BREVE RESUMEN HISTÓRICO DE LA RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR Francisco Sánchez Ferrando Departament de Química, Universitat Autònoma de Barcelona 08193 Bellaterra, Barcelona

La resonancia magnética nuclear (RMN) es una técnica transversal, cuyos fundamentos y/o aplicaciones abarcan todo el ámbito de las ciencias experimentales clásicas (matemáticas, física, química, biologia, geologia), las tecnologías (informática, ciencia de materiales) y las ciencias de la salud, en especial la medicina. Ahora bien, en este último ámbito es frecuente que los facultativos se refieran a la resonancia magnética (denominación incompleta con que es conocida incluso por el gran público), sin el adjetivo nuclear, conscientemente omitido por la profesión médica (y en consecuencia por los medios de comunicación), posiblemente por temor a que el público desinformado pueda asociar esta técnica a eventuales radiaciones potencialmente peligrosas producidas por desconocidos procesos radiactivos. Permítanme tranquilizarles inmediatamente: la estabilidad del protón, núcleo mayoritariamente utilizado para la obtención de las espectaculares imágenes médicas por RMN a que estamos habituados, es muy elevada. La vida media del protón es de unos 1031 años, mucho mayor que la edad del Universo desde el Big Bang. Únicamente gracias a su gran abundancia se espera poder detectar en alguna ocasión la desintegración espontánea de un protón, y las probabilidades de que ello ocurra durante los pocos minutos que dura una exploración médica por RMN son realmente muy, muy pequeñas. Bromas aparte, la supresión injustificada del adjetivo nuclear debe ser enérgicamente rechazada por toda la comunidad científica. Veamos someramente las interrelaciones entre las ciencias básicas y la RMN. La matemática, por ejemplo, ha proporcionado herramientas como la transformación de Fourier en una o varias dimensiones, o la teoría estocástica, que son imprescindibles para la obtención de espectros a partir de mediciones primarias de magnetización. La física, por supuesto, se encuentra en la raíz misma del fenómeno de la RMN, a partir de estudios del momento angular intrínseco (o spin) de ciertos núcleos. La informática ha permitido el control rápido, fiable y reproducible de las muy diversas variables experimentales involucradas en la obtención de espectros RMN, tales como pulsos de radiofrecuencia de unos pocos microsegundos, con fases predeterminadas hasta una precisión de menos de medio grado sexagesimal, períodos de evolución de micro- a milisegundos, potencias de irradiación,

control de temperatura, etc. También la informática ha permitido la digitalización de la señal, así como la transformación de Fourier numérica. La química ha sido, desde hace más de cincuenta años, la gran beneficiaria de las aplicaciones de esta técnica, que permite descifrar detalles muy sutiles de la estructura molecular de los compuestos, así como estudiar su comportamiento dinámico y sus reacciones. La biología, especialmente la fisiología, la bioquímica y la biología molecular, ha podido investigar con gran detalle las biomoléculas, tanto en estudios estructurales de biopolímeros como en el seguimiento dinámico de rutas metabólicas y, más recientemente, empleando la espectroscopía localizada in vivo. La geología, por su parte, ha podido aprovechar las técnicas de RMN en fase sólida en estudios estructurales de minerales o de nuevos materiales, e incluso se han descrito aplicaciones de antenas RMN para la determinación del contenido en aceites minerales (petróleo) de las rocas. Dado que los fundamentos de la RMN son sobradamente conocidos, no se repetirán aquí. Bastará con enumerar los conceptos de spin nuclear I y el momento angular P asociado, su cuantización (en magnitud y en orientación respecto al campo magnético B0), su relación con el momento magnético µ (de la forma µ = γP), que introduce la constante magnetogírica γ como característica de cada isótopo, y la frecuencia de Larmor, ν0, a la que precesionan los spins, y que lleva a la bien conocida expresión

ν

0

=

γ

B

2π

0

que para el protón, 1H, cuya constante magnetogírica vale γH = 26.75 x 107 rad T-1 s-1 , operando con un campo magnético B0 = 2.35 T (23500 gauss), da una frecuencia de Larmor de 100.00 MHz, dentro del rango de la radiofrecuencia. Como es bien sabido, la irradiación de la muestra, por medio de radiación electromagnética polarizada circularmente en el plano perpendicular a B0 y cuya frecuencia sea precisamente la de Larmor, lleva a la resonancia del sistema, produciéndose transiciones entre los niveles energéticos. La detección de la absorción de esta radiofrecuencia en un espectrómetro RMN no es inmediata, ya que las cantidades de energía involucradas (hν0) son muy pequeñas, alrededor de unas pocas milicalorías por mol. Ello impide el uso de técnicas tradicionales en las espectroscopías ópticas (UV-vis, IR), en las que se comparan las intensidades de dos haces de radiación, uno de los cuales ha atravesado la muestra mientras que el otro constituye el haz de referencia. Así, a causa del pequeño valor de las energías involucradas, la RMN es una técnica espectroscópica de muy baja sensibilidad. En condiciones óptimas, en un espectrómetro moderno de alto campo magnético, se requiere un mínimo de 1015 spins de una determinada especie isotópica (de las "fáciles" de medir) para poder detectar señales útiles en un período de una hora. Y, a pesar de estas limitaciones, la RMN es la técnica más ampliamente utilizada en investigaciones estructurales o dinámicas de compuestos químicos en fase condensada, tanto desde el punto de vista de los físicos como, en especial, del de los químicos, y más recientemente de los biólogos o los médicos. A diferencia de otras técnicas de investigación estructural, la RMN no se limita al caso de pequeñas moléculas de bajo peso molecular y alta simetría, sino que proporciona datos precisos y muy útiles incluso con biopolímeros de peso molecular relativamente elevado (proteínas), sin requerir la previa cristalización de la muestra.

Esta gran utilidad de la RMN se puede describir usando las palabras de Richard R. Ernst, Premio Nobel de Química 1991: Los sistemas de spins nucleares presentan características singulares que los predestinan para el estudio de las moléculas: 1) Los núcleos atómicos empleados como sensores se encuentran perfectamente localizados, con diámetros de unos pocos femtometros, y pueden proporcionar información sobre la situación de su entorno inmediato, haciendo así posible una exploración muy detallada de las moléculas y de la materia. 2) La energía de interacción de los sensores con el entorno es pequeñísima, inferior a 0.2 J mol-1, equivalente a la energía térmica a 30 mK. De este modo, la observación y la medición de propiedades moleculares se puede realizar prácticamente sin perturbaciones. No obstante, las interacciones presentan una elevada sensibilidad respecto del entorno local. 3) La información sobre la estructura de las moléculas puede obtenerse a partir de las interacciones entre pares de núcleos. Así, las interacciones magnéticas dipolo-dipolo proporcionan información sobre las distancias internucleares. Por su parte, los acoplamientos escalares J permiten la determinación de ángulos de torsión. Este conjunto de propiedades es el que ha hecho que la RMN sea hoy una herramienta imprescindible en todos los laboratorios de química preparativa y de bioquímica estructural o dinámica. En otro contexto, los instrumentos de imagen por RMN son también imprescindibles en los hospitales. Pero para llegar a la situación actual ha sido preciso superar las dificultades asociadas a la baja sensibilidad característica de la RMN. De hecho, la historia de la RMN es una sucesión de brillantes avances experimentales que han permitido ir aumentando con los años la sensibilidad de la técnica.

Un poco de prehistoria: la gestación de la RMN Un resumen de los acontecimientos que llevaron al descubrimiento de la RMN en fase condensada sería incompleto sin la inclusión de su prehistoria, caracterizada por notables esfuerzos experimentales destinados a demostrar primero y a detectar después la existencia de un momento angular de spin asociado a los núcleos, con su correspondiente momento magnético. Los conceptos de spin electrónico y del momento magnético del electrón fueron experimentalmente confirmados al comienzo de los años veinte por medio del famoso experimento de Stern-Gerlach, en el cual se separaron haces de átomos en un campo magnético inhomogéneo de acuerdo con la orientación del momento magnético de sus electrones desapareados. Hacia finales de los años veinte, Pauli demostró claramente que muchas de las características de la estructura hiperfina de los espectros atómicos únicamente se podían explicar si determinados núcleos atómicos presentaban también spin y su correspondiente momento magnético. Posteriores refinamientos del experimento de Stern-

Gerlach lo confirmaron en el año 1933, y proporcionaron unos primeros valores aproximados del momento magnético del protón. Se había formulado, así, la predicción de la existencia de un spin nuclear para ciertos átomos, incluyendo el hidrógeno, que era preciso medir con exactitud. En 1936 el físico C.J. Gorter intentó medir la resonancia magnética de núcleos de 7Li en LiCl sólido mediante técnicas microcalorimétricas, pero sin resultado. Tampoco consiguió detectar la resonancia de 1H en cristales de alumbre potásico hidratado. Posteriormente lo volvió a intentar con LiF sólido, nuevamente sin éxito. Hoy sabemos que una posible causa de su fracaso es que el LiF cristalino de gran pureza presenta una relajación longitudinal anormalmente lenta, de modo que se requieren tiempos anormalmente elevados para que se polarice la muestra una vez sumergida en el campo magnético y se pueda, así, medir su resonancia magnética nuclear. Fué precisamente Gorter el primero en usar por escrito la expresión Nuclear Magnetic Resonance en el título de uno de sus artículos, publicado en 1942, pero siempre atribuyó esta expresión a I.I. Rabi. En 1937 B.G. Lasarew y L.W. Schubnikow demostraron que, a bajas temperaturas, los momentos magnéticos nucleares contribuyen apreciablemente a la susceptibilidad magnética estática observada en el hidrógeno sólido. El experimento crucial en la prehistoria de la RMN llegó en 1939, cuando I.I Rabi y colaboradores diseñaron y probaron una importante mejora de las técnicas de haces que permitió, por primera vez, la observación de resonancia magnética nuclear, aunque en haces moleculares (carentes de spin electrónico), y que constituyó la primera medición del momento magnético del protón. Además de hacer pasar un haz de moléculas por un campo magnético inhomogéneo (para deflectarlas) y por un segundo campo también inhomogéneo pero de signo opuesto (para reenfocarlas), Rabi intercaló entre ambos campos inhomogéneos un tercer campo, variable pero homogéneo. Al irradiar la región central (campo homogéneo) con radiación electromagnética de frecuencia constante, dentro del rango de la radiofrecuencia, y realizar un barrido del campo magnético central homogéneo, el haz resultó inalterado excepto para un muy estrecho rango de valores del campo central homogéneo. Para los valores de este estrecho rango el haz divergía y ya no se producía el reenfoque sobre el detector. Había nacido la resonancia magnética nuclear, aunque Rabi la denominó espectroscopía de radiofrecuencia. Por este importante descubrimiento se concedió a Rabi el Premio Nobel de Física de 1944. Poco después de este brillante experimento, y usando el mismo tipo de instrumento, Álvarez i Bloch midieron el momento magnético del neutrón, pero la guerra mundial introdujo un paréntesis en estas investigaciones fundamentales sobre RMN. No fué sino en 1945, acabada la guerra, que dos grupos de Estados Unidos, trabajando independientemente, intentaron nuevamente medir resonancia magnética nuclear en materia condensada, pese a la falta de éxito anterior de Gorter. Uno de estos dos grupos, dirigido por E.M. Purcell, trabajaba en la Universidad de Harvard, Massachusetts. El otro, dirigido por Felix Bloch, lo hacía en la Universidad de Stanford, California. Ambos investigadores no se conocían personalmente, pese a que F. Bloch había pasado los años de la guerra trabajando en proyectos militares precisamente en Harvard. Según el relato de W.G. Proctor, discípulo de Bloch que descubrió el fenómeno del desplazamiento químico, fué justamente durante los años de guerra pasados en Harvard cuando Bloch desarrolló tranquilamente (en casa, trabajando de noche) sus ideas

sobre RMN en fase condensada. Por este motivo fué posible efectuar con éxito el experimento a los pocos meses de su retorno a Stanford, acabada la guerra.

RMN en fase condensada: el nacimiento de la RMN La primera detección de resonancia magnética nuclear en materia condensada fué conseguida por el equipo de Purcell, Torrey y Pound en Harvard, poco antes de las Navidades de 1945 (su artículo se recibió en Phys. Rev. el día de Nochebuena). El experimento consistió en situar un bloque de parafina sólida, de 850 mL, en una cavidad resonante de radiofrecuencia, alimentada a 29.8 MHz por medio de un circuito apropiado. Este conjunto se hallaba dentro de un electroimán de campo magnético variable. La señal de salida del resonador se equilibró con una parte de la señal procedente de la fuente de radiofrecuencia, y al proceder a un barrido del campo magnético se observó una aguda absorción por resonancia para un valor del campo de 7100 gauss. Este experimento de detección directa de la absorción resulta equivalente a los intentos infructuosos de Gorter unos pocos años antes. Es interesante señalar que al planificar su experimento Purcell desconocía el fracaso anterior de Gorter. Cuando Rabi supo lo que Purcell quería hacer, le hizo notar que Gorter no lo había conseguido, pero Purcell decidió que los preparativos estaban ya demasiado avanzados para renunciar, y siguió adelante con lo que, en definitiva, acabaría siendo la primera detección de RMN en materia condensada. De manera completamente independiente, el equipo de Felix Bloch en Stanford consiguió, a fines de diciembre de 1945, detectar también señales de RMN de protón, utilizando un equipo experimental muy diferente y sobre una muestra de agua. En lugar de un único circuito de radiofrecuencia, en el experimento de Bloch se utilizaron dos bobinas, mutuamente ortogonales, una para la excitación y la otra como detector. También en este caso, las dos bobinas se hallaban dentro de un fuerte campo magnético variable, perpendicular a ambas bobinas, y la elegante aproximación de Bloch preveía detectar sobre la segunda bobina la fuerza electromotriz inducida por la precesión de la magnetización nuclear de la muestra, provocada por la primera bobina al producirse la absorción. Por este motivo, en Stanford el fenómeno se denominó inicialmente inducción nuclear. Resulta interesante seguir el relato de uno de los investigadore participantes. Dice M.E. Packard: Hacia el cuarto trimestre de 1945, en Stanford, bajo la dirección del Prof. Bloch, nos habíamos propuesto la tarea de detectar las señales de inducción nuclear (nombre que en aquella época dábamos a la RMN) de los protones en fase condensada. A este fin Russell Varian, que también pertenecía al Departamento, construyó un electroimán con una cavidad que, llena de agua, era nuestra muestra de protones en fase condensada. La bobina de excitación y la de detección eran mutuamente ortogonales entre sí, y también lo eran con el campo magnético. La fuente de radiofrecuencia era muy parecida a uno de los radares utilizados durante la guerra. Pero el campo magnético era demasiado inhomogéneo. Pese a todos nuestros esfuerzos, no conseguíamos ver la señal de inducción nuclear en la pantalla del osciloscopio, de modo que propuse un método consistente en realizar un barrido rápido de la corriente del imán con la esperanza de que, en algún instante, el campo magnético y la radiofrecuencia tendrían la relación precisa para dar la señal esperada. Tras diversos intentos, unos días después de Navidad, hallándome solo en

el subterráneo del laboratorio, conseguí ver la señal deseada al apagar la corriente del electroimán (ciertamente, el más rápido barrido imaginable). Como es de suponer, la excitación en Stanford fué máxima, y rápidamente se escribió un artículo describiendo el nuevo fenómeno, sin tener conocimiento del artículo de Purcell sobre el mismo tema. El artículo de F. Bloch, W. Hansen y M.E. Packard llegó a Phys .Rev. el 29 de enero de 1946, y ambos artículos se publicaron en el mismo número de la revista. Pocos años después, en 1952, Purcell y Bloch recibieron conjuntamente el Premio Nobel de Física por su descubrimiento, ya definitivamente conocido como resonancia magnética nuclear (RMN). Resulta interesante indicar que, a diferencia de Purcell, Bloch conocía perfectamente los trabajos infructuosos de Gorter, pero creía tener una explicación para su fracaso. Bloch suponía que el experimento de Gorter había fallado porque el tiempo de relajación T1 era mucho más largo de lo que se imaginaba. Para superar esta dificultad, Bloch propuso a sus colaboradores que pusieran su muestra de agua dentro del fuerte campo magnético del electroimán durante unos cuantos días, antes de intentar las mediciones, para permitir que el sistema de spins nucleares llegara al equilibrio térmico. Así se hizo, y tras poner la muestra Bloch se marchó a esquiar durante unos días. Al regresar al laboratorio, tras diversos intentos infructuosos, finalmente se logró medir la señal de resonancia, pero también se pudo determinar que el tiempo de relajación era mucho más corto de lo supuesto. En realidad, ¡sólo eran precisos unos segundos, en lugar de días, para establecer el equilibrio! La brillante concepción de Bloch sobre la resonancia magnética nuclear, tanto desde el punto de vista teórico como desde el experimental, ha sido confirmada por sus numerosas aportaciones durante el resto de la década de los años cuarenta. Pero uno de los aspectos más importantes le pasó por alto: la gran disminución de la anchura natural de las señales RMN en líquidos causada por sus movimientos térmicos, convincentemente demostrada por Bloembergen, Purcell y Pound en Harvard, en su artículo publicado en 1948. Hasta conocer en Stanford el contenido de este artículo, la gran anchura de banda de las señales RMN observadas por el equipo de Bloch se atribuyó, erróneamente, a su anchura natural, causada por las interacciones dipolo-dipolo descritas por Bloch en sólidos. En realidad, para muestras líquidas, esta gran anchura de banda era debida a la gran inhomogeneidad de campo magnético de todos los imanes disponibles en Stanford durante aquellos años iniciales.

Descubrimientos de gran significación química: la primera infancia de la RMN El período 1945-1955 está marcado por el gran ritmo de los descubrimientos efectuados por los físicos dentro del campo de la RMN. Inicialmente, tras el descubrimiento de Purcell y Bloch, tanto sus grupos como otros investigadores se dedicaron a medir los momentos magnéticos (o, más precisamente, las constantes magnetogíricas) de todos los elementos (o isótopos) todavía no estudiados, con el objetivo de buscar relaciones entre la magnitud medida y la estructura nuclear. Subyacente en este método se encontraba la hipótesis de que el momento magnético de un determinado núcleo (o isótopo) presentaría siempre el mismo valor, independientemente de cuál fuera el compuesto utilizado para la determinación. Al mejorar la calidad de los dispositivos experimentales fué posible aumentar la resolución de las señales. Esto condujo al descubrimiento del desplazamiento químico, de evidente trascendencia en química, y consistente en que las señales de una determinada

especie isotópica presentan frecuencias que dependen de la especie química sobre la cual se efectúan las determinaciones. Este descubrimiento fué efectuado en Stanford por Proctor y Yu, dos jóvenes estudiantes postdoctorales del grupo de Bloch. Sigamos el relato de W.G. Proctor: Tras haber diseñado y construido un espectrómetro RMN de campo muy homogéneo, que constituyó mi tesis doctoral en Stanford, el Prof. Bloch nos encargó a Yu (recién graduado en Ohio State University) y a mí la tarea de localizar las resonancias y medir los momentos magnéticos y los spins de cuantos isótopos estables fuera posible, con el objetivo de completar la tabla periódica en un año, aproximadamente. En el curso de estos trabajos, al tocarle el turno al nitrógeno como núcleo de referencia, nos propusimos medir su momento magnético con gran precisión (creo recordar que la resonancia de 14N había sido medida el año anterior por Pound en Harvard). Recuerdo que fuí al almacén de química y anduve rebuscando un compuesto que diera la resonancia más fuerte posible. Pronto elegí el frasco marcado NH4NO3, ya que obviamente había de ser muy soluble en agua y, además, al tener dos nitrógenos había de dar una señal muy fuerte. Tras preparar una solución concentrada e introducirla en el imán, Yu y yo aguardábamos expectantes junto al imán, esperando que el pequeño motor de reloj que cambiaba gradualmente la frecuencia del espectrómetro hiciera aparecer la resonancia. Así fué, y apareció una magnífica señal de resonancia en la cinta que registraba el espectro. Pero mientras mirábamos, para nuestro asombro, apareció una segunda señal de igual amplitud que la primera. Incrédulos, repetimos el experimento diversas veces para descartar cualquier posible error instrumental, siempre con igual resultado. Subimos los registros al despacho del Prof. Bloch, que se mostró muy interesado, e inmediatamente nos pusimos a discutir posibles causas para este fenómeno. Seleccionamos dos posibles explicaciones, una mucho más interesante que la otra. La más interesante era la posible existencia de isómeros nucleares estables, de la misma masa, con propiedades ligeramente distintas. Creíamos haber hecho un descubrimiento físico trascendental. Pero era preciso descartar la segunda posible causa, sin ningún interés para nosotros, consistente en algún fenómeno químico, tal como un apantallamiento diamagnético del núcleo, dependiente de su entorno químico, que pudiera afectar la densidad electrónica del núcleo de nitrógeno. Para descartar esta segunda y poco interesante hipótesis, Bloch pidió al Prof. Segra una pequeña muestra de 15N. Si las dos resonancias no aparecían en una muestra de nitrato amónico preparada a partir de 15N, obviamente la explicación había de ser nuclear, como nosotros deseábamos, y no simplemente química. La conversión de la muestra de 15N en nitrato amónico tardó tres semanas, muy angustiosas para todos nosotros. Finalmente la muestra llegó y, a las pocas horas, habíamos vuelto a observar las dos señales de igual intensidad, proporcionalmente con la misma separación entre ambas. Por tanto, nos vimos forzados a admitir que se trataba de un enojoso efecto meramente químico, que podía llegar a impedirnos progresar rápidamente en nuestra carrera. Nuestro artículo se publicó en 1950 en forma de carta, y por casualidad en el mismo número de Phys. Rev. que contenía un artículo de W.C. Dickinson, de MIT, que describía el mismo fenómeno para el núcleo de 19F. De este modo se descubrió el desplazamiento químico, sin el cual la RMN no tendría hoy gran utilidad analítica. Y fué precisamente durante sus estudios para clarificar las causas del

desplazamiento químico cuando Gutowsky, a principios de 1950, descubrió el acoplamiento escalar spin-spin. Sigamos su relato: A comienzos de 1950 nos interesaba investigar desplazamientos químicos en líquidos, y seleccionamos el núcleo de 19F. Inicialmente probábamos cualquier compuesto fluorado que nos cayera en las manos, hasta que el 26 de abril de 1950 conseguimos resolver las señales de un trifluorometilbenceno fluorado también en el núcleo aromático. Esto nos motivó mucho, y nos llevó a pensar de qué modo podríamos correlacionar los desplazamientos químicos con la estructura molecular. Influenciado por el libro de Linus Pauling, The Nature of the Chemical Bond, pensé que el desplazamiento químico, como fenómeno eléctrico, debería estar relacionado de algún modo con la naturaleza del enlace químico. Éste, a su vez, depende de la naturaleza de los átomos que se enlazan, de modo que decidí estudiar los fluoruros binarios sencillos, elección que resultó ser muy afortunada. El día 8 de septiembre de 1950, en nuestro laboratorio, C. Hoffmann observó por primera vez una línea doble en la resonancia de 19F de una pequeña muestra de PF3 que él mismo había sintetizado como parte de nuestro estudio de los desplazamientos químicos del flúor. Como la síntesis se efectuó por fluoración de PCl3, decidimos que la doble línea era debida a la presencia de impurezas de PClF2 o PCl2F. Pero, tras purificar la muestra, el par de señales permanecía inmutable. El mismo resultado se obtuvo con una muestra de PF3 preparada por otra ruta. También en una muestra de PF5 se observaron dos bandas, y en este caso la explicación que parecía más razonable era que se trataba de desplazamientos químicos diferentes para los F ecuatoriales y los apicales. Finalmente, en marzo de 1951, al examinar el espectro de 31 P de POCl2F, se observó un doblete 1:1 que me convenció de que habíamos hallado un nuevo tipo de interacción internuclear relacionada con los estados de spin de ambos núcleos. En efecto, el espectro de 31P de CH3OPF2 presentó un triplete 1:2:1, tal como yo había predicho. Así se descubrió el segundo gran parámetro de la RMN, sin el cual carecería de la gran utilidad analítica que ha alcanzado. Las mejoras instrumentales de aquellos primeros años permitieron muy pronto la observación de diferentes desplazamientos químicos de protón en compuestos orgánicos (el primero fué el etanol), en forma de lo que por aquel entonces se conocía como señales "bien resueltas", de intensidad proporcional al número de protones. El procedimiento habitual para la observación de líneas de RMN en aquellos tiempos consistía en variar la frecuencia (o, más a menudo, el campo magnético) a través de la condición de resonancia, recoger las señales de deflexión en un osciloscopio y registrarlas. Este método, denominado de onda continua (CW, continuous wave) ha sido el generalmente utilizado durante muchos años, porque permite la observación secuencial de cada una de las muchas líneas de absorción de multipletes complejos, pero se requiere que el barrido sea muy lento para permitir el registro sin distorsiones de las bandas, y ello ha exigido considerables mejoras en la estabilidad de los instrumentos, ya que cada registro de un espectro suele requerir unos diez minutos. Bloch sugirió desde el inicio un procedimiento alternativo de excitación mediante un muy corto pulso de radiofrecuencia. En 1949 E. Hahn demostró que este procedimiento, efectivamente, era capaz de inducir una señal (FID, free induction decay) correspondiente a la

libre precesión de la inducción nuclear. Además demostró que empleando secuencias de pulsos se generaban ecos de spin que contenían información adicional sobre el sistema. Los métodos de pulsos desarrollados por Hahn, que son la base de la RMN actual, se convirtieron en los preferidos por los físicos para el estudio del comportamiento dinámico de la relajación de sistemas sencillos, a menudo de una única línea en el espectro RMN, talos como, p.ej., las muy anchas bandas de absorción de muestras sólidas. Por otra parte, en el estudio de la relajación, en 1953 se descubrió el efecto nuclear Overhauser (NOE), si bien sus aplicaciones químicas tuvieron que esperar algunos años. De este modo, hacia principios de los años cincuenta, toda la teoría de la RMN había sido completamente desarrollada por los físicos, que progresivamente fueron perdiendo interés por un fenómeno ya tan bien conocido en sus principios fundamentales como la RMN. Y, de modo casi natural, el interés por la RMN se desplazó de la física a la química, gracias a sus numerosas aplicaciones. En palabras de M.E. Packard, "chemists got the point very quickly, thanked the physicists, and took over".

Primeras aplicaciones químicas: la preadolescencia de la RMN El grupo de físicos dirigido en Stanford por los profesores Bloch y Hansen estaba constituido, entre otros, por personas como Russell Varian, Martin Packard, W.G. Proctor, W.A. Anderson y otros que en 1948 fundaron una nueva empresa, denominada Varian Associates, en Palo Alto, California, no muy lejos del campus de Stanford. Para fundarla se vieron obligados a dejar la Universidad de Stanford, olvidar sus cómodos salarios e incluso vender sus casas. La segunda línea de productos comercializados por la nueva empresa era el espectrómetro de RMN. Russell Varian estaba convencido de su gran valor, pero nadie en la empresa sabía demasiado bien para qué podría servir. Era el año 1953, y Varian hizo insertar anuncios del nuevo producto en revistas de química, como por ejemplo JACS, con el título "NMR at work". Es interesante reseñar que en 1955 Varian ya había vendido tres espectrómetros RMN de alta resolución, a 40 MHz para protón, precisamente a tres empresas del ramo de la química (Humble Oil, Texas; DuPont, Delaware; y Shell Development, California). Investigadores de la talla de M.E. Packard, J.N. Shoolery o H.E. Weaver, aparte de sus funciones como directivos de Varian Associates, proporcionaban nuevas aplicaciones en un número creciente de campos de la química, entre los que no tardó en aparecer la química orgánica. En contraste con el casi medio siglo transcurrido desde el descubrimiento de la espectroscopía infrarroja (1900) hasta la introducción del primer espectrómetro IR comercial (1946), la rapidez del desarrollo de la RMN es muy chocante. Sin duda, uno de los motivos es el clima de base tecnológica y la aceptación de innovaciones que había en aquellos años postbélicos. Pero también tuvo gran importancia la fuerte interacción entre una industria electrónica de gran base tecnológica (Varian) y el grupo puntero de investigadores de la RMN comandado por Bloch en la Universidad de Stanford. Aquellos primeros espectrómetros RMN a 40 MHz para protón eran aparatos muy primitivos. Era preciso registrar el espectro protónico entre 0 y 10 ppm durante unos 5-10 minutos, pero no era posible efectuar registros más lentos a causa de la deriva aleatoria del campo magnético, que podia llegar a ser dominante incluso bajo el control de los denominados superestabilizadores de campo. Especialmente crítico era el proceso de ajuste de la homogeneidad del campo magnético (field shimming), que era preciso efectuar para cada muestra al objeto de obtener la máxima resolución. Entre unas cosa y otras, la obtención de

espectros RMN era una tarea larga y delicada, reservada a buenos especialistas instrumentales. Pero la recompensa por la obtención de buenos espectros era muy importante. Los químicos orgánicos pronto comprobaron que la espectroscopía RMN era la técnica ideal para la elucidación o comprobación estructural de moléculas de peso molecular moderado. Casi todos los compuestos de la poyata daban nuevos e interesantes datos espectrales de utilidad general. En 1958 apareció el clásico artículo de Shoolery y Rogers sobre el estudio de esteroides por RMN, en el que se demostraba que incluso a 40 MHz los desplazamientos químicos de los metilos angulares eran de gran valor diagnóstico. También en aquellos años se publicaron numerosos datos de biomoléculas, tales como alcaloides, azúcares, porfirinas y otros compuestos. Pronto Karplus demostró que las constantes de acoplamiento vicinales a tres enlaces se podían correlacionar con los ángulos de torsión, y esto dió origen a numerosos estudios conformacionales, especialmente en el campo de los azúcares. Hacia finales de la década, en 1959, aparecieron el clásico libro de Jackman, en el que se correlacionaban los datos de RMN con la estructura molecular, y el pequeño opúsculo de Roberts, en el que se efectuaba una breve introducción de los principios teóricos básicos con argumentos sencillos, al alcance de los químicos orgánicos. Aparecieron en el mercado instrumentos comerciales de imán permanente, a 60 MHz para protón, con mucha más estabilidad y resolución que los primeros aparatos comerciales, y con los cuales los espectros eran mucho más reproducibles. En 1961-1962 se instalaron en España los dos primeros espectrómetros RMN. El primero de ellos se instaló en Madrid, bajo la supervisión del Prof. Manuel Rico, de cuyo magisterio nos hemos venido beneficiando todos cuantos nos hemos dedicado a la RMN en España. El segundo se instaló muy poco después en Barcelona, bajo la supervisión del Prof. Josep Castells, introductor de la RMN en Catalunya y que fué mi director de tesis. Recuerdo bien que durante mi tesis utilicé intensivamente este segundo instrumento, un Perkin-Elmer R-10, a 60 MHz, que requería un mínimo de 60-100 mg de muestra sólida, disuelta en CCl4, para compuestos de peso molecular inferior a 300, a menos que la muestra fuera líquida, en cuyo caso se usaba el líquido puro para maximizar las señales. O tempora, o mores!

Técnicas de pulsos y transformación de Fourier: la adolescencia de la RMN La estabilidad y la fiabilidad de la electrónica fueron mejorando la calidad de los espectrómetros RMN durante toda la década 1955-1965. Especialmente importante fué el establecimiento de campos estables (con electroimán) de 23.5 kG, que permitieron medir protón a 100 MHz empleando cantidades de muestra inferiores a los 100 mg. La tecnología de los imanes superconductivos, refrigerados por helio líquido, hizo posible finalmente la construcción de imanes permanentes de solenoide superconductor con campos estables mucho más elevados (primeros espectrómetros de protón a 220 MHz, Varian HR-220, en 1966). Con estos espectrómetros de campo alto fué posible culminar (el Prof. Manuel Rico, en Madrid, ya había iniciado sus trabajos con la ribonucleasa ¡a 90 MHz!) el estudio de biopolímeros tales como polipéptidos, proteínas, etc. Pero todavía era preciso obtener todos los espectros mediante el lento barrido de campo (o de frecuencia) característico del método de la onda continua. De todos modos, la gran dispersión de frecuencias protónicas alcanzable con imanes superconductores permitió la aparición, en 1967, de un primer estudio detallado de proteínas por RMN. En 1966 llegó también la primera gran revolución metodológica instrumental de la RMN, veinte años después de su descubrimiento, por parte de uno de sus primeros

investigadores (Weston A. Anderson) y de un joven suizo (Richard R. Ernst) todavía poco conocido, que por aquel entonces trabajaba en Varian, Palo Alto. Se trata del método de pulsos y transformación de Fourier, hoy universalmente utilizado por todos los espectrómetros, que ya había sido investigado por Hahn en 1950. La gran ventaja de este método es que permite excitar simultáneamente, con un único pulso de radiofrecuencia de gran intensidad y de muy corta duración (típicamente inferior a 10 µs), todos los protones de la muestra, independientemente de su desplazamiento químico, sin necesidad de efectuar un barrido de frecuencia. La respuesta transitoria del sistema (FID) consiste en la aparición de una inducción nuclear, en forma de magnetización macroscópica transversa, que precesiona perpendicularmente al campo fijo del imán, mientras se va amortiguando por la acción de los mecanismos de relajación. Como en los experimentos de Bloch, esta inducción nuclear se puede medir gracias a la fuerza electromotriz que induce en la bobina del detector, y suele tener una duración del orden de un segundo. Además, se puede almacenar digitalmente en la memoria de un ordenador y, tan pronto como se anula, inmediatamente se puede volver a enviar un pulso a la muestra, sumándose coherentemente las sucesivas FIDs en la memoria del ordenador. Esto permite mejorar en dos o tres órdenes de magnitud la relación señal-ruido y ampliar así los ámbitos de aplicación de la RMN. La transformación de Fourier de esta FID, operación matemática que también realiza digitalmente el ordenador, proporciona un espectro con el mismo formato y la misma información que si se hubiera obtenido por onda continua, pero en mucho menos tiempo. Así, durante los diez minutos habitualmente necesarios para el registro de un único espectro por onda continua, el método de pulsos puede sumar un total de ca. 600 FIDs. Pero es que, además, la señal de cada una de estas FIDs es mucho más intensa que la de un espectro convencional de onda continua para la misma concentración de muestra. Hasta esta revolución, las aplicaciones prácticas de la RMN se habían limitado a los muy pocos isótopos de elevada abundancia natural y de spin 1/2, principalmente 1H, 19F, 31P y 195 Pt. Desgraciadamente, esto excluye núcleos tan abundantes e importantes como el carbono 12 ( C, 98.9%) o el oxígeno (16O, 99.8%), ya que carecen de spin (I = 0). Pero la aparición de este artículo de Ernst y Anderson abrió el campo de la RMN multinuclear, al posibilitar la suma coherente, en poco tiempo, de centenares o miles de FIDs correspondientes a núcleos de baja abundancia natural, hasta entonces sólo accesibles para moléculas isotópicamente enriquecidas. Entre los núcleos de mayor interés que la técnica de pulsos y transformación de Fourier puso al alcance, hay que mencionar en primer lugar al 13C (1.1% de abundancia natural), el 15N (0.37%), el 2H o deuterio (0.015%) y, en general, todos los elementos de la tabla periódica. Naturalmente, también permitió la obtención en poco tiempo de excelentes espectros de protón de compuestos de estructura complicada utilizando muestras de 1 mg o menos. Los primeros espectrómetros comerciales que incorporaron la nueva técnica fueron comercializados por la firma alemana Bruker, y estaban en el mercado hacia 1970. La combinación de imanes superconductivos de campo permanente cada vez más alto y el método de pulsos y transformación de Fourier, con su ya inseparable ordenador integrado, caracterizó el incremento constante de la sensibilidad de la RMN durante los primeros años setenta. También permitió convertir la RMN multinuclear en una herramienta práctica de investigación estructural. Así, los espectros de 13C a abundancia natural pronto se convirtieron en completamente rutinarios. Con grados de dificultad variables, también muchos núcleos metálicos fueron accesibles en la práctica por primera vez. Otra característica de los avances producidos durante los años setenta fué el diseño y la utilización de secuencias multipulso, con el objetivo de aumentar aún más la relación

señal/ruido (p.ej., mediante transferencia de polarización) o de singularizar el tipo de información espectral producida (p.ej., espectroscopía diferencial, determinación de NOEs, excitación selectiva, etc). Si para la obtención de un espectro convencional por onda continua se requiere simplemente un barrido de frecuencias, registrando la intensidad absorbida a cada frecuencia, con el método de pulsos basta excitar la muestra con un único pulso de corta duración, y acto seguido recoger y almacenar la FID que, por transformación de Fourier, proporcionará un espectro idéntico al anterior. Pero nada impide librar más de un pulso durante la excitación, como ya lo había efectuado Hahn al estudiar los ecos de spin. Así, variando el número de pulsos, su duración, su fase, los períodos entre ellos, los núcleos a los que excitan, su selectividad (duros o blandos), etc, se abrió paso una gran variedad de secuencias multipulso útiles para la obtención de informaciones estructurales específicas, hoy día ya totalmente rutinarias, y que se desarrollaron durante los años setenta. También en esos años se perfeccionaron los estudios de muestras sólidas mediante RMN de alta resolución, con la introducción de métodos de desacoplamiento de alta potencia y especialmente la rotación de ángulo mágico. Finalmente, también en los setenta, Lauterbur inició un ambicioso programa de localización espacial de señales RMN, que él denominó zeugmatografía, que acabaría siendo la base de la actual técnica de obtención de imágenes médicas por RMN.

RMN multidimensional: la primera juventud de la RMN Vemos, pues, que desde el descubrimiento (1946) de la RMN hasta la primera revolución metodológica (pulsos y transformación de Fourier, 1966) habían transcurrido veinte años. La segunda gran revolución metodológica, la RMN bidimensional (2D NMR) tardó mucho menos en llegar: conceptualmente fué formulada como posibilidad teórica por J. Jeener, en uno de los unpublished papers más citados del mundo, durante el congreso Ampère celebrado en 1971 en Basko Polje, en un país todavía llamado Yugoslavia. Cinco años más tarde, el equipo de Ernst, ya definitivamente instalado en la ETH de Zürich, había completado la teoría de la 2D NMR, había incorporado a los espectrómetros las modificaciones necesarias y había aplicado los métodos experimentales bidimensionales, con ejemplos concretos y aplicaciones prácticas, todo ello publicado entre 1973 y 1976. Con la llegada de la segunda dimensión, nuevamente la RMN revelaba la existencia de un nuevo territorio inexplorado para investigar: correlaciones homo- y heteronucleares, espectroscopía J, procesos de intercambio químico o topológico, transferencias de polarización, secuencias multipulso, excitaciones selectivas y un largo etcétera. Significativamente, uno de los nuevos campos ahora abiertos, gracias a la gran simplicidad de los espectros bidimensionales, fué el estudio de transiciones prohibidas, en particular las bicuánticas. En palabras del propio Ernst: "Chemists will find great excitement in the forbidden fruits of spectroscopy". El principio en que se basa la RMN bidimensional es sobradamente conocido por esta audiencia, y es conceptualmente muy sencillo. En RMN monodimensional se excita el sistema de spins y se mide la magnetización o señal S en función de la variable tiempo. Se obtiene así la función temporal S(t), o FID, que se debe monitorizar a intervalos constantes, y cuya transformación de Fourier proporciona el espectro F(ν), en función de la frecuencia. Pero si se somete el sistema de spins a dos perturbaciones, separadas en el tiempo por un periodo incrementable t1, tras medir la magnetización a lo largo del tiempo (que ahora se denomina t2) se obtiene una señal S(t1,t2) que es función de ambas variables temporales. Por

doble transformación de Fourier se obtiene un espectro bidimensional, F(ν1,ν2), en el cual la intensidad de la señal será función simultáneamente de dos variables frecuencia. Cada una de estas dos variables frecuencia está relacionada con el comportamiento del sistema durante el correspondiente tiempo (ν1 con el tiempo t1, ν2 con el tiempo t2), así como con la naturaleza de las dos perturbaciones introducidas. Surgen de este modo espectros de correlación, tanto homonucleares (COSY) como heteronucleares (HETCOR, HMQC, HSQC, HMBC), pero también espectros J-resueltos, de doble cuanto, de intercambio (EXSY) o de relajación (NOESY, HOESY), y un largo etcétera. Todos ellos constituyen poderosos métodos que ayudan a la asignación estructural o a la investigación de procesos de escala de tiempo adecuada. Desde la introducción de estas técnicas bidimensionales el concepto se ha extendido a tres y hasta cuatro dimensiones. Con la ayuda del marcaje isotópico (13C y 15N, principalmente) y por medio del uso de técnicas de ingeniería genética (DNA recombinante) se puede disponer de proteínas cómodamente biosintetizadas a partir de aminoácidos doblemente marcados con ambos isótopos. Los resultados son totalmente espectaculares, especialmente gracias a la aceleración en la obtención de los resultados posibilitada por la selección de coherencias por medio de gradientes. La RMN da hoy una información tan precisa y fiable como la difracción de rayos X para proteínas de peso molecular inferior a 50000, con la ventaja de que, al trabajar en solución, puede suministrar también información sobre procesos dinámicos, de gran interés para entender la función biológica de estas macromoléculas. Las mejoras instrumentales, aparecidas desde que en 1975 se inició la práctica generalizada de la RMN bidimensional, han facilitado en gran medida la aplicación de estos métodos. Veamos algunos ejemplos. El campo magnético estable y homogéneo de los imanes superconductivos disponibles comercialmente ha ido aumentando desde los 5.17 T del viejo Varian HR-220, de 1966, hasta los 21.1 T (900 MHz para protón) de los espectrómetros comerciales actuales de mayor campo. De hecho se habla ya de la espectroscopía de GHz, sin duda reservada para las aplicaciones (todavía lejanas, lamentablemente) de los nuevos materiales superconductores de alta temperatura. En cualquier caso, a mayor campo magnético se tiene mayor sensibilidad, mayor dispersión y la posibilidad de extender las aplicaciones a casos más difíciles. El coste de estos futuros espectrómetros de GHz, sin embargo, deberá resultar astronómico. El desarrollo de la informática ha permitido la incorporación a los espectrómetros RMN de ordenadores de gran capacidad y velocidad. Además, el software se ha diseñado pensando en facilitar al usuario no especialista un control fácil sobre las variables instrumentales. Por otra parte, las redes informáticas permiten el procesamiento off-line de los espectros en cualquier ordenador personal o estación de trabajo. Los avances en electrónica aplicada han permitido disponer de espectrómetros multicanal, con los cuales se pueden perturbar simultáneamente diversos isótopos, usando excitaciones de radiofrecuencia precisables desde unos pocos mHz a varios kHz de amplitud de excitación, con un control de fases de excitación, desacoplamiento y detección mejor que medio grado sexagesimal.

Los hoy ya rutinarios métodos de detección inversa y de selección de coherencias por medio de gradientes pulsantes de campo magnético han facilitado el diseño y la realización de todo tipo de experimentos estructurales y dinámicos, en una o varias dimensiones, para dilucidar cualquier detalle de moléculas orgánicas, inorgánicas o bioquímicas. Por otra parte, la RMN en estado sólido ha experimentado grandes progresos con el desarrollo de métodos que van más allá de la rotación de ángulo mágico, tales como los métodos de doble rotación puestos a punto por Pines. De este modo se han podido abordar por RMN los materiales sólidos, cerámicos, poliméricos, etc. Pero, sin duda, es en las biociencias donde la moderna RMN tiene un futuro más prometedor. Aparte de las ya clásicas determinaciones estructurales y dinámicas de biopolímeros (como las proteínas), que todavía hoy constituyen un reto importante en el caso de oligonucleótidos de varias docenas de pares de bases, la RMN se ha usado ya con éxito en estudios de metabolismo, tanto in vitro como in vivo, gracias a su carácter de técnica no invasiva. Hace ya treinta años de la observación de señales de RMN de 31P correspondientes a diversos metabolitos fosforilados de gran importancia, como ATP, ADP, fosfocreatina, etc. También son ya clásicos los estudios de pH intracelular monitorizados por medio del desplazamiento químico de ciertas señales. Se han desarrollado métodos de perfusión para el estudio de órganos en fluidos nutrientes apropiados, antenas para el estudio de elementos de volumen cercanos a la piel en seres vivos, pulsos de profundidad predeterminada para el estudio de zonas más internas, etc. Finalmente, la RMN médica, en la cual se mide casi siempre la señal del agua, es hoy una técnica rutinaria en los hospitales para fines diagnósticos. También es muy activo el campo de la espectroscopía localizada in vivo. Medio en broma, Bloch decía que el primer experimento de RMN in vivo lo había efectuado él mismo, en 1946, poniendo su dedo en la sonda de su espectrómetro RMN, con lo que observó una señal de agua. Y entre los químicos orgánicos veteranos es muy conocido un artículo de J. Org. Chem., de los años sesenta, en que se describe el espectro de RMN de un ratón entero y vivo. Hoy, las aplicaciones de la RMN a las biociencias son de alcance cada vez mayor, pero también lo son en ciencia de materiales, en geología (magnetómetros, sondas RMN para los pozos de petróleo), en la industria alimentaria (que usa la RMN protónica para medir el contenido en agua) e incluso en estudios agrícolas, en los que se puede usar la RMN como técnica no invasiva para determinar el contenido de semillas y plántulas.

Conclusión: ¿se acerca la RMN a la madurez? No es muy frecuente que una técnica instrumental siga siendo objeto de tanta investigación fundamental a los sesenta años de su nacimiento. En el caso de la RMN, tras su infancia claramente marcada por la física, con Premios Nobel a Rabi (1944) y a Purcell y Bloch (1952), su adolescencia y juventud han estado claramente ligadas a la química, con Premios Nobel a Ernst (1991) y a Wüthrich (2002). Dicen que la juventud es el período más feliz de la vida. Si en su futura madurez la RMN cae finalmente en manos de los médicos, que sin duda le amputarán su segundo adjetivo, siempre recordará con añoranza los agradables períodos en que se mantuvo unida a la química.