Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Licenciatura en Ciencias Biológicas

Biología Celular

Guía de Trabajos Prácticos

Autoras: Dra Silvia González Dra Mirta Elena Grimaldi

UNIVERSIDAD DE BELGRANO LICENCIATURA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS DE BIOLOGÍA CELULAR

DRA SILVIA GONZÁLEZ DRA MIRTA ELENA GRIMALDI

AÑO: 2011

GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR

Programa de la asignatura: UNIDAD I: Introducción a la célula eucariota: Composición química de las células: agua, minerales y biomoléculas (ácidos nucleicos; proteínas, hidratos de carbono y ácidos grasos). Organización interna de la célula eucariota. Comparación con células procariotas.

UNIDAD II: Herramientas y metodologías para el estudio de la célula. Técnicas de microscopía óptica y electrónica. Fraccionamiento subcelular: principio de la centrifugación diferencial y en gradiente. Estrategias para separación y purificación de proteínas: cromatografía; electroforesis; marcación metabólica, utilización de radioisótopos para seguimiento de macromoléculas, etc.

UNIDAD III: Biomembranas. Composición y propiedades. Rol de las proteínas en la actividad biológica de una membrana lipídica. Principios del transporte a través de membranas. Transporte activo y pasivo: transporte mediado por proteínas de membrana (canales, carriers, bombas); transporte en masa: endocitosis y exocitosis. “Lipid Rafts”

UNIDAD IV: Matriz extracelular y uniones celulares. Uniones

célula-célula

y

célula-matriz

extracelular.

Características

y

propiedades de los componentes de la matriz extracelular: glicosaminoglicanos, fibronectina, laminina, colágeno, elastina, etc.

UNIDAD V: Citoesqueleto. Componentes: filamentos de actina, filamentos intermedios, microtúbulos. Funciones del citoesqueleto en la morfología y en la migración de las células, durante la división celular, en el transporte, etc. Diferenciaciones de membrana: microvellosidades, cilias, flagelos, etc.

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GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR UNIDAD VI: Organelas y otras estructuras intracelulares eucariotas. Sistema de endomembranas (retículo endoplasmático, complejo de Golgi, lisosomas), mitocondrias, peroxisomas, etc: estructura y funciones. Estructuras intracelulares no membranosas: ribosomas, centrosomas, proteasomas, etc: estructura y función.

UNIDAD VII: Núcleo y cromatina. Núcleo celular: conceptos básicos. Envoltura nuclear: Transporte bidireccional citoplasma-núcleo. Cromatina: niveles de empaquetamiento. Cromosomas: Centrómero, telómeros, orígenes de replicación. Introducción a la citogenética: Cariotipo normal, bandeos, alteraciones estructurales y numéricas del cariotipo.

UNIDAD VIII: Ciclo celular. Interfase: replicación del genoma celular.

Expresión génica: Transcripción.

Procesamiento del ARN. Traducción. Procesamiento y tránsito de proteínas dentro de la célula. Mitosis. Regulación del ciclo celular en mamíferos: Cdks y ciclinas. Factores de crecimiento y mitógenos. Protooncogenes y genes supresores de tumores. Cáncer. Apoptosis.

UNIDAD IX: Introducción a la señalización celular. Tipos de comunicación celular. Receptores de la superficie celular. Receptores intracelulares. Vías de señalización celular: Segundos mensajeros y moléculas señalizadoras intracelulares. Vías del AMPc y de los fosfoinosítidos.

UNIDAD X: Introducción al sistema inmune Respuesta inmune innata y adquirida. Sistema del complemento. Respuesta humoral y celular. Repertorio de linfocitos T. Clases de inmunoglobulinas y funciones. Moléculas MHC y presentación del antígeno.

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Unidad I: Introducción a la célula eucariota Trabajo Práctico N0 1: Cuestionarios de revisión de conceptos básicos Parte A: Composición química de las células 1) Los elementos minerales que forman parte de la materia viva se clasifican como macro y micronutrientes. ¿Con qué criterio: de tamaño, de abundancia o de grado de importancia? 2) ¿Cuáles son las propiedades del agua que le permiten ser un excelente medio interno para los procesos metabólicos de animales y plantas? 3) Mencione el monómero y el tipo de unión entre monómeros de cada clase de biomolécula. ¿Todas tienen estructura polimérica? 4) Describa los niveles de estructura que puede alcanzar una proteína. ¿Son independientes entre sí? ¿Por qué? 5) ¿Qué nivel de estructura debe adquirir una proteína para ser activa? ¿Por qué? 6) ¿Cuáles son los efectos de desnaturalizar y de hidrolizar una proteína? ¿Cómo pueden lograrse la desnaturalización y la hidrólisis? ¿Alguno de estos procesos es reversible? 7) ¿En qué se diferencian una enzima y una proteína fibrosa como el colágeno? 8) Respecto a la estructura del ADN señale cuáles de los enunciados son verdaderos y, de ellos, cuál responde a la denominada regla de Chargaff. Justifique: a) El contenido de A +T en una hebra es igual al contenido de G+C en la hebra complementaria. b) El contenido de A en una hebra es igual al contenido de T en la hebra complementaria. c) El contenido de A +T+C+G en una hebra es igual al contenido de A+T+ G+C en la hebra complementaria 4

GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR d) El contenido de G en ambas hebras es igual al contenido de C en ambas hebras e) El contenido de A +G en una hebra es igual al contenido de T+C en la hebra complementaria. f) El contenido de A+G en ambas hebras es igual al contenido de T+C en ambas hebras 9) Compare el ADN y el ARN estructural y funcionalmente por medio de una tabla. 10) Siendo los lípidos un grupo muy heterogéneo de macromoléculas, ¿en base a a qué criterio se agrupan entre sí? ¿Que subgrupos se establecen dentro de los lípidos y qué criterio se utiliza para dicha sub-clasificación? 11) ¿Cómo pueden disponerse los lípidos anfipáticos en un medio acuoso? 12) Mencione tres funciones posibles de los hidratos de carbono e indique tres ejemplos de glúcidos que desempeñen cada función. 13) Describa cómo se clasifican los hidratos del carbono de acuerdo al número de monómeros que presenta la molécula. De ejemplos. Parte B: Características generales de las células 1) ¿Qué postula la Teoría Celular? ¿Por qué es una teoría? 2) ¿Cuáles son las propiedades que hacen que pueda decirse que una célula está viva? 3) ¿Cuáles son las propiedades que hacen que pueda decirse que un virus no está vivo? 4) ¿En base a qué criterios se han clasificado a los seres vivos en 5 reinos? ¿Sobre qué base dicha clasificación fue paulatinamente reemplazada por la clasificación en 3 dominios? 5) Complete el siguiente cuadro indicando si cada estructura se encuentra “siempre”, “en algunos casos” o “nunca”:

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Estructura

Célula procariota

Célula eucariota

Núcleo Membrana plasmática Pared celular Citoesqueleto Cromosoma Citoplasma ADN Ribosomas Plásmido Mitocondria Cloroplasto Lisosomas Fosfolípidos Colesterol 6) ¿Una célula procariota puede respirar? ¿Puede fotosintetizar? ¿De qué manera? 7) Existen diferentes maneras de catabolizar los hidratos de carbono. ¿Cuál o cuáles pueden llevar a cabo las células procariotas y cuáles las eucariotas? 8) Si las proteínas cuyo destino es ser secretadas al medio exterior se sintetizan y maduran a través de un sistema de membranas internas en células eucariotas, ¿eso significa que las células procariotas -que carecen de membranas internas- no pueden secretar proteínas? Explique. 9) La fotosíntesis es un proceso de elaboración de hidratos de carbono que sirven para el crecimiento del organismo. ¿Cuáles organismos (de qué reinos) pueden llevarla a cabo? ¿Es indispensable la presencia de cloroplastos? ¿Por qué? ¿Cómo crecen los organismos que no pueden fotosintetizar? 10) ¿Cuáles son las diferencias entre una bacteria y una célula animal a nivel genético?

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Trabajo Práctico N0 2: Repaso de conceptos en base a la lectura de un artículo de revisión Objetivo:

Repasar

conceptos

adquiridos

previamente

acerca

de

las

biomoléculas y su modo de interacción. Consigna: Lea el artículo "Complementaridad intergametos: Breve revisión" teniendo en mente lo que usted sabe acerca de la estructura y función de las biomoléculas. a) Tome nota de las biomoléculas que se mencionan e identifíquelas dentro del grupo correspondiente. b) Describa con un esquema sencillo la interacción entre la membrana del espermatozoide y la membrana del ovocito en cuanto a las biomoléculas intervinientes. c) ¿Cuál es la función de los hidratos de carbono que se destaca en este trabajo? d) ¿A qué se llama "zona pelúcida"?

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UNIDAD II: Herramientas y metodologías para el estudio de la célula Trabajo Práctico N0 1: Cuestionario de aplicación de conceptos 1) Usted trabaja en un laboratorio que dispone de: 

Cuba de electroforesis analítica de proteínas



Microscopio óptico de campo claro



Reactivos para inmunohistoquímica



Dispositivo de diálisis



Columnas

de

intercambio

iónico

(carboximetil

celulosa

y

sefarosa). 

Reactivos para precipitación con solventes poco polares



Ultracentrífuga



Columnas de afinidad



Microcentrífuga



Columnas de filtración molecular

Si debe determinar cómo depende la actividad enzimática de una enzima citosólica hepática de rata (cuyo pI 1 banda de 160 kDa y 1 banda de 200 kDa SDS + β-mercaptoetanol ->1 banda de 100 kDa y 1 banda de 80 kDa SDS + β-mercaptoetanol + endoglicosidasa H -> 1 banda de 80 kDa Responda: a- ¿Por qué método se aísla la fracción microsomal? ¿En qué consiste esta fracción? b-

¿Cómo se llama el procedimiento que se describe paso a paso en el

segundo párrafo? c-Proponga una explicación que dé cuenta de todos los resultados.

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GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR Problema 2: Usted trabaja en un laboratorio de biología molecular bien equipado y debe investigar si el nivel de expresión de una determinada proteína citosólica guarda relación o no con las condiciones de estrés hipóxico (bajo suministro de O2). Para ello elige trabajar sobre una línea de células de mamífero cultivadas in vitro que expresa dicha proteína a un nivel mínimo basal (pero detectable) en condiciones de suministro normal de O2. De la proteína se conoce que posee estructura terciaria globular y que su peso molecular aproximado es de 100 kDa. Suponga que, entre otras cosas, dispone de variadas columnas de cromatografía, incluyendo una de afinidad específica para esta proteína, un anticuerpo monoclonal (específico contra esta proteína) y el kit de detección correspondiente, reactivos para inmunohistoquímica de fluorescencia, un flujo laminar, un protocolo de hipoxia sobre células en cultivo puesto a punto, microscopios óptico de campo claro y de fluorescencia, kits de inmunoblotting (de electroforesis en gel y de transferencia), máquina de PCR, ultracentrífuga, microcentrífuga de mesada, baño con temperatura regulable y estufa de cultivo. a-Enumere, en el orden correspondiente, los métodos que emplearía para cumplir su objetivo y los resultados que espera obtener en cada paso (no describa las técnicas, sólo menciónelas). b- En caso de obtener una variación significativa en el nivel de expresión en condiciones de hipoxia, ¿cómo analizaría si ésta se debe a un cambio en la cantidad de ARN mensajero sintetizado o simplemente a un cambio en la estabilidad de la proteína? Problema 3: Al realizar un SDS-PAGE de un receptor de membrana purificado se obtienen 4 bandas: de 140, 110, 90 y 70 kDa. Cuando las muestras fueron sometidas a SDS + mercaptoetanol, en el gel se distinguen 3 bandas: de 110, 90 y 70 kDa. ¿Cómo es posible que, siendo que el mercaptoetanol separa subunidades ligadas por puentes disulfuro, con su acción desaparece una banda en lugar de aparecer otra?

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GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR Problema 4: Un anticuerpo soluble del cual no se conoce su peso molecular (PM) ni su carga pero sí el antígeno al cual se une específicamente fue purificado por cromatografía, empleando como herramienta el antígeno purificado. Al realizar un SDS-PAGE, sin mercaptoetanol se obtuvo una sola banda muy pesada. Con mercaptoetanol (y SDS) se obtuvieron dos bandas y aunque no fue posible estimar pesos moleculares concretos por falta de controles, una de las bandas corrió como si tuviera el doble de PM que la otra. a-¿Qué tipo de cromatografía se utilizó para la purificación? b-Suponiendo que el anticuerpo no está glicosilado, indique 3 estructuras cuaternarias compatibles con los resultados.

Trabajo Práctico N0 4: Análisis comparativo y crítico de artículos de investigación Objetivo: Comprender, comparar y criticar trabajos metodológicos. Conocimientos previos necesarios: Fundamentos y aplicaciones de técnicas de Northern y Western-blot. Consigna: Responda el cuestionario en base a la lectura de los siguientes trabajos: Revisión: “DNA microarray technology and its applications in cancer biology” Trabajo original: “A rapid microwell fluorescence immunoassay for celular protein detection” Trabajo original: “Rapid protein separations in ultra-short microchannels: microchip sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and isoelectric focusing” 1) ¿Con cuál/es de las técnicas descriptas se puede: a- evaluar el nivel de expresión de determinado/s gen/es? b-separar proteínas según su peso molecular? c-estimar el nivel de biosíntesis de una proteína? 2) ¿Cuál de las técnicas serviría para mejorar la tradicional técnica de SDSPAGE? ¿Y cuál la de Northern-blot? 12

GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR 3) Uno de los trabajos (¿cuál?) sostiene que la técnica descripta es mejor que la de Western-blot en varios aspectos. Discuta esta afirmación. 4)¿Cuáles serían las ventajas de separar una mezcla de proteínas por SDSPAGE en microcanales en lugar de hacerlo en las extensas láminas de gel tradicionales? 5) ¿Cuáles son las utilidades del "DNA microarray" en el estudio del cáncer?

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Unidad III: Biomembranas Trabajo Práctico N0 1: Cuestionario de aplicación de conceptos 1) Enumere

las

principales

propiedades

de

las

biomembranas

y

explíquelas. 2) ¿En qué consiste la difusión simple? ¿Cómo se denomina el desplazamiento de agua por difusión simple? 3) ¿Cuáles son los fosfolípidos de membrana y qué funciones cumplen? 4) ¿Cómo pueden extraerse de la membrana plasmática las proteínas integrales? ¿Y las periféricas? ¿Por qué? 5) ¿Cuál es el esteroide presente en las membranas animales? ¿Cuáles son los esteroides presentes en células pertenecientes a los reinos Plantae y Fungi? ¿Qué ocurre en relación con esto en el reino Monera? 6) ¿Cuáles son las funciones de los carbohidratos en la superficie externa de la membrana plasmática? ¿Qué determinan los carbohidratos de superficie de eritrocitos? 7) ¿En qué se diferencian un transporte pasivo de uno activo? ¿Y uno activo primario de uno activo secundario? 8) ¿Qué tipos de canales de iones conoce? ¿en cuáles aspectos se parecen y en cuáles se diferencian? 9) ¿Cuáles son los pasos de la endocitosis mediada por receptor? ¿La acción de qué organela es necesaria luego del ingreso de la partícula? 10) Realice un cuadro comparativo entre los distintos transportes en masa y otro entre los distintos tipos de transporte molecular. 11) Cómo pueden salir de la célula hacia el medio extracelular y cómo pueden entrar a la célula las siguientes moléculas o partículas: a) Na+ b) K+ c) una glicoproteína d) un aminoácido e) un virus 14

GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR f) dióxido de carbono 12) Cómo pueden entrar a la célula las siguientes moléculas o partículas: a) Ca2+ b) Clc) LDL (lipoproteína que transporta colesterol) d) un monosacárido e) una bacteria f) un esteroide 13) Explique cómo se produce la absorción de glucosa por parte del epitelio intestinal a nivel de los transportes que tienen lugar en la membrana apical y en la basal. 14) Describa el funcionamiento de la bomba de Na+/K+. ¿Qué transporte y qué propiedades de la membrana plasmática dependen de ella? 15) ¿En qué consiste la asimetría de la membrana? ¿Y la fluidez? 16) Dadas las siguientes características de la membrana plasmática: 

permeabilidad selectiva



asimetría



heterogeneidad



fluidez

explique para cada una de ellas: Su origen (es decir, con qué característica/s estructural/es se relaciona) Su significado funcional (es decir, qué consecuencias tiene en las funciones de la membrana). 17) Investigue y enumere las moléculas de transporte involucradas en los pasos de transmisión del impulso nervioso a través de una terminal sináptica. Señale cuáles de los modos de transporte mencionados son activos y cuáles pasivos.

Trabajo Práctico N0 2: Análisis de un trabajo científico Consigna: Lea el trabajo de revisión: “Multiple molecular mechanisms for multidrug -resistance transport” y responda: 15

GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR 1) ¿Qué distintos tipos de transportadores multidroga se conocen? 2) ¿Para qué sirven? ¿Cómo son en cuanto a su especificidad? 3) ¿En qué se diferencian los transportadores ABC (ATP-binding cassette de los otros descriptos en el trabajo? 4) ¿Cuáles tipos pueden estar presentes en células eucariotas? 5) ¿Cuál es el desafío que la existencia de estos transportadores plantea a la industria farmacéutica? 6) ¿Qué estrategias se intentaron para superar este problema? ¿Qué resultado han tenido?

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UNIDAD IV: Matriz extracelular y uniones celulares Trabajo Práctico N0 1: Cuestionario de aplicación de conceptos 1) ¿Cuáles son las funciones genéricas de la MEC? 2) Describa la estructura de una fibra de colágeno. 3) Diferencie las funciones de las distintas proteínas que forman parte de la MEC? ¿Existe la proteína acomplejada? ¿En qué componente? 4) ¿Cuál es la composición de la lámina basal? ¿Por que se dice que es una especialización de la MEC? 5) ¿Qué es un proteoglucano? ¿Qué funciones cumple? 6) ¿Qué tipo de componente es el ácido hialurónico? ¿En qué consiste el agrecán? 7) ¿Cuál es la propiedad de los proteoglucanos que más contribuye a su función? 8) Investigue cuáles son las características de la MEC de diferentes tejidos (hueso, cartílago, tejidos conjuntivo y epitelial). Justifique en base a la composición. 9) ¿Qué tres tipos de moléculas intervienen en toda unión de anclaje entre células y MEC? 10) Realice un cuadro comparativo entre los distintos tipos de proteínas de adhesión. 11) ¿Cuál es el único tipo de proteína de adhesión cuyo mecanismo de unión es independiente de Ca2+? 12) ¿Cuáles tipos de proteína de adhesión intervienen en la adhesión de células migratorias a la MEC y cómo lo hacen? ¿Qué tipo de uniones poco estables se desarrollan? 13) ¿Qué significa que CAM y cadherinas median mayormente uniones homofílicas y las selectinas, heterofílicas? 14) ¿Qué uniones de anclaje y comunicantes caracterizan a las células epiteliales? Describa sus funciones.

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GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR 15) Compare las uniones comunicantes en cuanto al tipo celular en que se encuentran, estructura y función. 16) ¿Cómo se impermeabilizan los epitelios intestinal, de vejiga urinaria y los conductos glandulares para impedir que el contenido de la luz del órgano se infiltre en los espacios intercelulares? 17) ¿Cuáles

son

las

diferencias

entre

desmosomas

y

hemi-

desmosomas? 18) ¿Cómo está formada la banda o cinturón de adhesión? ¿Es lo mismo que la unión estrecha? 19) ¿Por qué se dice que la lámina basal es una especialización de la MEC?

Trabajo Práctico N0 2: Análisis de un trabajo científico Objetivo: Aprender a reconocer problemas actuales dentro de la biología celular y analizar sus posibles interpretaciones. Consigna: Lea el trabajo acerca del fenómeno de entosis y responda las preguntas. 1) En este artículo aparece claramente la diferencia entre las evidencias experimentales de un fenómeno celular y sus posibles interpretaciones. Ratifique lo dicho con los elementos expuestos en esta revisión. 2) ¿Cuáles uniones entre células y entre células y MEC se mencionan y qué relevancia tendrían en la entosis?

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Unidad V: Citoesqueleto Trabajo Práctico N0 1: Cuestionario de aplicación de conceptos 1) ¿Qué

características

comparten

todos

los

componentes

del

citoesqueleto? ¿Todos ellos se polimerizan y despolimerizan fácilmente? 2) ¿Cómo se determina la presencia de citoesqueleto en cortes de tejido? 3) Diferencie los filamentos de actina corticales de los transcelulares y de los musculares en cuanto a sus funciones. 4) ¿Con qué proteína interactúa la actina para llevar a cabo la contracción muscular? ¿Qué proteína regula dicha unión? 5) ¿Cuál es la función de los filamentos intermedios? 6) Diferencie los 5 tipos de filamentos intermedios en cuanto a composición química y distribución tisular. ¿Cuál de ellos tiene localización nuclear? 7) ¿Desde dónde parte la polimerización de los microtúbulos? ¿Cómo ocurre? 8) ¿Cuáles son los diferentes tipos de microtúbulos? ¿En qué se diferencian? ¿Cuál es la función de cada uno? 9) ¿Por qué la endocitosis y la mitosis son procesos que requieren gasto de energía? 10) Realice un cuadro comparativo entre los componentes del citoesqueleto en cuanto a: 

proteínas que los componen



polaridad



estabilidad



espesor de las fibras



localización celular



funciones

11) Investigue de qué manera la droga citocalasina B produce la despolimerización de los filamentos de actina

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GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR 12) ¿Las funciones de los filamentos de actina siempre implican movimiento? Si no es así, dé algún ejemplo. 13) ¿Por qué se usa la identificación de filamentos intermedios para determinar el origen tisular de algunos tumores? 14) Compare la estructura interna de los cuerpos basales de cilias, de los centríolos y de los axonemas de los flagelos. 15) Mencione tres proteínas accesorias motoras de los microtúbulos y describa su función. 16) Investigue por qué drogas como la colchicina, la vincristina, la vinblastina y el taxol inhiben la división mitótica. ¿Todas ellas actúan de igual manera?

Trabajo Práctico N0 2: Análisis de un trabajo científico Consigna: Lea el artículo "Dynamics and mechanisms of the microtubule plus end" y responda. 1) ¿En qué consiste la inestabilidad dinámica de los microtúbulos? 2) ¿Qué ocurre cuando el microtúbulo se ancla a una proteína o estructura celular? 3) ¿Podrían los microtúbulos mover estructuras celulares sin necesidad de proteínas motoras? Justifique su respuesta. 4) ¿Cuál es el papel del GTP en la inestabilidad dinámica? 5) ¿Qué proteínas que se unen a los extremos más y menos se conocen y cuál es su función?

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Unidad VI: Organelas y otras estructuras intracelulares eucariontes Trabajo Práctico N0 1: Cuestionario de aplicación de conceptos 1) ¿Cuáles organelas eucariontes están rodeadas por una membrana simple y cuáles por doble membrana? Mencione a menos tres estructuras internas que no se encuentran rodeadas por membrana. 2) Complete el siguiente cuadro con cruces: Reino:

Monera

Protista

Fungi

Plantae

Animalia

Ribosomas R.E.L. Lisosomas Vacuolas Mitocondrias Plástidos Centrosoma 3) ¿Por qué se dice que el retículo endoplasmático, el complejo de Golgi y los lisosomas forman parte de un solo sistema de membranas internas? Describa las funciones de cada parte del sistema. 4) ¿Cuáles son las proteínas y los lípidos que se sintetizan y procesan a través del sistema de endomembranas? 5) ¿Por qué se dice que el complejo de Golgi “clasifica” proteínas y lípidos? 6) En un examen de Biología Celular un alumno respondió a la pregunta de cuál es la función de los lisosomas lo siguiente: “La función de los lisosomas es degradar las proteínas lisosomales que le envía el aparato de Golgi dentro de vesículas”. Corrija el concepto equivocado. 7) Complete en qué compartimiento celular tiene lugar cada uno de los siguientes procesos metabólicos: Glucólisis:_________________________ β-oxidación de ácidos grasos:___________________ 21

GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR Peroxidación de subproductos metabólicos tóxicos:____________________ Cadena respiratoria:____________________________ Fase bioquímica ú oscura de fotosíntesis:_________________ Ciclo de Krebs o de los ácidos tricarboxílicos:________________________ Síntesis de esteroides:____________________________ Biotransformación de sustancias hidrofóbicas tóxicas:__________________ 8) ¿Cuál es el producto esencial que se produce en las mitocondrias y cuál el subproducto? ¿Qué necesitan consumir para funcionar? 9) Responda la pregunta anterior pero referida a los cloroplastos. 10) Describa la estructura de una mitocondria. ¿Con qué tipo de microscopio se puede observar? 11) ¿Qué funciones puede tener una vacuola? ¿Y un peroxisoma? 12) ¿Qué tipo de organela es esperable que se encuentre más activa en los siguientes tipos celulares? Célula

glandular

animal

productora

de

una

hormona

proteica

glucosilada:____________________ Macrófago en circulación sanguínea:______________________ Célula del mesófilo de la hoja de una planta:____________________ Fibra de músculo estriado animal:_________________________ Célula hepática animal:______________________ 12) Compare las fracciones lisa y rugosa del retículo endoplásmico en cuanto a estructura y funciones. 13) Una proteína que se sintetiza en ribosomas anclados al retículo endoplasmático se ancla en la membrana del mismo a través de dos dominios transmembranales hidrofóbicos. ¿Qué destinos finales podría presentar? 14) ¿En qué compartimientos celulares tiene lugar la glicosilación de proteínas? ¿Cómo se relaciona el hecho de que todos los oligosacáridos de las glicoproteínas de membrana plasmática quedan orientados hacia el medio extracelular con su proceso de formación? 15) ¿Cómo se relaciona la endocitosis con la función lisosomal?

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Trabajo Práctico N0 2: Análisis de un artículo científico Objetivo: Reflexionar acerca de las nuevas evidencias disponibles acerca de la relación estructura-función de una organela conocida. Consigna: Lea el trabajo "Papel de nuevas proteínas mitocondriales" y responda. 1) ¿Qué función desempeñan las mitocondrias de animales homeotermos además de la producción de ATP? ¿Cuál es la condición necesaria?¿Existe relación clara entre la actividad de UCP y termogenicidad? 2)¿En qué tejidos humanos es importante esta función? 3) ¿Qué son los fenómenos de fusión y fisión mitocondrial? 4)¿Qué patologías se relacionarían con alteraciones en actividad de oxidación mitocondrial? 5) La reducción en la expresión de Mfn 2 en células musculares en cultivo se asoció por un lado con distribución mitocondrial desagregada y por otro con menor capacidad de oxidación mitocondrial de sustratos. ¿Esto significa que la desagregación de mitocondrias causa menor eficiencia en funcionamiento mitocondrial?

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Unidad VII: Núcleo y cromatina Trabajo Práctico N0 1: Cuestionario de aplicación de conceptos 1) Describa las características de la envoltura nuclear. ¿Por qué sólo existe durante interfase? 2) ¿Qué tipos de transportes se llevan a cabo a través de los poros nucleares? ¿Qué proteínas intervienen? 3) ¿Cuál es el contenido del núcleo interfásico? 4) En la especie humana (2n=46) ¿Cuántas moléculas de ADN contiene cada núcleo? ¿Varía dicho número durante la interfase? ¿Por qué? 5) ¿Cuáles son los dos principales procesos de biosíntesis que tienen lugar en el núcleo? ¿En qué etapa del ciclo celular sucede cada uno? 6) Describa la estructura molecular de un nucleosoma. ¿Qué fuerzas de unión lo mantienen armado? 7) Describa los niveles de empaquetamiento de la cromatina que podrían estar presentes en un núcleo interfásico. 8) ¿Cuál es el máximo nivel de empaquetamiento al que puede llegar la cromatina? ¿Con cuales modelos de plegamiento estructural pretenden explicarse? ¿En qué etapas del ciclo celular tendrían lugar dichos plegamientos? 9) ¿Cuáles son las tres características principales estructurales y funcionales de un cromosoma mitótico? ¿Se encuentran presentes también durante la interfase? ¿Por qué? 10)¿En qué consiste el nucleolo? ¿Qué moléculas de cromatina participan de él? ¿Cuál es su función? 11) Clasifique los cromosomas de acuerdo a su estructura. Indique, en el cariotipo humano, cuáles son de cada tipo.

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Unidad VIII: Ciclo celular Trabajo Práctico N0 1: Cuestionario de aplicación de conceptos 1) Mencione las etapas del ciclo celular de una célula humana (2n=46) que se divide por mitosis y descríbalas. Aclare para cada una de ellas cuántas moléculas de ADN y cuántos cromosomas existen, si las moléculas de ADN está o no condensadas y si los cromosomas está o no duplicados. 2)Indique en qué fase del ciclo celular ocurre cada uno de los procesos siguientes: 

Separación de cromátides hermanas



Producción de proteínas de secreción



Síntesis de histonas



Expresión de genes ribosomales



Descondensación de cromosomas



Duplicación de centríolos



Armado del huso mitótico

3) Para una célula 2n=20 complete: 

Valor C en G1 y en profase mitótica



Número de cromosomas en G1 y G2



Número de cromátides en G1 y metafase



Número de pares de cromosomas en G1 y en citocinesis

4) Enumere los principales puntos de chequeo del ciclo celular, los parámetros que se controlan y su importancia. 5) El gen p53 es un gen supresor de tumores. Indique su papel en el control del ciclo celular. ¿Qué sucede si se encuentra mutado uno o ambos alelos en una célula somática? 6) Caracterice la replicación del ADN en base a sus propiedades (caracteristicas del mecanismo, tipo de proceso metabólico, fase en que ocurre, moléculas que se requieren para llevarla a cabo). 25

GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR 7) Una célula 2n=32 comienza su ciclo celular. Indique cuál será su constitución cromosómica en cuanto al número haploide/diploide, número de cromosomas y número de moléculas de ADN: 

Al inicio de G1



Al inicio de G2



En metafase mitótica



En cada una de sus células hijas al inicio de G1 tras la mitosis

8) ¿Qué entiende por expresión génica? ¿Qué procesos comprende, en qué compartimientos celulares y en qué fases del ciclo celular los ubica? ¿Cuáles son sus productos? 9) Enumere los distintos tipos de ARN que se transcriben y describa sus funciones ¿Cuáles de ellos deben asociarse a proteínas para ser activos? 10) Diferencie un gen codificador de proteína eucariota de un procariota. 11) ¿En qué se diferencian los genes de ARN ribosomales de los de proteínas en células eucariotas? 12) ¿Qué elementos requiere el proceso de transcripción? 13) ¿Cuáles partes del gen se transcriben y cuales no? 14) ¿Cuáles son los procesamientos del ARN mensajero transcripto primario eucariota? 15) ¿En qué consiste básicamente el splicing? 16) ¿Dónde se sintetiza y se procesa el ARN ribosomal y se forman las subunidades ribosomales? 17) Describa someramente el proceso de traducción mencionando todas las moléculas y complejos moleculares necesarios. 18) ¿En qué se diferencia la síntesis de una proteína citosólica de una de membrana plasmática? 19) ¿Cuáles son los tres modos posibles de desencadenamiento de apoptosis? 20) Realice un cuadro comparativo entre apoptosis y necrosis 21) Señale los cambios morfológicos sucesivos que sufre una célula apoptótica. 22) ¿Cuáles son las vías en las cuales son efectores el citocromo C y la proteína AIF? ¿Cuáles son los efectos de dichas moléculas al ser liberadas en el citosol? 26

GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR 23) ¿En qué consiste la cascada de activación de las caspasas? 24) ¿Cuáles son los nexos entre el control del ciclo celular y la apoptosis? Explique.

Trabajo Práctico N0 2: Análisis de un artículo científico Consigna: Lea el trabajo “El ciclo celular” y realice los puntos 1 a 3 a continuación. 1) Realice un esquema circular del ciclo celular indicando en cada etapa los sucesos principales y los puntos de control principales. 2) Describa las características principales del ciclo celular en cuanto a su progresión en el tiempo (duración, control interno de las transiciones entre etapas). 3) Describa el punto de control principal en G1 y el papel de las proteínas Rb y p53.

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Unidad IX: Introducción a la señalización celular Trabajo Práctico N0 1: Cuestionario de aplicación de conceptos 1) ¿Cuáles son las vías de comunicación intercelular en organismos pluricelulares? Diferéncielas. 2) ¿Cuáles son los mecanismos de acción posibles para una molécula señal hidrofóbica y para una molécula inductora hidrofílica? Dé ejemplos de cada tipo de molécula. Indique la ubicación celular de los receptores en cada caso. 3) Esquematice

los

componentes

moleculares

de

las

vías

de

transducción de señales que involucran la fosfoquinasa A por un lado y la fosfolipasa C por otro. Señale los efectos finales de cada una de las vias. 4) ¿Qué es una proteína G? ¿Cuál es su función? ¿Qué tipos existen? 5) ¿Por qué se dice que a lo largo de la transducción la señal se amplifica? 6) Describa el mecanismo de acción de una hormona esteroidea sobre su célula blanco. 7) Describa los diferentes tipos de receptores de superficie. 8) Indique el mecanismo de acción del óxido nítrico

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Trabajos prácticos de integración y aplicación de conceptos de toda la asignatura Esta sección tiene como objetivo integrar en un análisis conjunto todos los conceptos trabajados en la asignatura y aplicarlos en dos tipos de actividades: aquellas que implican manipulaciones realizadas en el laboratorio de biología por un lado; y aquellas que requieren análisis y producción bibliográfica por otro.

A) Actividades de laboratorio: Trabajo Práctico de laboratorio N0 1: Instrumentación biológica 1- Describa en detalle el equipamiento utilizado para la electroforesis de ácidos nucleicos 2- Describa en detalle el equipamiento utilizado para la electroforesis de proteínas 3- a) Qué micropipeta utilizaría para tomar un volumen de 50 µl? b) Qué micropipeta utilizaría para tomar un volumen de 2 µl? c) Qué micropipeta utilizaría para tomar un volumen de 0,4 µl? d) Qué micropipeta utilizaría para tomar un volumen de 300 µl? 4- a) Qué velocidad máxima alcanza una microcentrífuga estándar? b) Nombre los casos en los que se necesita utilizar una centrífuga refrigerada 5- Cómo se procede para crecer cultivos bacterianos en medio líquido? 6- Describa el equipo utilizado para realizar las reacciones de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) 7- Qué es un lector ELISA? Describa las partes del equipo, y sus aplicaciones 8- Cómo se procede para criopreservar células? 9- Indique en cada caso qué sistema de microscopía Ud. utilizaría para las siguientes aplicaciones: a) Observación de una monocapa de células de riñón de embrión de mono 29

GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR para evaluar la densidad y morfología del cultivo b) Determinación de la estructura de las mitocondrias presentes en tejido de miocardio c) Visualización de la morfología del ojo de un insecto d) Observación del proceso de brotación del virus de leucemia murina a través de la membrana plasmática de un linfocito infectado e) Visualización del resultado de una tinción de Gram de bacterias f) Localización subcelular de una proteína g) Analizar si una proteína está localizada en mitocondrias o es citoplasmática 10- Describa la estrategia que utilizaría para separar una población de linfocitos T CD4+ de una CD8+

Trabajo Práctico de laboratorio N0 2: Separación de fragmentos de ADN por electroforesis en gel de agarosa. 1. Objetivos

 Familiarizarse con las técnicas de separación de macromoléculas por electroforesis

 Separar por electroforesis en gel de agarosa ADN plasmídico así como fragmentos de ADN generados por digestión con enzimas de restricción

 Calcular la masa molecular de moléculas de ADN incógnita a partir de una curva de calibración construida utilizando fragmentos de ADN de tamaño conocido

2. Desarrollo experimental a) Preparar un gel de agarosa en buffer TBE. Tener en cuenta que el porcentaje de agarosa del gel deberá permitir la separación de fragmentos de ADN de tamaño comprendido entre 25 kb y 300 bp, así como el análisis de preparaciones de ADN plasmídico b) Agregar a cada muestra de ADN el buffer de muestra 6X 30

GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR c) Resolver las muestras de ADN por electroforesis hasta que el colorante azul de bromofenol haya migrado aproximadamente ¾ partes del gel d) Teñir el gel con bromuro de etidio (solución 0.5 µg/ml) durante 5 minutos e) Visualizar las bandas de ADN por transiluminación del gel con luz u.v. f) En base a los datos provistos para los fragmentos de la muestra de ADN del fago λ digerido por HindIII, construir la curva de calibración correspondiente y calcular la masa molecular de los fragmentos de ADN incógnita Composición de las soluciones utilizadas:  Buffer 10X TBE: Por litro de solución: 121.1 g Tris base; 55 g ácido bórico; 7.4 g de Na2EDTA. (1 M Tris-borato [pH 8.3], 20 mM EDTA)  6X buffer muestra: 0.25 % de azul de bromofenol; 0.25 % xylene cyanol FF; 0.4 % colorante orange G; 30 % glicerol; 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) y 50 mM EDTA. Este buffer permite sembrar las muestras en los pocillos del gel de agarosa y monitorear la migración durante la electroforesis. En un gel de agarosa 0.5-1.4 % en buffer 1X TBE, el xylene cyanol FF migra aproximadamente como una molécula de DNA de 4 kb, el azul de bromofenol como una molécula de aproximadamente 300 bp, y el orange G como una molécula de aproximadamente 50 bp. 3. Curva de calibración y determinación del PM de los fragmentos de ADN incógnitas Tamaño del fragmento de ADN patrón (pb)

Distancia de migración del ADN patrón (cm)

Distancia de migración del ADN incógnita (cm)

Tamaño calculado para el ADN incógnita (pb)

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Trabajo Práctico de laboratorio N0 3: Análisis

de

proteínas

por

electroforesis

en

gel

de

poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) OBJETIVOS

 Comprender el principio de resolución y separación de polipéptidos por medio de la técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida

 Realizar un análisis comparativo, por medio de la metodología de SDSPAGE, de muestras de lisados de bacterias que producen una proteína recombinante

PARTE PRACTICA

 Análisis por electroforesis de muestras de lisados provenientes de bacterias Escherichia coli que expresan diferentes proteínas recombinantes A. Preparación del gel de poliacrilamida 1- Preparar la solución de acrilamida del gel separador. El porcentaje de acrilamida a utilizar dependerá del tamaño de proteínas a separar 2- Cargar el gel con la solución de acrilamida de gel separador + APS + TEMED, y agregar una delgada capa de butanol 3- Una vez que haya gelificado la parte inferior del gel, lavar exhaustivamente con agua. Secar con papel de filtro la superficie del gel y agregar la solución de gel "stacking". Colocar el peine evitando que queden burbujas en las calles donde se van a sembrar las muestras B. Siembra del gel de poliacrilamida 1- Una vez que se haya preparado la cuba de electroforesis y llenado de buffer de corrida, sembrar las muestras de acuerdo a lo discutido en clase 2- Realizar la migración electroforética a V=cte.=100 volts, hasta que el colorante azul de bromofenol haya llegado al borde inferior del gel.

32

GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR C. Visualización de las proteínas analizadas en el gel de poliacrilamida 1- Una vez separado el gel de las placas de vidrio, lavar 3 veces (5 min cada vez) con H2O, y luego teñirlo en solución de Coomassie Blue coloidal durante 60 min. 2- Desteñir el gel en solución de H2O SOLUCIONES

-

Solución 10X BUFFER DE ELECTROFORESIS: 250 mM Tris base; 2.5 M glicina; 1% SDS (pH 8.3)

-

Solución 4X LOWER (para gel separador): 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)

-

Solución 4X UPPER (para gel stacking): 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8)

-

Solución 10 % (NH4)2S2O8

-

Buffer de siembra Laemmli: 62 mM Tris-HCl (pH 6.8); 2% SDS; 50 mM DTT; 10 % glicerol; 0.01% azul de bromofenol

-

Solución 30 % acrilamida-bisacrilamida (29.2: 0.8)

DATOS ADICIONALES Marcadores de peso molecular a utilizar: Low Range Unstained Protein Marker (marca BIORAD): Fosforilasa b (97,4 kDa); seroalbúmina bovina (62,2 kDa); ovoalbúmina (45 kDa); anhidrasa carbónica (31 kDa); inhibidor de tripsina (21,5 kDa); lisozima (14,4 kDa)

Trabajo Práctico de laboratorio N0 4: Cultivo y propagación de células in vitro OBJETIVOS

 Comprender los fundamentos del cultivo de células de mamífero in vitro  Familiarizarse con las técnicas de cultivo y propagación de células  Determinar, de manera experimental, los requerimientos para el crecimiento y división celular in vitro 33

GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR PARTE PRÁCTICA

 PARTE A: Plaqueo de células en medios de cultivo de diferente composición 1- Disgregación del cultivo de células COS-7L: luego de eliminar el medio de cultivo, lavar la monocapa de células con 1 ml de solución de tripsinaEDTA, e incubar las células a 37 °C en 1 ml de la solución de tripsina hasta que éstas se desprendan de la superficie plástica. 2- Retirar las placas de la estufa, y aspirar repetidamente la suspensión de células con una pipeta de manera de lograr la disgregación completa del cultivo de células. 3- Determinar el número total de células de ese cultivo contando en una cámara de Neubauer 4- Plaquear, en base a lo discutido en clase, la cantidad de células necesaria para que el cultivo alcance la confluencia en 24 horas. CADA ALUMNO PLAQUEARÁ EN UN MEDIO DE CULTIVO DE COMPOSICIÓN DIFERENTE. 5- Incubar las células a 37 °C y 5% CO2 durante 24 horas.

 PARTE B: Evaluación del crecimiento y proliferación de las células COS-7L crecidas en medios de cultivo de diferente composición 4- Observar al microscopio invertido los cultivos de células COS-7L y evaluar si las células: (i) se han adherido a la superficie plástica de la placa; (ii) se han dividido y crecido; (iii) conservan la morfología del cultivo inicial 5- En base a las observaciones y resultados obtenidos, enumerar sus conclusiones respecto de la capacidad de los medios de cultivo utilizados de estimular el crecimiento y proliferación celulares.

34

GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR COMPOSICIÓN DE MEDIOS Y BUFFERS - Buffer de disociación Tripsina-EDTA: 0,5 g/l de tripsina; 0,2 g/l de EDTA en solución buffer de sales de Hanks; contiene rojo fenol. - Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM): sales inorgánicas (0,2 g/l CaCl2; 0,0001 g/l nitrato férrico.6H2O; 0,097 g/l MgSO4; 0,4 g/l KCl; 3,7 g/l NaHCO3; 0,4 g/l NaCl; 0,109 g/l NaH2PO4); L-aminoácidos; vitaminas (0,004 g/l cloruro de colina; 0,004 g/l ácido fólico; 0,0072 g/l mio-inositol; 0,004 g/l niacinamida; 0,004 g/l piridoxina.HCl; 0,0004 g/l riboflavina; 0,004 g/l tiamina.HCl; 0,004 g/l ácido D-pantoténico [hemicalcio]); 4,5 g/l D-glucosa; 0,11 g/l ácido pirúvico; 0,0159 g/l rojo fenol.Na. SUPLEMENTAR CON: 0,584 g/l L-glutamina

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GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR

B) Actividades de análisis y producción bibliográfica: Trabajo Práctico bibliográfico N0 1: Elaboración de una monografía Objetivo: Entrenar al alumno en la búsqueda, organización y comprensión de información referente a la biología celular Reglas de presentación: 1)

Cada

alumno

debe

elegir

un

tema

pertinente

a

la

asignatura

(preferentemente los tópicos trabajados en la primera parte de la misma) y ponerlo a consideración de la docente. Algunos de los temas sugeridos son los siguientes: 

Funciones de los proteoglucanos en la MEC



Dominios especializados de la membrana plasmática (caveolas, lipidrafts)



Papel de receptores y clatrina en la endocitosis mediada por receptor



Participación de selectinas e integrinas en la extravasación de leucocitos durante la respuesta inflamatoria



Funciones del citoesqueleto de actina en adhesión intercelular y anclaje a la MEC



Participación de microtúbulos en el transporte de vesículas y organelas



Participación de filamentos intermedios en uniones de anclaje

2) El alumno deberá recopilar trabajos científicos referentes al tema elegido (de los sitios cuyos links figuran en la lista adjunta). Preferentemente los trabajos deben ser revisiones completas y no menos de tres (3). Si se trata de resúmenes de trabajos deben incluirse al menos seis (6). Las copias de los trabajos analizados deben presentarse como anexo de la monografía en forma completa. Pueden incluirse en la bibliografía libros y sitios de Internet pero ello NO REEMPLAZA el análisis de trabajos científicamente reconocidos. 3) Una vez conseguido el material para trabajar, el alumno podrá reformular el alcance de la monografía (Por ejemplo, si elige el tema "Funciones de los proteoglucanos en la MEC" pero empleará sólo trabajos acerca de las 36

GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR funciones del heparán-sulfato, el título de la monografía será "Funciones del heparán-sulfato en la MEC") 4) Sin contar la carátula, la bibliografía y las figuras (figuras que deben ubicarse en páginas aparte al final, sin olvidar la referencia en el texto), el desarrollo del texto de la monografía tendrá entre 4 y 6 páginas. Todas las páginas deben estar numeradas. La monografía debe presentarse impresa en fuente Times New Roman número 12 en páginas tamaño A4, con interlineado simple y encarpetada. 5) La estructura formal que se requiere es la siguiente: 

Carátula conteniendo título del trabajo, autor, materia, universidad y año



Introducción (que contenga el panorama general del tema Y LOS OBJETIVOS de la monografía)



Desarrollo (que incluye toda la información que aporta el trabajo)



Conclusiones (párrafo breve que destaque y resuma los principales puntos del desarrollo)



Bibliografía, enunciada SEGUN REGLAS DE CITACION CIENTIFICA Ejemplos: para un trabajo: autores (apellido seguido de iniciales de nombres), años de publicación entre paréntesis, nombre del artículo en cursiva, revista, volumen, páginas entre paréntesis. Para un libro se anotan los autores, año, nombre del libro, edición y editorial.

6) La elaboración de la monografía será guiada por la docente a lo largo de las clases. Habrá una fecha límite para la presentación de la monografía por escrito y una fecha posterior para su presentación oral. La presentación consiste en exponer en unos 15-20 minutos los lineamientos del trabajo al resto de la clase y la respuesta a dudas que pudieran surgir. Para la presentación los alumnos podrán utilizar retroproyector, cañón (si está disponible) y el pizarrón.

Sitios de Internet con libre acceso a artículos de Ciencias Biomédicas: Universidad de Belgrano - Biblioteca Digital http://ubbd.ub.edu.ar Desde cualquier PC: elegir Ebsco Publishing

37

GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR Desde las PC de la Universidad: Se puede explorar además la Biblioteca de la SeCyT, entrando desde Consejo de Rectores de Universidades Privadas. PubMedCentral- U.S. National Institutes of Health (NIH) www.pubmedcentral.nih.gov BioMedCentral - The Open Access Publisher www.biomedcentral.com SciELO- Scientific Electronic Library online www.scielo.org Free Medical Journals site www.freemedicaljournals.com Directory of open access journals www.doaj.org World´s biggest Open Access English Language Journal Portal www.openj-gate.org The European Molecular Biolog Organization Journal www.nature.com/emboj The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal www.fasebj.org Springerlink (sólo resúmenes) http://www.springerlink.com Science Direct (Sólo resúmenes) www.sciencedirect.com

38

GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR The Journal of the American Medical Association http://jama.ama-assn.org/ Red de Revistas Científicas de América Latina y el Caribe, España y Portugal http://redalyc.uaemex.mx/ Imbiomed (México) http://www.imbiomed.com.mx/1/1/catalogo.html Revista Medicina Buenos Aires http://www.medicinabuenosaires.com/

Trabajo Práctico bibliográfico N0 2: Cuestionario de integración de conceptos 1) Describa las etapas del ciclo celular en células de mamífero y los mecanismos en que se basa su control. Aclare en qué etapas se realiza la síntesis de proteínas y en cuáles no y en qué etapa puede realizarse un cariotipo y por qué. 2) Explique en qué consiste la apoptosis y cuál es su relación con los mecanismos de control del ciclo celular, con la dinámica del citoesqueleto y la de las interacciones entre célula y matriz extracelular. 3) Las uniones de las células con la matriz extracelular asocian componentes del citoesqueleto con componentes de la matriz a través de proteínas de adhesión celular. Describa cuáles son las proteínas de adhesión, los componentes del citoesqueleto y componentes de la MEC involucrados en este tipo de uniones. Respecto a los componentes del citoesqueleto y de la MEC mencionados, describa su estructura molecular. 4) ¿Qué procesos de biosintesis y qué procesos de degradación ocurren en toda célula eucariota? ¿En qué organelas ocurre cada uno? 5) ¿Qué relación tiene el citoesqueleto con la mitosis, la migración de macrófagos y el transporte a través de membranas?

39

GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR 6) Relacione las técnicas de ADN recombinante aplicadas in vitro con los procesos fisiológicos de replicación, transcripción y traducción y sus requerimientos. 7) Indique en qué tipo de células, en cual/es compartimiento/s subcelular/es (si corresponde)

y en qué fase/s del ciclo celular se producen los siguientes

procesos: a. Duplicación de centríolos b. Alargamiento de telómeros c. Síntesis de proteínas de membrana d. Condensación de cromatina e. Multiplicación de mitocondrias f. Síntesis de histonas g. Síntesis de ADN h. Síntesis de ARN i.

Procesamiento de ARN por splicing

Trabajo Práctico bibliográfico N0 3: Análisis de artículos científicos Objetivo: Integrar los conocimientos adquiridos en la materia y las habilidades de interpretación de trabajos científicos para analizar dos artículos que incorporan diferentes tópicos en su desarrollo. Artículo A: Evidencias de la existencia de microdominios lipídicos (ML) en las membranas de las organelas a) ¿Qué es un ML? b) ¿Cuál es la importancia de la existencia de ML en relación con el modelo de mosaico fluído de la membrana? c) ¿Qué tipo de evidencia (directa o indirecta) se posee de la existencia de ML en membranas de organelas? ¿Sobre qué organelas se han obtenido dichas evidencias?

40

GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR d) ¿Qué funciones de los ML en cada organela sugieren dichos hallazgos? Artículo B: Fagocitosis: mecanismos y consecuencias (publicado en tres partes) 1) ¿Cuáles son las moléculas que intervienen en primer lugar en una cadena de señales? 2) ¿A través de qué vía de señalización se dispara la fagocitosis? ¿Qué tipo de receptor recibe el estímulo? 3) ¿Cuáles proteínas de adhesión intervienen en la diapédesis y la quimiotaxis de los fagocitos? 4) ¿Cómo se relaciona la quimiotaxis con el citoesqueleto? 5) Esquematice y describa la vía mediada por PKC por la cual los macrófagos son activados. 6) ¿Qué papel tendría la fibronectina en la fagocitosis? 7) ¿Qué dos tipos de receptores están involucrados en la fagocitosis? Mencione ejemplos de cada uno. 8) Esquematice la vía de transducción de señales que conduce a los eventos de fagocitosis relacionados con la polimerización de la actina. Aclare cuáles quinasas y cuál o cuáles segundos mensajeros participan. 9) Esquematice la posible vía de transducción que conduce a eventos de fagocitosis relacionados con la producción de IL-1, IL-6 e IL-12. 10) ¿Qué relación tienen los microdominios lipídicos (rafts) y las caveolas con la fagocitosis? 11) Mencione la secuencia de eventos que conducen a la degradación de la partícula ingerida. 12) ¿Para qué es necesaria la presencia de proteínas G pequeñas en los endosomas? 13) ¿Cuáles proteínas del citoesqueleto o asociadas a él permiten el tráfico de fagosomas? 14) Describa las acciones de los fagolisosomas.

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GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR

Bibliografía general de la asignatura: 

Lodish H y Berk A (2006) Biología Celular y Molecular, 5ta edición



De Robertis E y Hib J (2004) Fundamentos de Biología Celular y Molecular, 4ta edición, Edit. El Ateneo, Bs As



Cooper GM (2004) La célula, 3ra edición, Edit. Marbán



Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K. & Walter. P. (2004) La célula, 4ta edición, Edit. Omega, Barcelona



Becker W M, Kleinsmith L J y Hardin J (2007) El mundo de la célula, Edit Pearson Education



Karp, G (2005) Biología Celular y Molecular- Conceptos y Experimentos , 4ta edición, Edit McGraw-Hill

Referencias de los trabajos científicos analizados en los trabajos prácticos: 

Cardona Maya W y Cadavid jaramillo A P (2004) Complementariedad intergametos: Breve revisión Arc. Esp. Urol. 57 10 (1.1071.112)



Becker W M, Kleinsmith L J y Hardin J (2007) La huella genética de DNA. En: El mundo de la célula, Edit Pearson Education



Han J y Singh A K (2004) Rapid protein separations in ultra-short microchannels: microchip sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and isoelectric focusing J. of Chromatoghaphy 1049, (205-209)



Somasundaram K, Mungamuri K y Wajapeyee N (2002) DNA microarray technology and its applications in cancer biology App. Genomics and Proteomics 1 (4)



Lavigne C, de Guignée A y Thierry A R (2008) A rapid microwell fluorescence immunoassay for cellular protein detection Biol. Proced. Online 10 (1): (83-89)



Higgins C F (2007) Multiple molecular mechanisms for multidrug resistance transporters Nature 446 (749-757)

42

GUÍA DE ESTUDIO - BIOLOGÍA CELULAR 

Barcat J A (2008) ¿Canibalismo celular? Entosis Medicina (Buenos Aires) 68 (315-317)



Howard J y Hyman A A (2003) Dynamics and mechanics of the microtubule plus end Nature 422 (753-758)



Zorzano A, Bach D, Pich S y Palacín M (2004) Papel de nuevas proteínas mitocondriales en el balance energético Rev Med Univ Navarra 48, 2 (30-35)



Lomanto Díaz L O, Ortiz Cala O L, Bretón Pinto A I, Gómez Lizcano A I y Mesa Cornejo V M (2003) El ciclo celular Med UNAB Colombia 6, 16 (21-28)



Martínez-Abundis E y Zazueta-Mendizábal C (2008) Evidencias de la existencia de microdominios lipídicos en las membranas de organelos Bioquimia 33 No 4 (164-170)



Rojas Espinosa O y Arce Paredes P (2003) Fagocitosis: Mecanismos y consecuencias. Primera, segunda y tercera parte. Bioquimia Vol 28 No 4 (19-30), Vol 29 No 1 (5-10)y Vol 29 No 2 (55-7).

43

andrología Arch. Esp. Urol., 57, 10 (1.107-1.112), 2004

COMPLEMENTARIEDAD INTERGAMETOS: BREVE REVISION.

Wálter Darío Cardona Maya y Ángela Patricia Cadavid Jaramillo.

Grupo Reproducción, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia.

Correspondencia

Resumen.- OBJETIVO: El objetivo de esta revisión es reconocer el papel de varias moléculas que están participando en la interacción intergametos durante el inicio de la fertilización y su posible relevancia en el desarrollo de un método contraceptivo. MÉTODO: Se hace una revisión de literatura sobre la interacción intergametos. RESULTADOS: La fertilización es el producto de una serie de procesos ordenados que deben sufrir tanto el espermatozoide como el oocito para interactuar y generar un nuevo ser; para que esta interacción se produzca es necesario que ambas células se encuentren en perfecto estado y que se de un reconocimiento, que es dependiente tanto de los residuos de oligosacáridos presentes en la zona pelúcida del oocito, como de receptores presentes en la membrana plasmática

Wálter Darío Cardona Maya Grupo Reproducción-BIOGENESIS, Universidad de Antioquia Carrera 51D Nº 62-29 Medellín, Colombia, Sur América e-mail: [email protected] Trabajo recibido: 18 de febrero 2004

(receptores primarios) y en la membrana acrosomal interna (receptores secundarios) del espermatozoide. CONCLUSIONES: El conocimiento sobre estos procesos originará un mejor entendimiento de los mecanismos moleculares de esta interacción intergametos y podría llevar al desarrollo de herramientas tanto para control de la reproducción como para el estudio de parejas con alteraciones de la fertilidad. Palabras clave: Espermatozoide. Oocito. Receptor. Zona pelúcida. Reacción acrosomal.

Summary.- OBJECTIVE: The aim of this review is to recognize the role of molecules involved in intergamete interactions during the process of fertilization and further understanding of the molecular basis of fertilization in humans for the development of new methods for contraception. METHODS: We carried out a bibliographic review on intergamete interactions. RESULTS: Fertilization is the product of a series of ordered steps that must take place both in the sperm and the oocyte for a correct interaction leading to the development of the new individual; this interaction requires that both cells are in perfect state for recognition to occur; this recognition is dependant on terminal oligosaccharide residues present in zona pellucida and their complementary receptors on sperm plasmatic (primary receptors) and inner acrosomal (secondary receptors) membranes. CONCLUSIONS: Knowledge of these processes will provide a better understanding of the molecular mechanisms

1.108

W. D. Cardona Maya y A. P. Cadavid Jaramillo

in intergamete interaction and could lead to the development of tools for controlling reproduction as well as for helping couples presenting alterations of their Keywords: Spermatozoa. Oocyte. Receptor. Zone pellucida. Acrosome reaction.

INTRODUCCIÓN La espermatogénesis es el proceso de desarrollo y maduración de las células germinales dentro de los túbulos seminíferos y tiene como fin producir espermatozoides completos y funcionales; entre los cambios más evidentes se destacan el desarrollo del acrosoma y del flagelo así como la reorganización del núcleo y del citoplasma. El espermatozoide está formado por tres componentes principales: a) La cabeza de forma elíptica, un poco aplanada, contiene el núcleo conformado por una cromatina altamente condensada y una extensa región de gránulos secretorios llamada acrosoma que es un derivado del aparato de Golgi y contiene las enzimas necesarias que facilitan que el espermatozoide atraviese la zona pelúcida; b) la pieza intermedia donde se encuentran las mitocondrias dispuestas helicoidalmente alrededor del axonema y c) la cola que se origina de uno de los centríolos, produciendo el axonema con su estructura característica de dos microtúbulos centrales rodeados por nueve pares de túbulos periféricos compuestos por tubulina y actina.

diversas funciones que se espera que cumpla; un espermatozoide testicular que ha sufrido espermatogénesis, parece maduro desde el punto de vista morfológico, pero allí en el testículo no ha adquirido aún la capacidad para moverse progresivamente, ni para fertilizar el oocito. En muchas especies, incluyendo el humano, es en el tránsito por el epidídimo donde ocurren las modificaciones bioquímicas y funcionales que le permiten al espermatozoide adquirir la motilidad progresiva y parcialmente la capacidad para fertilizar. La fertilización requiere una secuencia coordinada de eventos entre el espermatozoide y el oocito para formar un zigoto y posteriormente un nuevo individuo. En los mamíferos, la interacción entre el oocito y el espermatozoide ocurre luego de que millones de estos últimos son depositados en el tracto reproductor femenino; cientos de éstos entran al oviducto y muy pocos tienen contacto con el oocito para que solamente un espermatozoide logre penetrarlo. Desde el punto de vista del espermatozoide el proceso de fertilización se puede subdividir en seis pasos: 1) unión especifica del espermatozoide, con el acrosoma intacto, a la zona pelúcida; 2) reacción acrosomal o exocitosis celular del espermatozoide; 3) paso a través de la membrana extracelular del oocito; 4) penetración al espacio perivitelino, el cual se encuentra entre la zona pelúcida y la membrana plasmática; 5) fusión del espermatozoide con la membrana plasmática del oocito y 6) inicio del desarrollo celular del zigoto (1,2), Figura 1. Es importante resaltar cómo dos células altamente especializadas, espermatozoide y oocito, dan un ejemplo único de varios procesos celulares que incluyen: adhesión, señalización, exocitosis, migración, fusión y regulación del ciclo celular.

En el hombre el proceso de espermatogénesis se efectúa desde la pubertad durante toda la vida adulta, debido a lo cual se requiere una renovación constante de las células germinales madre, para asegurar la presencia de espermatogonias que se transformarán a espermatozoides por las diferentes etapas de diferenciación. El espermatozoide es una célula muy especial, ya que tiene que sufrir varias etapas de maduración a través de su vida, debido a la interacción con los diferentes medios por los cuales tiene que pasar y las

Figura 1. Representación grafica de los seis pasos del proceso de fertilización.

COMPLEMENTARIEDAD INTERGAMETOS: BREVE REVISION.

Capacitación espermática Los espermatozoides de todos los mamíferos, tienen que sufrir una serie de cambios secuenciales durante su paso a través del tracto reproductor femenino para que se de la fertilización (3,4). Este proceso denominado capacitación consiste en modificaciones fisiológicas y bioquímicas que le permiten al espermatozoide adquirir la habilidad para interactuar con el oocito. Dichas modificaciones incluyen variaciones en la distribución y composición de lípidos y de proteínas en la membrana, cambios en la fosforilación de las proteínas, hiperpolarización de la membrana plasmática y variaciones intracelulares de calcio y de otros iones (5,6). El espermatozoide después de sufrir la capacitación se une y penetra la matriz extracelular del oocito llamada zona pelúcida, con activación y liberación del contenido acrosomal. Luego de su desplazamiento por la zona pelúcida el espermatozoide se une y se fusiona con la membrana plasmática del oocito, produciéndole activación. Durante esta activación del oocito, que estaba previamente suspendido en metafase II, se completa la meiosis y se desencadena un mecanismo que bloquea la penetración de más espermatozoides a la zona pelúcida, evitando así la poliespermia e iniciando el desarrollo (5). Las consecuencias funcionales de la capacitación son: el desarrollo de una movilidad característica llamada hiperactivación y, la adquisición de la capacidad para sufrir la reacción acrosomal.

a) La hiperactivación: es una activación flagelar que conlleva a un aumento en el ángulo de bateo de la cabeza generando una movilidad característica y una trayectoria no lineal. b) La reacción acrosomal: es un proceso especializado de exocitosis en el cual está involucrado una transducción de señales mediante la activación con los oligosacáridos presentes en la zona pelúcida, lo que desencadena una fusión de membranas y produce la pérdida de éstas y la exposición de la membrana acrosomal interna. La importancia de la reacción acrosomal podría ser la liberación de enzimas hidrolíticas que son requeridas para que el espermatozoide pueda penetrar la zona pelúcida, además de la expresión de moléculas que actúen como receptores para que el espermatozoide pueda ingresar al oocito y ocurra la fusión (7,8).

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El primer evento de transducción de señales en el espermatozoide luego del contacto con la zona pelúcida incluye la activación de canales de calcio tipo T, produciendo un aumento en el influjo de calcio (de –150nM a –400nM) demostrado en varias especies (porcinos, hámster, murinos y humanos) (9), y la activación de la proteína G heterotrimérica, con despolarización de la membrana (de -~60mV a –~30mV), modulación de la activación de una variedad de sistemas enzimáticos y promoción de la fusión de membranas. Esta respuesta produce la activación de la fosfolipasa C y la elevación del pH intracelular (en ~0.3mV) dando como resultado una alcalinización del acrosoma y el mantenimiento del influjo de calcio que da origen al estímulo para la exocitosis (10). Los canales del tipo T se activan con despolarizaciones relativamente pequeñas y dan origen a corrientes de rápida activación e inactivación; se ha establecido que las corrientes a través de los canales T son el único tipo de corrientes de calcio sensibles al voltaje que se expresan funcionalmente durante la espermatogénesis. Se han considerado varias moléculas como responsables de la capacitación de los espermatozoides en el tracto reproductor femenino in vivo: esteroides sulfatados, catecolaminas, β-glucoronidasas, proteasas, neuroaminidasas, arisulfatasas, taurina, hipotaurina, acetil hexosaminadasa, anhidrasa carbónica y glicosaminoglicanos, entre otras. In vitro la evaluación de la capacitación se empezó a inducir con varias sustancias como fluido folicular y suero sanguíneo, pero la composición de estas sustancias era compleja y no se sabía cual era realmente la molécula que realizaba la acción. Actualmente este procedimiento es realizado mediante activación con moléculas fisiológicas como progesterona, factor activador de plaquetas y zona pelúcida o moléculas farmacológicas como ionóforo de calcio A23187, análogos de AMP cíclico y estimuladores de la proteína kinasa C (5). La reacción acrosomal inducida por la zona pelúcida es dependiente de diferentes vías de señalización y se han hecho observaciones que sugieren que la galactosiltransferasa induce exocitosis acrosomal por activación de la proteína G. Entre estas evidencias se tiene que: 1) los anticuerpos contra galactosiltransferasa, que actúan como agonistas, activan la proteína G espermática; 2) la toxina pertussis inhibe tanto la exocitosis acrosomal inducida por anticuerpos contra

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W. D. Cardona Maya y A. P. Cadavid Jaramillo

galactosiltransferasa como la inducida por la zona pelúcida (ZP). 3) los espermatozoides de ratones que sobreexpresan galactosiltransferasa se unen más a ZP y muestran un aumento en la activación de proteína G y 4) el dominio citoplasmático de la galactosiltrasferasa precipita un complejo que contiene proteína G en los espermatozoides lisados (11). Interacción espermatozoide-oocito En los mamíferos, el factor inductor de la reacción acrosomal, como ya se mencionó antes, es la zona pelúcida del oocito que está formada por tres glicoproteínas llamadas ZP1, ZP2 y ZP3. En estudios realizados en ratonas transgénicas a los cuales se les eliminó el gen de la ZP3, se observó que eran infértiles (12), demostrando así que la ZP3 es la glicoproteína encargada, ya sea de bloquear o de permitir la unión del espermatozoide al oocito, debido a la propiedad que tiene de inducir la reacción acrosomal por interacción de sus carbohidratos con receptores específicos en la membrana del espermatozoide (13). La ZP3 es la más pequeña de las tres proteínas, con un peso molecular de 83 kd (14); las otras dos proteínas ZP1 y ZP2 tienen un peso molecular de 200 y 120 kd, respectivamente. Dado que la ZP3 es específica y tiene un papel central durante los estadíos tempranos de la fertilización, es una molécula que serviría, en principio, como blanco para realizar control inmunológico de la fertilidad (15,16). La interacción entre espermatozoide y oocito es específica de cada especie, un espermatozoide de una especie no puede unirse a un oocito de otra especie a no ser que la zona pelúcida sea removida, bien sea con proteasas o con soluciones a pH bajos, como se usa por ejemplo en el ensayo de penetración de espermatozoides a oocitos de hamster libres de zona pelúcida, el cual es utilizado frecuentemente en reproducción asistida con el fin de determinar la capacidad de un espermatozoide para fertilizar. La zona pelúcida posee receptores que son reconocidos por ligandos presentes en los espermatozoides de cada especie y los espermatozoides poseen proteínas que le permiten la unión al oocito, bien sea receptores primarios (antes de sufrir la pérdida de la membrana plasmática) o receptores secundarios (al exponer la membrana acrosomal interna); es decir, la interacción entre estas células está mediada por la complemetaridad de moléculas presentes en la membrana de los respectivos gametos.

En los últimos años se ha dado un progreso significativo en la identificación y caracterización de estas moléculas y ahora se acepta que el reconocimiento entre gametos involucra múltiples receptores de carbohidratos en el espermatozoide y cadenas de oligosacáridos complementarias unidas a proteínas de la zona pelúcida(17,18). Las principales moléculas relacionadas con la interacción del oocito y el espermatozoide son los residuos de carbohidratos presentes en las glicoproteínas de zona pelúcida. Varios estudios en murinos han permitido concluir que la unión entre gametos en esta especie, se encuentra determinada por una cadena de oligosacáridos unidos a una treonina presente en la zona pelúcida, (19) mientras que en otras especies se involucran también oligosacáridos unidos a residuos de asparagina y treonina (20).

Receptores y ligandos en la interacción intergametos

Receptores Espermáticos a) β-1,4 galactosiltranferasa: Es el receptor más extensamente estudiado y su nombre se deriva de la capacidad para adicionar galactosa a glicoproteínas y glicolípidos con residuos terminales de N-acetilglucosamina; cuando está presente en la membrana plasmática, puede actuar como un receptor específico para glicoproteínas, incluyendo ZP3. La β-1,4 galactosiltranferasa es un componente sintetizado del aparato de Golgi de las células somáticas y además está expresado en la superficie celular tanto de células somáticas como de espermatozoides, donde actúa como receptor extracelular para ligandos oligosacáridos. Este receptor posee dos isoformas con diferentes dominios citoplasmáticos, la isoforma corta la cual contiene un dominio citoplasmático de 11 aminoácidos, con funciones en el aparato de Golgi y la isoforma larga que contiene adicionalmente una secuencia de 13 aminoácidos; esta última sólo se encuentra en espermatozoides maduros y media la unión de los espermatozoides a los oligosacáridos en la zona pelúcida (11). Todos los ligandos para galactosiltransferasa poseen residuos N-acetilglucosamina, por lo tanto se puede suponer que la galactosiltransferasa reconoce glicoproteínas que pueden ser aceptoras de galactosa en el aparato de Golgi.

COMPLEMENTARIEDAD INTERGAMETOS: BREVE REVISION.

La importancia biológica de la adhesión entre galactosiltransferasa y la zona pelúcida fue demostrada en varios ensayos in vitro, donde los residuos de N-acetilglucosamina fueron bloqueados o removidos de ZP3 soluble y se disminuyó la capacidad de unión de los espermatozoides a la zona pelúcida (21). En experimentos similares, en modelos murinos, usando zona pelúcida intacta, bloqueando o removiendo los residuos N-acetilglucosamina se redujo la unión de espermatozoides; en otros ensayos bloquearon la galactosiltransferasa mediante el uso de anticuerpos, fragmentos Fab o a-lactoalbúmina (proteína que modifica la especificidad del sustrato de la galactosiltransferasa) y se redujo también la unión de los espermatozoides a la zona pelúcida (22,23).

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b) N-acetilglucosamina: otra de las moléculas propuestas para la unión entre gametos son los residuos de N-acetilglucosamina en la ZP3 (11). Esta molécula interactúa con la enzima β-1,4 galactosiltransferasa del espermatozoide, lo que se demostró a través de la digestión enzimática de los residuos de Nacetilglucosamina; este tratamiento dió como resultado la pérdida de la capacidad de unión a los gametos. En humanos, se ha reportado que existen sitios de unión para la interacción del espermatozoide y el oocito en residuos de N-acetilglucosamina en la membrana de los espermatozoides y que esta unión pudiera estar mediada por la N-glicosidasa (30).

CONCLUSIÓN b) D-manosidasa: Los espermatozoides humanos poseen una D-manosidasa activa (24) la cual puede estar involucrada en la unión a ZP3 y en la inducción de la reacción acrosomal (25,26). c) Proteína Tirosina Quinasa: Esta molécula podría estar involucrada tanto en el reconocimiento de ZP3 como en la transducción de señales para iniciar la regulación de la cascada de exositosis en la reacción acrosomal (27,28).

Ligandos en el oocito para el espermatozoide La composición de las glicoproteinas de la zona pelúcida de varias especies de mamíferos ha sido bien estudiada; en el modelo murino, las dos principales moléculas de unión que se encuentran en la zona pelúcida son: a) α-galactosa: la cadena de oligosacáridos unidas a residuos de treonina en la ZP3 tiene gran importancia en la función receptora. La eliminación de los residuos de galactosa provoca la pérdida de la capacidad de unir espermatozoides de esta proteína (19). En estudios más recientes, utilizando oligosacáridos sintéticos que contenían moléculas de galactosa, se encontró que éstos inhibían la unión de los gametos, siendo independiente el tamaño o el tipo de los oligosacáridos usados (29).

Nuestro grupo de investigación pretende incursionar en el campo de la investigación básica en espermiología, determinando la interacción entre los espermatozoides humanos y algunas moléculas de oligosacáridos presentes en la zona pelúcida como ha sido demostrado en otros modelos animales. Los resultados que se obtengan durante esta investigación permitirán implementar un nueva herramienta en el estudio de la infertilidad masculina debido a que se podrán generar resultados sobre el estado funcional espermático que permitirán al clínico realizar un mejor diagnóstico; ésto básicamente debido a la determinación de la reacción acrosomal usando la lectina pisum sativum marcada con isotiocianato de fluoresceína como una prueba diagnóstica de rutina. El conocimiento sobre los oligosacáridos presentes en la zona pelúcida y su interacción con los receptores presentes en la membrana plasmática del espermatozoide, llevaría a un mejor entendimiento de los mecanismos moleculares de esta interacción, lo cual permitirá el desarrollo de herramientas para un control reproductivo y un mejor entendimiento de ciertos tipos de infertilidad. Aunque no se puede desconocer de todas maneras que el estudio del proceso de interacción entre el espermatozoide y el oocito pueden ser bastante difícil debido a la restricción en el uso de oocitos humanos en las diferentes metodologías investigativas.

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