BACTERIOCINAS PARA LA ESTABILIZACIÓN MICROBIOLÓGICA Y REDUCCIÓN DE LA DOSIS DE SO2 Ruiz-Larrea, F.; B. Rojo-Bezares; Y. Sáenz; L. Navarro; L. Díez ; M. Zarazaga; C. Torres. Departamento de Agricultura y Alimentación. Facultad de Ciencias. Universidad de La Rioja, Av. Madre de Dios 51. 26006 Logroño, España (e.mail: [email protected])

Las bacteriocinas Las bacteriocinas son péptidos con actividad antimicrobiana segregadas por las bacterias para inhibir el crecimiento de otros microorganismos competidores. En la actualidad las bacteriocinas producidas por las bacterias lácticas (BAL) son las que encierran un mayor interés ya que las BAL tienen el estatus de QPS (qualified presumption of safety), es decir son consideradas como microorganismos seguros para la salud, ya que tanto ellas como sus metabolitos han sido consumidos en alimentos fermentados por innumerables generaciones sin que hubiera efectos adversos en la población. Por otro lado las BAL acompañan al ser humano desde su mismo nacimiento, tanto en la composición de la microbiota del aparato digestivo como de la piel. Las bacteriocinas segregadas por las BAL han encontrado una importante aplicación como conservantes alimentarios naturales. La primera descripción de actividades relacionadas con las bacteriocinas se publicó hace más de ochenta años, cuando se descubrió un antagonismo entre cepas de Escherichia coli. Originalmente, estas sustancias fueron llamadas colicinas (Gratia, 1925). Sin embargo las primeras observaciones en BAL comenzaron en 1928, cuando se describió cómo ciertas cepas de Lactococcus empleadas en la fabricación de quesos producían un efecto inhibidor del crecimiento de otras BAL (Rogers and Whittier, 1928) y potencialmente podían inhibir el crecimiento de bacterias patógenas y nocivas para la conservación del queso. En 1933 se describió por primera vez esa sustancia de naturaleza peptídica con actividad antimicrobiana producida por cepas de la especie Lactococcus lactis subsp. lactis, que posteriormente se denominó nisina (Mattick and Hirsch, 1947). La nisina es por tanto la bacteriocina que tiene un historial más largo de uso seguro en alimentación y la que ha sido más estudiada. En 1953 se comercializó por primera vez en Inglaterra, en 1969 se aprobó su uso en alimentación por la OMS (Joint Food and Agriculture Organization/World Health Organization Expert Committee on Food Additives) y en 1983 se incluyó en la lista de aditivos de la U.E. con el número E234; poco después, en 1988, fue aprobada por la FDA (Food and Drug Administration) norteamericana (Cotter et al., 2005). La nisina se puede adquirir en grado alimentario bajo el nombre de NisaplinR (Danisco) y consiste básicamente en un preparado que contiene un 2,5 % de nisina, con NaCl (77,5 %) y leche descremada en polvo (12 % proteína y 6 % carbohidratos). El producto Nisaplin ND (non-dairy nisin) no contiene las proteínas lácteas, lo cual favorece su solubilidad en medio acuoso, contiene un 6,25 % de nisina, NaCl (90 %), carbohidratos (2 %) y proteína (aproximadamente un 3 %). Se utiliza en la reparación de productoos lácteos (especialmente quesos), embutidos, huevo líquido, zumos y alimentos enlatados. Su actividad cubre un espectro amplio de bacterias Gram positivas, entre las que cabe destacar Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes (Cintas et al., 2001) y Clostridium sp. (O'Sullivan et al., 2002).

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Junto con la nisina, la pediocina es otra bacteriocina que ha encontrado un amplio campo de aplicación en el sector alimentario como bioconservante. La pediocina PA-1 (AcH) es producida por cepas de las especies Pediococcus acidilactici de origen cárnico, Pediococcus parvulus de origen vegetal, y una cepa Lactobacillus plantarum aislada de queso (Cintas et al., 2001). La característica más notable de la pediocina es su alta actividad anti-listeria y es lo que la convierte en una bacteriocina de enorme interés tecnológico. Su espectro de actividad es mucho más específico que el de la nisina, de modo que no actúa sobre muchas otras BAL que se pueden emplear como cultivos iniciadores, y es más eficaz contra la listeria. En la actualidad la pediocina se comercializa y está incluida en varias patentes europeas y norteamericanas (Chen and Hoover, 2003). Un fermentado que contiene pediocina PA-1, denominado AltaTM (Kerry Bio-Science) está comercializado y se utiliza como conservante alimentario en productos cárnicos listos para su consumo, ensaladas y salsas. Estructuras de la nisina y de la pediocina En 1971 se caracterizó la nisina A como un miembro de la familia de los lantibióticos (clase I de bacteriocinas), es un péptido pequeño (34 aminoácidos), termorresistente, que contiene el aminoácido modificado lantionina. La síntesis de la nisina A es compleja, requiere procesos de transcripción, traducción, modificaciones post-traduccionales, secreción y procesamiento de señales celulares muy variadas (Engelke et al., 1992; Montville and Chen, 1998). Es un péptido policíclico compuesto por residuos aminoacídicos deshidratados (dehidroalanina y dehidrobutirina) y cinco anillos de lantionina y/o β-metil-lantionina formados por puentes disulfuro, en su cadena aminoacídica (Rollema et al., 1996; Cotter et al., 2005; Cheigh and Pyun, 2005). Tiene carácter catiónico y es una molécula anfipática ya que posee el extremo N-terminal hidrofóbico y el extremo C-terminal contiene la mayoría de los aminoácidos cargados e hidrofílicos. Además los cinco anillos de su estructura tienen una cara hidrofóbica y otra hidrofílica. Existen dos variantes de esta bacteriocina, la nisina A y nisina Z, que difieren únicamente en el aminoácido 27 (Figura 1). 15

5

25

10

30 COOH

H2 N

34 1

20 Asn

(Nisina Z)

Figura 1.- Estructura primaria de la nisina A. Ala-S-Ala representa al anillo de lantionina, Abu-S-Ala representa al anillo de β-metil-lantionina y los aminoácidos deshidratados: Dha (dehidroalanina) y Dhb (dehidrobutirina). La flecha indica la sustitución del aminoácido His27 por Asn27 que convierte la nisina A en la nisina Z (adaptado de Cotter et al., 2005; Cheigh and Pyun, 2005).

La pediocina PA-1 pertenece al grupo de bacteriocinas (clase IIa) que no tienen aminoácidos modificados, de pequeño tamaño (tiene 44 aminoácidos), termorresistentes, que poseen un fuerte carácter catiónico e hidrofóbico. Su estructura primaria contiene una secuencia Nterminal común con todas las bacteriocinas de este grupo: YGNGVxC, a la cual han atribuido algunos autores su actividad anti-listeria (Ennahar et al., 2000). Tiene una fuerte carga positiva (+ 6; pI = 8,6) y en vez de poseer anillos de lantionina, tiene dos puentes disulfuro en su estructura, uno de los cuales se postula que estabiliza las dos cadenas β que forman una estructura de horquilla en el extremo N-terminal (Ennahar et al., 2000). La predicción de la estructura secundaria del extremo C-terminal es de α-hélice (Figura 2). y se considera que

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éste sería el segmento transmembranal que se inserta en la membrana de la célula que va a inhibir.

Figura 2: Estructura tridimensional propuesta para la pediocina insertada en micelas lipídicas. Los segmentos azules representan vueltas, la flecha verde representa la α-hélice y las líneas marrones las cadenas β así como los dos puentes disulfuro (adaptado de PDB 1OHN en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure).

Modo de acción de las bacteriocinas Las bacterias Gram-positivas se caracterizan por poseer una alto contenido en lípidos aniónicos en su membrana. El modo de acción propuesto para las bacteriocinas es una unión inicial a la membrana bacteriana por atracción electrostática entre los lípidos cargados negativamente y las bacterocinas con su carga neta positiva localizada fundamentalmente en uno de sus extremos (extremo C-terminal de la nisina, extremo N-terminal de la pediocina). A continuación se produciría la inserción de las bacteriocinas en la bicapa lipídica, en el caso de la nisina esta inserción se realiza por su extremo N-terminal (Moll et al., 1999) y en el caso de la pediocina, a través de su α-hélice transmembranal del extremo C-terminal (Ennahar et al., 2000). De este modo se forman poros en la membrana bacteriana (Figura 3), la cual queda permeabilizada, la célula empieza a perder iones y metabolitos fundamentales para su supervivencia y eventualmente se produce la muerte bacteriana.

Figura 3: Mecanismo de acción de las bacteriocinas por formación de poros en la membrana bacteriana (tomado de Moll et al., 1999).

Las bacteriocinas y la industria alimentaria Las bacteriocinas para uso en la industria alimentaria deben cumplir una serie de requisitos: ser producidas por bacterias de grado alimentario (con estatus de QPS); - preferiblemente han de ser termorresistentes; - tener actividad inhibidora de bacterias patógenas o alterantes del alimento; - no deben llevar asociado ningún riesgo para la salud humana; - su adición debe

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conllevar un efecto beneficioso, como puede ser un aumento de la seguridad, la calidad o la conservación del aroma y propiedades organolépticas del alimento, y nunca se han de adicionar en concentraciones superiores a las encontradas en sus fuentes naturales; - y por último, han de poseer una actividad altamente específica y actuar únicamente contra bacterias patógenas o alterantes. Todas estas cualidades las han demostrado las dos bacteriocinas descritas anteriormente: la nisina y la pediocina, que hoy en día son bioconservantes ampliamente utilizados en la industria alimentaria, tanto individualmente como en combinación con otras tecnologías de conservación, tales como el tratamiento térmico, altas presiones o empaquetados en atmósferas modificadas (Allende et al., 2006). Las bacteriocinas se pueden emplear en la elaboración de alimentos de tres modos distintos: 1) como cultivos vivos iniciadores de la fermentación en alimentos fermentados, de modo que las bacteriocinas se producen in situ por el cultivo iniciador o por alguna de las cepas de BAL incluida en el cultivo mixto iniciador, 2) purificada o semipurificada (el caso de la Nisaplina) como aditivo alimentario y conservante, o 3) como un ingrediente más contenido en un extracto fermentado con calidad alimentaria, obtenido a partir de la cepa productora de la bacteriocina. Y en cualquiera de estos casos, el empleo de las bacteriocinas encierra una serie de beneficios en comparación con el uso de los conservantes químicos tradicionales: • Han demostrado un uso seguro en la cadena alimentaria humana y con menos limitaciones que los conservantes químicos, ya que son moléculas producidas de forma natural por microorganismos fermentativos endógenos de alimentos tradicionales. • No existen resistencias conocidas, ni impacto medioambiental puesto que son rápidamente degradadas en la cadena alimentaria humana. • Poseen un espectro de acción muy definido. • Las bacteriocinas en si, presentan un impacto sensorial nulo en el producto final. • Su actividad se ve potenciada con el pH y poseen efecto complementario al de otros agentes antimicrobianos. • Su aplicación es compatible con el etiquetado de producto ecológico sin conservantes químicos ni de síntesis. Sin embargo, también encierra inconvenientes: • Son menos conocidas que los conservantes químicos, puesto que la nisina fue la primera bacteriocina conocida, y se descubrió en 1933 como ya se ha mencionado anteriormente. • No son indestructibles y se degradan rápidamente por las enzimas proteolíticas. • Son necesarios conocimientos técnicos especializados para prepararlas y utilizarlas correctamente, todo lo cual encarece su empleo. • Son eficaces sólo frente a un tipo determinado de bacterias. • Existen limitaciones legales en su empleo como aditivos alimentarios que exigen validaciones específicas y su aprobación antes de ser empleadas de forma purificada o semipurificada. Objetivos de trabajo El trabajo que viene desarrollando el grupo investigador de Bioquímica y Biología Molecular del Departamento de Agricultura y Alimentación de la Universidad de la Rioja se centra en tres aspectos: • El estudio tanto in vitro como en bodega de la nisina y otras bacteriocinas empleadas en la

industria alimentaria, como agentes inhibidores del crecimiento bacteriano para la conservación del vino, así como de posibles efectos sinérgicos con el anhídrido sulfuroso. • El estudio en el laboratorio de cultivos de cepas de BAL que produzcan actividad bacteriocina y que puedan dar lugar a extractos fermentados activos frente a una serie de bacterias de origen enológico.

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• Caracterizar BAL enológicas que sean productoras de bacteriocinas y que posean potencial

como cultivos iniciadores, de modo que puedan crecer en el mosto y en el vino.

Resultados del estudio in vitro del efecto de la nisina Para el estudio del efecto in vitro de los agentes antimicrobianos: etanol, el metabisulfito y la nisina frente a microorganismos del vino, bien de forma aislada o combinados, se utilizó una colección de 64 cepas de BAL, 23 cepas de bacterias acéticas (BAA) y 20 levaduras, todas ellas de origen enológico. Los resultados se muestran en la siguiente tabla. Tabla 1.- Valores de CMIs y CMBs de los agentes antimicrobianos frente a las BAL, BAA y levaduras enológicas.

Agentes antimicrobianos

Microorganismosa Nº de CMI50 cepas

CMI90

CMB50

CMB90

Etanol

BAL*

41

14%

18%

ND

ND

O. oeni

23

8%

10%

ND

ND

BAA

23

6%

10%

ND

ND

Levaduras

20

12%

>20%

ND

ND

BAL*

41

200

400

800

>12800

O. oeni

23

50

100

100

200

BAA

23

25

50

50

50

Levaduras

20

100

200

100

400

BAL*

41

≤12.5

50

25

100

O. oeni

23

100

100

100

400

BAA

23

25

50

50

100

Levaduras

19

100

200

100

400

BAL*

41

12.5

100

25

400

O. oeni

23

0.024

0.024

0.024

0.048

BAA

23

200

400

400

400

Levaduras

20

≥400

≥400

≥400

>400

BAL*

41

6.25

200

25

>400

O. oeni

23

≤0.012

0.024

≤0.012

0.048

BAA

23

200

200

400

400

Levaduras

20

>400

>400

>400

>400

BAL*

41

12.5

400

400

>400

O. oeni

23

≤0.012

0.024

≤0.012

0.048

BAA

23

50

200

100

400

BAL*

41

25

25

50

200

O. oeni

14

25

100

100

200

BAA

23

25

50

50

50

Metabisulfito

Metabisulfito+ etanol

d

Nisina

Nisina + etanol

d

Nisina + metabisulfito

e

Metabisulfito + Nisina f

a

BAL*: bacteria láctica excepto O. oeni, BAA: bacteria acética.

5

b

Concentración de etanol expresada como % (vol/vol). ND: no determinado. d Concentraciones subinhibitorias de etanol utilizadas: 6% para BAL*, O. oeni y levaduras, y 3% para BAA. e Concentraciones subinhibitorias de metabisulfito utilizadas: 50 mg/L para todos los microorganismos analizados f Concentraciones subinhibitorias de nisina utilizadas: 0.39 mg/L para BAL*, 0.01 mg/L para O. oeni y 1.5 mg/L para BAA. c

Como puede observarse en la tabla, los valores de las CMI del metabisulfito en presencia de nisina bajan respecto a los valores de CMI del metabisulfito en ausencia de nisina, tanto para la especie Oenococcus oeni como para el resto de las BAL. Estos resultados indican un efecto sinérgico de la nisina y el metabisulfito en la inhibición del crecimiento de las BAL. Cuando se añadió al medio una cantidad de subinhibitoria de nisina (0,01 mg/L para O. oeni y 0,39 mg/L para el resto de BAL), el valor de CMI50 del metabisulfito disminuyó significativamente en el caso de O.oeni (50 a 25 mg/L) (p