebas utilizando métodos diferentes.

h)

Sistemas de detección de ADN Las técnicas de PCR han estado reemplazando al aislamiento para la detección de clamidias en tejidos de animales. Se evitan los riesgos de infección en el personal de laboratorio por la inactivación de la muestra previa al análisis. La sensibilidad y especificidad suelen ser superiores a las del aislamiento. Las pruebas actuales de la PCR para la detección de C. psittaci tienen por objetivo los genes ompA o el del ARNr 16S– 23S (Everett et al., 1999b; Geens et al., 2005; Messmer et al., 1997; Pantchev et al., 2009; Sachse & Hotzel, 2003; Van Loock et al., 2005; y revisado en Sachse et al., 2009b). La sensibilidad y la especificidad dependen de la muestra y de la prueba de PCR. Debe considerarse el uso de reactivos diseñados para estabilizar el ADN cuando se anticipe un retraso en el procesamiento de la prueba (DeGraves et al., 2003). Las muestras de ADN pueden prepararse utilizando reactivos de bajo coste o utilizando los kits comerciales (Andersen & Vanrompay, 2005). La sensibilidad aumenta amplificando un fragmento de ADN relativamente corto, utilizando un procedimiento mixto o las nuevas técnicas de la PCR en tiempo real. El procedimiento de la PCR anidada puede alcanzar la misma sensibilidad y especificidad que el aislamiento (Messmer et al., 1997; Sachse & Hotzel, 2003; Van Loock et al., 2005). Sin embargo, el riesgo de contaminación aumenta si no se manipulan las reacciones con sumo cuidado (véase el capítulo 1.1.4/5 Principios de validación para las pruebas de diagnóstico de enfermedades infecciosas). Durante los últimos años, la PCR en tiempo real se ha convertido en el método de elección en los laboratorios de diagnóstico por su rapidez, alto rendimiento y facilidad de estandarización (Sachse et al., 2009b). Esta tecnología requiere una sonda marcada con fluorescencia y un equipo especial, lo cual aumenta los costes. Su sensibilidad puede ser equivalente a la del sistema anidado, pero se reducen los problemas de contaminación y de personal necesario, ya que se basa en una reacción en un sistema cerrado (Everett et al., 1999b; Geens et al., 2005; Pantchev et al., 2009). 

Procedimiento de la PCR en tiempo real (Pantchev et al., 2009)

Esta prueba se lleva a cabo en forma de amplificación doble que incluye un control de amplificación interna (IAC). Para esta prueba se determinó un límite de detección de 2 unidades formadoras de inclusión por cada mezcla de reacción.

1

i)

Los oligonucleótidos específicos de C. psittaci son los cebadores CppsOMP1-F (5’-CAC-TATGTG-GGA-AGG-TGC-TTC-A-3’) y CppsOMP1-R (5’-CTG-CGC-GGA-TGC-TAA-TGG-3’), así como ® la sonda MGB CppsOMP1-S (FAM-CGC-TAC-TTG-GTG-TGA-C-TAMRA). El sistema del IAC incluye los cebadores EGFP1-F (GAC-CAC-TAC-CAG-CAG-AAC-AC) y EGFP10-R (CTT-GTACAG-CTC-GTC-CAT-GC), así como la sonda TaqMan EGFP-HEX (HEX-AGC-ACC-CAG-TCC1 GCC-CTG-AGC-A-BHQ1). El plásmido IC2 sirve de molde para el IAC .

ii)

La amplificación se lleva a cabo en placas de microtitulación de 96 pocillos en un termociclador Mx3000P o equipo comparable. Cada reacción de 25 µl contiene 12,5 µl de mezcla madre universal

Disponible en Intype IC-DNA, Labordiagnostik Leipzig, Alemania.

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2

para PCR TaqMan 2× suplementada con ROX o un producto comparable. La concentración final de cada cebador de C. psittaci es 0,9 µM, de cada cebador IAC 0,3 µM, y de cada sonda 0,2 µM. iii)

Se añade ADN molde del IAC (0,5 µl que contengan 104 copias) a cada reacción antes de llegar al volumen final con agua.

iv)

Se emplean los siguientes parámetros de ciclado: ciclo de calentamiento inicial a 95ºC durante 10 minutos (un solo paso de desnaturalización), 45 ciclos de 95ºC durante 15 segundos y 60ºC durante 1 minuto (hibridación y extensión).

v)

Debe emplearse el valor del ciclo umbral (Ct) calculado automáticamente mediante el programa. Valores de Ct superiores a 36 deben tratarse con cautela porque pueden indicar una reacción cruzada con microorganismos relacionados. En estos casos, las muestras respectivas deben volver a examinarse mediante otra prueba.



Microchip de ADN

Recientemente se ha observado que la tecnología de chips de ADN es una potente herramienta para el diagnóstico de infecciones por clamidias (Sachse et al., 2005). La prueba para la detección e identificación de Chlamydiaceae spp. incluye la identificación de C. psittaci. Se ha validado y se ha comprobado que es adecuada para el diagnóstico sistemático (Borel et al., 2008). Su sensibilidad es comparable a la de la PCR en tiempo real y la especificidad es incluso mayor porque el ADN problema se hibrida con 36 sondas específicas de oligonucleótidos. Este enfoque metodológico permite la detección de infecciones mixtas por clamidias y la identificación de especies de clamidias inesperadas directamente a partir de muestras clínicas.

2.

Pruebas serológicas

a)

Prueba de la fijación directa de complemento modificada para Chlamydophila El método que se describe es una técnica directa de CF modificada para detectar anticuerpos, muy utilizada. Los reactivos son relativamente fáciles de preparar y estandarizar. Existen otras pruebas de CF, cada una con sus ventajas. La prueba modificada de CF directa se realiza en placas con 96 pocillos de fondo redondo. Las incubaciones se hacen normalmente dejando la placa flotar sobre un baño de agua a 37°C. El antígeno de clamidia se puede preparar a partir de saco vitelino infectado o de cultivos celulares. La prueba modificada de CF directa difiere de la prueba de CF directa en que a la dilución de complemento se añade suero normal no calentado de pollo sin anticuerpo contra las clamidias. El suero normal incrementa la sensibilidad de la CF, de modo que puede usarse para analizar sueros de especies aviares cuyos anticuerpos normalmente no fijan complemento de cobaya. 

Procedimiento analítico

i)

Dilución de los sueros La figura 1 indica un esquema para realizar la prueba en placas con 96 pocillos de fondo redondo. Antes de usarse, todos los sueros deben inactivarse por calor a 60°C durante 30 minutos. Los sueros se diluyen en solución salina tamponada con Veronal (barbiturato) (VBS) como se indica en la figura 1. Las diluciones se hacen en la placa de pocillos múltiples añadiendo 100 µl de VBS a cada pocillo de las filas A y E y luego 25 µl de suero problema sin diluir, de suero positivo (control positivo) o de suero negativo (control negativo) a cada uno de tres pocillos (véase la figura 1). Esto origina una dilución inicial a 1/5. A continuación, se añaden 25 µl de VBS a cada pocillo de las filas B a D y de las filas F a H. Utilizando una micropipeta de 25 µl se hacen diluciones a la mitad de la fila A a la D, y de la fila E a la H. De las filas iniciales y finales se eliminan los volúmenes apropiados para que queden 25 µl por pocillo. Las pipetas de dilución se lavan dos veces con H2O destilada y una con VBS entre suero y suero.

2

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Disponible en Applied Biosystems.

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Serum #1 Antigens: +Ag VBS -Ag

1 1/5 / 1/10 1/20

2

3

Serum #2

Serum #3

Serum #4

+Ag VBS -Ag

+Ag VBS -Ag

+Ag VBS -Ag

4

5

6

7

8

9

10 11 12

A B C

D 1/40 1/5 E 1/10 F 1/20 G 1/40 H Serum #5

Serum #6

+ Control

– Control

Fig. 1. Modelo propuesto para la prueba modificada de fijación directa del complemento en placas de 96 pocillos. ii)

Adición de antígeno A cada pocillo de las columnas 1, 4, 7, y 10, se añaden 25 µl de antígeno de clamidia positivo. En las columnas 2, 5, 8, y 11, se añaden 25 µl de VBS (pocillos control anticomplemento), y en las columnas 3, 6, 9, y 12, se añaden 25 µl de antígeno negativo (saco vitelino o cultivo celular normales preparados de la misma manera que el antígeno de clamidia). Los antígenos de clamidia se guardan sin diluir a 4°C y se diluyen a la concentración apropiada con VBS antes de su utilización.

iii)

Adición de complemento El complemento (C’) se guarda a –70°C y debe descongelarse y diluirse antes de la adición de antígeno. Antes de diluir el C’, se añade suero fresco de pollo para que quede a una concentración del 5% en el complemento. Las diluciones de complemento se hacen como en pruebas previas o según la titulación del mismo. Debe dejarse que el C’ repose 15 minutos en un baño de hielo para estabilizarse. El C’ diluido debe guardarse a 4°C después de la estabilización y debe usarse en un máximo de 2 horas. A cada pocillo se añaden 50 µl de C’ diluido inmediatamente después de la adición de los antígenos. Las placas se incuban sin tapar en un baño a 37°C durante 2 horas.

iv)

Adición de eritrocitos de oveja Se mezcla una suspensión estandarizada de eritrocitos de oveja con el mismo volumen de VBS. A esto se añade otro volumen igual de hemolisina diluida en VBS. La dilución final se incuba en un baño a 37°C durante 15 minutos para sensibilizar los eritrocitos. A cada pocillo se añaden 50 µl de eritrocitos sensibilizados. Las placas se incuban luego 1 hora en un baño a 37°C. Las placas se pueden centrifugar a 400 g durante 5 minutos antes de la lectura o pueden dejarse refrigeradas toda la noche a 4°C antes de la lectura.

v) Interpretación de los resultados Los pocillos se suelen valorar 1+, 2+, 3+, o 4+ dependiendo de si la reducción de hemólisis es respectivamente del 25, 50, 75 o 100%. Una reacción positiva es 2+ o superior, lo que equivale a un 50% o menos de lisis de los eritrocitos. Esto indica que el C’ fue fijado por el anticuerpo antes de añadir los eritrocitos. Los pocillos negativos son los que presentan una lisis completa de las células: el C’ permanece sin unirse y reacciona con los eritrocitos y la hemolisina para producir la lisis de los eritrocitos. La prueba no es válida cuando el suero es anticomplementario y se da una reacción positiva en la dilución con VBS como antígeno. Los sueros con reacciones inespecíficas dan reacciones positivas tanto en el pocillo positivo como en el negativo. 

Reactivos

i)

Preparación del antígeno El método más sencillo comienza con el crecimiento de las clamidias en un cultivo celular. Los dos métodos que se describen a continuación producen antígenos que pueden utilizarse en pruebas de micro-CF. Los procedimientos son muy similares: ambos incluyen el crecimiento de las clamidias en cultivo celular, la inactivación de las mismas, la purificación parcial del antígeno, la rotura mecánica y la dilución en un tampón apropiado. El método elegido dependerá del equipo disponible. El primer procedimiento (Grimes, 1985; Grimes et al., 1970) comienza con la recogida de las clamidias y de los restos del tapiz celular cuando se aprecia un efecto citopático. El cultivo se inactiva añadiendo

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fenol a una concentración final de 1%, incubando 24 horas a 37°C y concentrando por centrifugación a 10.000 g durante 1 hora. El sedimento se diluye al 10% de su volumen original utilizando VBS, pH 7,2, que contenga fenol al 1% y glicerol al 1%. El sedimento se homogeneiza a continuación en un omnimixer al máximo de velocidad, durante tres períodos de 1 minuto en baño de hielo. Para eliminar los restos, el homogenizado se centrifuga 15 minutos a 100 g. Algunos procedimientos sugieren calentar el antígeno en ese momento con agua hirviendo durante 30 minutos. El sobrenadante se conserva y se diluye a la concentración deseada. En el segundo procedimiento para la producción de antígeno para la prueba de CF (9, 10), el antígeno se prepara a partir de células L infectadas con una cepa de C. psittaci. Se elimina el medio de cultivo y las células se calientan 40 minutos a 56°C. Las células se lisan en agua destilada, las clamidias se liberan por ultrasonicación y la preparación se hace isotónica con VBS. El antígeno se analiza frente a un suero de oveja convaleciente y se usa como 2 unidades en la prueba de micro-CF. Existen varios procedimientos para la preparación del antígeno a partir de sacos vitelinos infectados, algunos de ellos muy elaborados. Sin embargo, con el siguiente procedimiento resulta relativamente fácil preparar un antígeno crudo a partir de saco vitelino infectado que funciona bien en la prueba directa de CF modificada. Se utiliza una cepa de clamidia adaptada al huevo para inocular huevos embrionados de 6–7 días de gallina a través del saco vitelino. Se recogen los sacos vitelinos de embriones que mueran entre los 3 y 7 días post-inoculación y la mezcla se diluye a 1/3 en PBS, tampón Tris, o medio de cultivo, y luego se esteriliza en autoclave durante 20 minutos. La suspensión se enfría y se homogeniza cuidadosamente. Se recomienda utilizar un homogeneizador de tejidos de alta velocidad durante 3–5 minutos. Después de la homogeneización, se añade fenol a una concentración final del 0,5% (se prepara una reserva de fenol al 5% y se añade 1 ml por cada 9 ml de antígeno). La preparación de antígeno se mantiene en reposo durante 3 días y, a continuación, se usa el sobrenadante después de centrifugar 20 minutos a 1.000 g. El antígeno se puede conservar durante largos períodos de tiempo a 4°C. ii)

Preparación de eritrocitos sensibilizados Se conservan los eritrocitos desfibrinados mezclándolos con un volumen equivalente de solución de Alsever. Se pueden mantener a 4°C durante 4 semanas. Se lavan 25 ml de la preparación de reserva de eritrocitos con 25 ml de VBS. Se centrifuga a 400 g durante 10 minutos. Se elimina el VBS por aspiración y se resuspende en 50 ml de VBS. Se repite el lavado tres veces. Tras el lavado final, se diluyen los eritrocitos a razón de 2,2 ml de eritrocitos sedimentados por cada 98 ml de VBS. A continuación los eritrocitos pueden estandarizarse por densidad óptica: se mezcla 1 ml de los eritrocitos diluidos y lavados con 14 ml de H2O destilada, se determina la absorbancia en un espectrofotómetro, y se estandariza a 0,25 a una longitud de onda de 550 nm. La lectura obtenida se puede utilizar en la siguiente fórmula para determinar la dilución requerida:

Volumen final de eritrocitos =

(absorbancia leída

× volumen actual)

0,25 absorbancia deseada Los eritrocitos se sensibilizan añadiendo rápidamente un volumen igual de de VBS que contenga la dilución adecuada de hemolisina (dilución determinada por titulación). Se incuban a 37°C durante 15 minutos antes de utilizarse iii)

Solución salina en tampón Veronal

La VBS se prepara como una solución concentrada 5x que se diluye a 1/5 antes de se uso. La siguiente fórmula es para 4 litros: se diluye en agua destilada barbital sódico (7,5 g); barbital H2O (se disuelve en H2O hirviendo) (11,5 g); MgSO4, 7H2O (4,056 g); NaCl (170,0 g); y CaCl2 (0,078 g). Se añade H2O destilada hasta completar 4 litros. iv)

Titulación del complemento

El complemento (C’) es inestable y se deteriora si no se maneja adecuadamente. Normalmente se mantiene congelado a –70°C en alícuotas que se utilizan cada vez para evitar volver a congelarlo. Para obtener la concentración de trabajo deseada (2 unidades por pocillo problema), primero se añade un 5% de suero de pollo normal para efectuar la modificación que aumenta la sensibilidad como se describió anteriormente. Luego se estima un punto de inicio basándose en los lotes previos. Un buen punto de inicio es una dilución a 1/30 después de añadir el suero de pollo. Se dispone una serie de tubos con cantidades variables de complemento en VBS. El VBS debe contener el antígeno que se va a utilizar en la reacción y hay que considerar cualquier actividad anticomplementaria del antígeno. Un método usual es hacer diluciones mezclando 0,10 ml de C’+ 0,90 ml de VBS; 0,12 ml de C’+ 0,88 ml de VBS, etc. Hasta 0,25 ml de C’+ 0,75 ml de VBS. Se incuban los tubos 2 horas en un baño a 37°C. Se añade 0,5 ml de eritrocitos sensibilizados a cada tubo. Se incuban otra hora en un baño a 37°C. La

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mayor dilución que proporciona una hemólisis completa es equivalente a 1 unidad. Dos veces dicha cantidad son 2 unidades. Se puede utilizar la siguiente fórmula para obtener 2 unidades/0,05 ml: × = (di) (v)/2dh donde: × = inverso de la dilución de C’ deseada para obtener 2 unidades de C’/pocillo di = inverso de la dilución inicial de C’ utilizada en la titulación (1/30) v = volumen de C’ diluido que se debe añadir dh = doble del volumen de C’ que origina hemólisis completa en la titulación

v)

Titulación de la hemolisina

La hemolisina puede obtenerse comercialmente. Debe estandarizarse mediante titulación. Se recomienda el siguiente procedimiento: Se prepara una dilución a 1/100 de la reserva de hemolisina en VBS. A partir de esta, se preparan en tubos diluciones 1/300, 1/400 y 1/500. De cada una de estas diluciones, se hacen diluciones dobles en VBS en volúmenes de 0,5 ml para una titulación en bloque. Para determinar la concentración de hemolisina, se añade a 0,5 ml de cada dilución lo siguiente: 0,5 ml de C’ a una dilución 1/30, 0,5 ml de eritrocitos no sensibilizados con densidad óptica de 0,25, y 1,5 ml de VBS. Se incuba 1 hora a 37°C y después se centrifuga a 400 g durante 5 minutos. Una unidad de hemolisina es la dilución que permite una lisis completa de los eritrocitos. La solución de hemolisina se prepara en VBS a la dilución que contenga 2 unidades de hemolisina. Esta se añade luego a un volumen igual de eritrocitos a la concentración apropiada. vi)

Titulación del antígeno y del control de suero positivo

Para estandarizar la prueba de CF, también se necesita conocer los títulos del antígeno y del control de suero positivo. Si se conoce el título de uno de ellos, entonces el del otro componente se puede determinar mediante la prueba de CF utilizando diluciones del componente que se va a titular. Si se desconoce tanto el título del suero positivo como el del antígeno, se puede utilizar una titulación en bloque (en tablero de ajedrez o de doble entrada) para determinar las diluciones límites del antígeno y del anticuerpo donde comienza la hemólisis. Es muy importante obtener estos títulos con precisión. Se utilizan 4 unidades tanto de antígeno como de suero control positivo. Una unidad es la dilución más alta que da un resultado positivo. Es decir, si una dilución de 1/160 da una prueba positiva, entonces una dilución 1/40 tiene 4 unidades y se utiliza en la prueba. Los anticuerpos fijadores de complemento aparecen generalmente a los 7–10 días de la infección. Para que el diagnóstico sea positivo, se requiere un aumento de cuatro veces en el título de anticuerpos CF. Solo se puede hacer un diagnóstico presuntivo en una población mediante pruebas serológicas si se presentan los signos clínicos típicos y la mayoría de las aves tienen anticuerpos a títulos >1/64.

b)

Otras pruebas Se han desarrollado otras pruebas, pero su especificidad aún no ha sido evaluada suficientemente. El ELISA para la detección de anticuerpos específicos de grupo contra clamidia es más rápido y sensible que la CF; además puede ser automatizado. Las evaluaciones de los ELISA para la detección de anticuerpos contra C. trachomatis y C. psittaci indican que las pruebas son muy sensibles pero carecen de especificidad. Se están elaborando nuevas pruebas en las que se usan péptidos o antígenos recombinantes y que pueden solucionar los problemas relacionados con la especificidad (Sachse et al., 2009b). Otras pruebas son la prueba de inmunodifusión en medio sólido (Page, 1974), la prueba de aglutinación con látex (LA), la prueba de la aglutinación de los corpúsculos elementales (EBA) (Grimes & Arizmendi, 1996; Grimes et al., 1994) y la prueba de micro-inmunofluorescencia (MIFT). La inmunodifusión es menos sensible que la prueba de la CF. La prueba de la LA detecta anticuerpos contra C. psittaci y es rápida y fácil de realizar (Grimes et al., 1993). Las bolas de látex se recubren con antígeno purificado de la clamidia, se mezclan cuidadosamente con el suero problema en una placa de vidrio, y se rotan durante 2 minutos para favorecer la aglutinación. La prueba se lee contra un fondo oscuro. Los sueros que dan reacción positiva deben analizarse de nuevo con bolas no recubiertas para eliminar la posibilidad de aglutinación inespecífica. Las pruebas de la LA y de la CF directa se correlacionan en un 72,5% de las pruebas con sueros pareados. La prueba de la LA tiene una sensibilidad del 39,1% y una especificidad del 98,1% con respecto a la prueba de la CF directa (Grimes et al., 1993). La prueba detecta tanto la IgG como la IgM,

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pero es mejor para la IgM. Se ha sugerido su empleo para detectar infecciones recientes o activas. La prueba de la EBA detecta solamente la IgM y es indicativa de una infección actual. La prueba de la MIFT es rápida y fácil de realizar; sin embargo, no siempre están disponibles los sueros antiespecie conjugados con fluoresceína.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS No existen vacunas comercializadas contra la clamidiosis aviar. Los intentos de producir vacunas han tenido un éxito limitado, y la mayoría se han basado en bacterinas producidas mediante la inactivación de suspensiones concentradas de clamidias con formalina. Hay evidencia de que la inmunidad implica respuestas inmunes mediadas por células (Beeckman, & Vanrompay, 2010; Smith et al., 2005), pero la producción de vacunas no se ha dirigido hacia reacciones de este tipo.

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Capítulo 2.3.1. — Clamidiosis aviar

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NB: Existe un Laboratorio de Referencia de la OIE para la clamidiosis aviar (puede consultarse en la Tabla de la Parte 3 de este Manual Terrestre o en la página web de la OIE: www.oie.int). Se puede contactar con el Laboratorio de Referencia de la OIE para solicitar listas de fabricantes de kits, reactivos y/o vacunas.

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