CONCEPTOS DE RELAJACIÓN EN RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR Miquel Pons Laboratori de RMN de Biomolècules. Institut de Recerca Biomèdica (PCB) y Departament de Química Orgànica. Universitat de Barcelona [email protected]

Un sistema en equilibrio es invisible por RMN. Cualquier experimento de RMN requiere una perturbación que desencadena un proceso dinámico, de cuya observación obtenemos la información deseada. Este proceso dinámico tiene dos componentes: i) oscilaciones periódicas, que pueden caracterizarse por su frecuencia y se corresponden con parámetros espectrales como el desplazamiento químico o las constantes de acoplamiento y ii) procesos disipativos que determinan el retorno del sistema al equilibrio de forma aproximadamente exponencial. Estos procesos se denominan genéricamente “relajación”. Desde el punto de vista operativo, la velocidad de relajación determina el tiempo que tenemos que esperar para que dos medidas consecutivas realizadas sobre el mismo sistema sean realmente idénticas o la intensidad y la velocidad de repetición máximas de los pulsos que no cause saturación. Ambos aspectos tienen una incidencia evidente sobre la sensibilidad de la RMN ya que determinan la utilización óptima del tiempo disponible para acumular espectros. También desde el punto de vista operativo, el tiempo que el sistema tarda en volver al equilibrio proporciona la ventana durante la cual podemos medir los otros parámetros espectrales: para poder distinguir entre dos señales de frecuencias muy parecidas, deberemos observarlas durante un tiempo comparable con el inverso de la diferencia entre estas frecuencias y esto solamente será posible si el sistema no ha llegado al equilibrio antes de terminar nuestra observación. La relajación determina la precisión con la que podemos medir una frecuencia y determina la máxima resolución que puede lograrse. Algunos experimentos de RMN de uso común, basados en la relajación, no miden explícitamente velocidades sino intensidades en estado estacionario, por lo que su origen puede no ser evidente para el usuario poco atento. Es el caso de algunos experimentos basados en el efecto NOE o de transferencia de saturación (por ejemplo los experimentos STD utilizados para el cribado de colecciones de moléculas en diseño de fármacos). Sólo la

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comprensión de su origen permite optimizar dichos experimentos e interpretarlos de forma segura. La comprensión de los efectos de relajación sobre los experimentos de RMN ha permitido diseñar estrategias que minimicen sus efectos adversos (deuteración exhaustiva, TROSY) y es responsable de los avances espectaculares que se han producido en los últimos años en el tamaño de las moléculas que pueden ser estudiadas por RMN. La relajación es inherente a cualquier técnica espectroscópica. En el caso de la RMN, sin embargo, los procesos de relajación son especialmente ineficientes y, paradójicamente, este es el origen de su importancia práctica. La ineficiencia de la relajación en RMN es debida a la inoperancia de la relajación “espontánea” y a que unas pocas interacciones, en principio identificables, son las únicas responsables del retorno al equilibrio. Esto permite hablar de mecanismos de relajación y relacionarlos con aspectos estructurales (distancias, ángulos, distribuciones electrónicas…) y dinámicos. De esta forma, las velocidades de relajación pasan a ser también parámetros espectrales informativos e introducen una coordenada temporal en la imagen que obtenemos de las moléculas estudiadas por RMN. La combinación de la resolución atómica con información dinámica es la característica que singulariza la RMN respecto a otras metodologías para el estudio de estructuras. 1. Descripciones de la relajación 1.1.

Bloch

El retorno al equilibrio de la magnetización macroscópica tras una perturbación fue descrito por Felix Bloch en 1946 mediante una ecuación fenomenológica (es decir que describe el fenómeno pero no proporciona una justificación de su origen):

[

]

dM 1 1 = γ ( M × H) − M z − M zeq ⋅ k − [M x ⋅ i + M y ⋅ j] dt T1 T2

Esta ecuación contiene los dos tipos de procesos mencionados en la introducción: el primer término da lugar a un movimiento de precesión cuya frecuencia se va a medir y el segundo y tercer término tienen la forma de una ecuación cinética de primer orden que describe el retorno al equilibrio de las distintas componentes de la magnetización. Debe recordarse que el valor de equilibrio de las componentes transversales es cero. Los tiempos de relajación dependen del sistema y toman valores que típicamente oscilan entre 0.1 y 10 segundos para moléculas que proporcionan espectros fácilmente estudiables en disolución. Estos valores tan elevados cuantifican la ineficiencia de la relajación antes mencionada. Un aspecto remarcable de esta ecuación es la existencia de dos términos independientes, con constantes de tiempo potencialmente distintas, para describir el retorno al equilibrio de las componentes longitudinal y transversal de la magnetización. Sin embargo, y pensando en los términos actuales de RMN de pulsos, la perturbación inicial, que inicia el proceso de retorno al equilibrio, es una rotación que da lugar a una interconversión concertada entre estos componentes.

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1.2. Bloembergen, Purcell, Pound Los primeros intentos de explicar microscópicamente el fenómeno de la relajación no se hicieron esperar y en 1948 Bloembergen, Purcell y Pound relacionaron las velocidades de relajación con las probabilidades de transición entre los niveles de energía de los espines nucleares. De hecho, la probabilidad de que estas transiciones ocurran espontáneamente es inversamente proporcional a la diferencia de energía entre los niveles y, en el caso de la RMN que involucra mínimas diferencias de energía, puede considerarse despreciable. Sin embargo, las transiciones que dan lugar a la relajación pueden ser causadas por interacciones con campos externos que presenten fluctuaciones aleatorias. La teoría de las probabilidades de transición captura dos aspectos esenciales de la relajación en RMN: el requerimiento de una interacción entre los espines y su entorno y la identificación de las fluctuaciones de este entorno como las responsables de la relajación. La velocidad de relajación de un núcleo en RMN constituye una sonda para conocer las fluctuaciones de dicho entorno, que definen la dinámica del sistema molecular en el que reside el núcleo observado. Estas fluctuaciones contienen movimientos globales (rotación y traslación respecto a una referencia fija en el laboratorio) y locales (por ejemplo cambios conformacionales). Un resultado fundamental de la teoría de las probabilidades de transición es que solamente las fluctuaciones con frecuencias comparables a las diferencias entre los niveles de energía de los estados de espín (divididas por la constante de Plank) pueden inducir transiciones y, por tanto, causar relajación. Las diferencias entre niveles de energía de los estados de espín determinan, pues, las “ventanas” de frecuencias para las fluctuaciones que pueden ser detectadas mediante medidas de relajación. La teoría de las probabilidades de transición es básicamente adecuada para describir la evolución de las poblaciones de los diferentes niveles de energía y su retorno al equilibrio. Esto corresponde a la relajación longitudinal o espín-red, caracterizada por la constante de tiempo T1 pero no tiene en cuenta la coherencia de fase entre los distintos estados y por tanto no explica la relajación transversal, caracterizada por T2. 1.3. Bloch, Wangsness, Redfield La teoría de la que derivan las expresiones utilizadas actualmente para la descripción de la relajación en líquidos es debida a Bloch, Wangness y Redfield y se conoce con las siglas de sus nombres (BWR). Esta teoría utiliza el formalismo de la matriz de densidad y incluye por tanto expresiones para la relajación de cualquier tipo de coherencia, además de las poblaciones. Las expresiones, deducidas y explicadas en numerosos libros y artículos de revisión describen la evolución temporal de la matriz de densidad causada por la parte del Hamiltoniano que fluctúa con el tiempo entorno a un valor promedio nulo. ? = H 0 + H1 ( t ) Las fluctuaciones se suponen rápidas, caracterizadas por tiempos de correlación cortos, y que causan una evolución lenta de la matriz de densidad. Estas suposiciones limitan

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la validez estricta de las ecuaciones a tiempos de evolución relativamente cortos. Sin embargo, en las aplicaciones prácticas en las que la relajación se mide durante tiempos más largos, las expresiones todavía pueden ser utilizadas simplemente dividiendo el tiempo total en una sucesión de pequeños intervalos dentro de los cuales las ecuaciones se cumplen. Esta restricción se describe a veces diciendo que se trata de ecuaciones “de grano grueso”. La ecuación básica que resulta de la aproximación BWR tiene la forma siguiente ∧ ds (t) = −i[H 0 , s (t) ] − G(s (t) − s 0 ) dt

que mantiene la división en dos términos, el primero de ellos conservativo y el segundo disipativo, proporcional a la separación del equilibrio del operador de densidad en cada instante. La relajación viene marcada por un “superoperador” de relajación. Los superoperadores actúan sobre operadores de forma análoga a como los operadores actúan sobre funciones. La forma de este superoperador contiene la “maquinaria esencial” de la teoría BWR y, en particular, el doble conmutador proviene de la expansión de segundo orden que caracteriza esta aproximación. A pesar de su evidente complejidad, la expresión puede “leerse” de forma instructiva sin entrar en los detalles de cada uno de sus términos. ∧

G=

2

1 2

∑∑ J

q = −2 p

q

[

[

(ω pq ) Ap−q , Apq , _

]]

La primera constatación es que se trata de una suma de términos en el que pueden aparecer contribuciones de núcleos distinguibles, designados por el subíndice p. Para cada uno de ellos aparecen cinco términos correspondientes a los valores de q= -2, -1, 0, 1, 2. Estos cinco valores corresponden a la descomposición “irreducible” de los tensores de rengo dos que describen las interacciones responsables de la relajación. Los químicos estamos familiarizados con este tipo de descomposiciones, aunque la nomenclatura que utilizamos es distinta. Para describir la distribución espacial de los electrones utilizamos unas funciones que llamamos orbitales y las agrupamos en series: s, p, d, … Existe un orbital s, 3 orbitales p, 5 orbitales d… debido a que los objetos matemáticos que utilizamos en los distintos casos para “repartir” el espacio (los armónicos esféricos) corresponden a tensores de rango 0 (escalar o con simetría esférica), de rango 1 (vector con tres componentes: x, y, z) o de rango 2 (tensor de rango 2, con 5 “componentes” que corresponden a los orbitales dxy, dyz, dxz, dz2, d(x2-y2). Las interacciones importantes para describir la relajación de núcleos no cuadrupolares están descritas por tensores de segundo rango. Un componente esencial apara comprender y aplicar la descripción de BWR de la relajación es la separación de las interacciones fluctuantes que la originan en el producto de dos términos (que en la ecuación anterior aparecen desglosados en sus cinco componentes irreducibles) H 1 (t ) = ∑ A p Fp (t ) p

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El primero de ellos, A p , depende solamente de variables de espín y en su expresión explícita podríamos reconocer los operadores Iz, I±, etc. El segundo, Fp (t), depende del tiempo y captura la dependencia temporal de las funciones espaciales, por ejemplo la orientación del vector que une al núcleo considerado con otro vecino o la orientación respecto al campo magnético externo de la nube electrónica asimétrica responsable del apantallamiento químico. Los términos Ap singularizan un pequeño número de frecuencias discretas y características, derivadas de los niveles de energía asociados al espín considerado. Para un sistema de dos espines, I y S, son relevantes, como mínimo, las frecuencias de Larmor de cada uno de los núcleos y sus combinaciones: 0, ωS, ωI-ωS, ωI, ωI + ωS. Estas son las ventanas de frecuencia en las que las fluctuaciones, descritas mediante las funciones Fp (t), son efectivas para dar lugar a la relajación. Para conocer las contribuciones a distintas frecuencias contenidas en una función que varia con el tiempo como es Fp (t), la herramienta necesaria es la misma que utilizamos para extraer las contribuciones de distintas frecuencias (“el espectro”) a partir de una función que fluctúa con el tiempo (el FID): la transformación de Fourier. El análisis de frecuencias de la fluctuación descrita por Fp (t) da lugar a las funciones de densidad espectral J q (ω pq ) de la que solamente nos interesan los valores que toma a las frecuencias características singularizadas por los términos Ap. 1.4. Relajación de operadores producto Como se ha indicado en otra lección de este curso (J.C. Paniagua), el operador de densidad puede expresarse como una combinación lineal de otros operadores que proporcionan una descripción más cercana a las observaciones experimentales. Estos son los operadores producto (Ix, 2IxSz…) o los operadores escalera -“shift operators”- (I+, I- ). Si denominamos de forma genérica como Bi a los operadores de base, podemos escribir s (t ) = ∑ bi (t ) ⋅ B i i

En general, estamos interesados en la relajación de cada uno de los términos de esta expansión. Es decir, la velocidad de cambio de los coeficientes bi(t) hasta alcanzar su valor de equilibrio, que es cero para todos ellos excepto para Iz. Ya sabemos, de la descripción fenomenológica de Bloch, que los términos “longitudinales” y “transversales” pueden relajar a velocidades distintas. En general, cada uno de los operadores que describen poblaciones o coherencias tendrán su tiempo de relajación característico. Por otro lado, no debe resultar sorprendente que haya que plantearse, en general, la presencia de términos cruzados. La ecuación “master” para la evolución de los coeficientes de los operadores de base es: dbi (t ) = ∑ ( −iΩ i , j ⋅ b j (t )) − ∑ Γij (b j (t ) − b j 0 ) dt j j

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El primer término refleja la interconversión “conservativa” entre los distintos operadores que tiene lugar en un sistema sacado del equilibrio: por ejemplo la precesión que convierte Ix en Iy o el acoplamiento escalar que interconvierte coherencias en fase y en antifase Ix -> 2IySz. Estas interconversiones tienen lugar con frecuencias características relacionadas con el desplazamiento químico o las constantes de acoplamiento, respectivamente. El segundo término contiene las velocidades de autorelajación (Γii) asociada al operador Bi y relajación cruzada (Γij) entre los operadores Bi y Bj. Los mecanismos de relajación permiten únicamente un cierto tipo de relajaciones cruzadas. No es posible observar relajación cruzada entre coherencias de distinto orden. Así, por ejemplo, no se observa relajación cruzada entre coherencias de cero y doble cuanto o entre poblaciones y coherencias en fase o antifase. Es posible, sin embargo, observar velocidades de relajación cruzada entre poblaciones (Iz -> Sz). Esta relajación cruzada es la responsable del efecto NOE. Los operadores con términos transversales (es decir que evolucionan con el desplazamiento químico) no presentan, en principio, relajación cruzada con operadores asociados a frecuencias distintas (que difieran en frecuencia más que la anchura de línea). Esta restricción puede desaparecer en algunos casos en presencia de campos de radiofrecuencia. En los experimentos de confinamiento o bloqueo de espines, la relajación entre coherencias Ix, Iy de distintos espines da lugar a relajación cruzada en el sistema de coordenadas giratorio. Es el llamado efecto ROE. La aurorelajación de la magnetización confinada en el plano transversal del sistema de coordenadas giratorio tiene una constante de tiempo denominada T1ρ. Esta contiene contribuciones variables de la relajación longitudinal y transversal en el sistema de coordenadas del laboratorio. El peso relativo de las dos contribuciones depende del “offset” (la diferencia entre la frecuencia de precesión del núcleo considerado y de la radiofrecuencia utilizada para confinarlo). Si esta diferencia es nula T1ρ = T2. En las expresiones de T1ρ aparece, además de las frecuencias propias de los espines en el sistema del laboratorio, la frecuencia ω1 = γ B1 que depende de la intensidad de la radiofrecuencia utilizada para confinar los espines y puede modificarse bajo control del experimentador. Esto introduce una nueva ventana de frecuencias de gran utilidad para estudiar fenómenos dinámicos en la escala de los micro- milisegundos. 2. Mecanismos de relajación 2.1. Los mecanismos básicos Las interacciones que dan lugar a campos magnéticos fluctuantes o, en general, hacen variar con el tiempo la energía asociada con los espines de forma que permiten el regreso del sistema al equilibrio después de una perturbación se denominan mecanismos de relajación. Los mecanismos de relajación pueden causar dos tipos de efectos: i) transiciones entre estados de espín que implican transferencia de energía entre el sistema de espines y su entorno (“la red”) y ii) modificaciones de las diferencias de energía entre los estados, que afectan a las frecuencias de precesión pero no implican cambios en las poblaciones y por tanto no suponen una transferencia neta de energía entre el sistema de espines y su entorno. Estas contribuciones de denominan adiabáticas.

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Si imaginamos un campo magnético fluctuante arbitrario en la posición del núcleo de interés, las fluctuaciones perpendiculares al campo magnético externo son las responsables de las transiciones entre estados, mientras que las fluctuaciones paralelas a dicho campo son las que proporcionan la contribución adiabática. Las contribuciones adiabáticas dan lugar a la pérdida de coherencia dentro de un conjunto de espines y conduce a la relajación transversal pero no contribuye a restituir la distribución de Boltzmann. La pérdida de coherencia entre los espines también puede ser causada por transiciones esporádicas entre estados. Así como un pulso de radiofrecuencia sobre una muestra en equilibrio “sincroniza” el inicio de la precesión de todos los espines afectados, las transiciones esporádicas causadas por relajación “interrumpen” la precesión de forma aleatoria para los distintos espines de la muestra y dan lugar a la pérdida de coherencia de fase. En general, tendremos siempre que la velocidad de relajación transversal será siempre mayor que la de la relajación longitudinal. El origen de las interacciones fluctuantes puede encontrarse en el movimiento global de la molécula en la que se encuentre un determinado espín o en cambios en su entorno local causados por movimientos internos. Desde una perspectiva química, tienen un interés especial los movimientos de gran amplitud y baja frecuencia que cambian la conformación o la naturaleza de la especie química implicada (por ejemplo debido a una reacción reversible o a un fenómeno de complejación). Estas fluctuaciones, agrupadas bajo el término genérico de intercambio químico, tienen poco efecto sobre la relajación longitudinal pero afectan de forma importante la relajación transversal. El estudio del intercambio químico es un campo de aplicación muy importante de las medidas de relajación. Las pequeñas diferencias de energía asociadas a las interacciones de los espines nucleares, comparadas con las energías asociadas al proceso químico, permiten la medida de velocidades de reacción en sistemas que están químicamente en equilibrio. Para sistemas rígidos, las fluctuaciones que dan lugar a relajación provienen esencialmente de la reorientación de la molécula respecto al campo magnético externo. Contribuirán a la relajación aquellas interacciones que posean una dependencia angular. Para núcleos con espín ½ los mecanismos de relajación más importantes son la interacción dipolodipolo y la anisotropía de apantallamiento químico. Las interacciones dipolo-dipolo describen el efecto del campo magnético inducido por el momento magnético de un espín S, de magnitud proporcional a γ, su constante giromagnética, sobre la posición de otro espín I. Este campo es inversamente proporcional al cubo de la distancia y depende de la orientación del vector internuclear respecto al campo magnético externo. En un sistema rígido, en el que I y S pertenecen a la misma molécula y por tanto permanecen a una distancia constante, las fluctuaciones de la interacción dipolar tienen su origen en la reorientación de la molécula. El valor medio de la fluctuación es cero. La amplitud de la fluctuación se caracteriza por su varianza y depende del cuadrado de la interacción dipolar. Esto introduce la conocida dependencia con el inverso de la sexta potencia de la distancia que se utiliza de forma muy extendida para interpretar las medidas de efecto NOE que no son más que medidas de la relajación cruzada inducida por la interacción dipolar. La anisotropía de apantallamiento químico es el resultado de una distribución electrónica asimétrica alrededor del núcleo considerado. Esta distribución es fija respecto a la

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molécula (supuesta rígida) y da lugar a un apantallamiento químico que depende de la orientación de la molécula respecto al campo magnético externo. Cuando la orientación de la molécula cambia, también lo hace el campo magnético experimentado por el espín y por tanto, su frecuencia de precesión. El apantallamiento químico está descrito por un tensor y el campo magnético causado por la circulación electrónica inducida en presencia del campo externo puede tener componentes en todas las direcciones. Así la anisotropía de apantallamiento químico es un mecanismo tanto para la relajación longitudinal como transversal. A diferencia de la interacción dipolo-dipolo, la anisotropía de apantallamiento químico presenta una dependencia cuadrática con el campo magnético externo. Para núcleos con espín > ½ las interacciones cuadrupolares habitualmente dominan la relajación. El momento cuadrupolar de un núcleo es una medida de la distorsión de la carga eléctrica nuclear de la simetría esférica. Los núcleos con espín ½ no poseen momento cuadrupolar. Los núcleos cuadrupolares interaccionan con gradientes de carga eléctrica. Esta interacción es muy importante y modifica los niveles de energía de los estados de espín. La modulación de esta interacción proporciona un mecanismo de relajación muy efectivo que da lugar en general a señales anchas para los núcleos cuadrupolares que no se encuentren en un entorno altamente simétrico. 2.2. Interferencia entre mecanismos de relajación En general las fluctuaciones que afectan a las distintas interacciones que pueden causar relajación son independientes entre sí y el efecto de la relajación cuando varios mecanismos intervienen simultáneamente es simplemente una suma de efectos. Sin embargo, las fluctuaciones aleatorias de distintas interacciones están correlacionadas. En un sistema de dos espines I y S pertenecientes a núcleos que están directamente enlazados, la distribución electrónica asociada al enlace entre ambos núcleos estará directamente relacionada con la orientación del vector internuclear. La reorientación de la molécula causará en este caso la modulación simultánea de las interacciones dipolo-dipolo y de anisotropía de apantallamiento químico. En estos casos ambos mecanismos pueden interferir y hablaremos de la existencia de correlación cruzada (no confundir con la relajación cruzada) o de interferencia de relajación. La correlación cruzada da lugar a fenómenos de relajación cruzada “prohibidos” por cualquiera de los mecanismos individuales. Así, puede observarse relajación cruzada entre poblaciones (Iz) y orden de dos espines (2IzSz) o entre coherencias en fase (Ix, Iy) y antifase (2IxSz, 2IySz). El segundo de estos efectos, denominado interferencia o correlación cruzada transversal introduce un término adicional en la relajación transversal que puede afectar de forma notable la anchura de las señales observadas. Sus efectos son especialmente aparentes en presencia de acoplamiento ya que la anchura de las distintas señales de un multiplete no son iguales. Si consideramos el doblete esperado para un núcleo I acoplado con otro núcleo S, podemos ver fácilmente que la combinación (suma o resta) de los términos en fase y en antifase nos describe de forma separada las dos señales a frecuencias ±J/2.

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EN FASE

SUMA

ANTIFASE

DIFERENCIA

Si analizamos la relajación de las dos señales encontraremos que viene descrita por la suma y la diferencia de términos de relajación debidos a los mecanismos individuales y debidos a interferencia entre los mismos:

d I + + 2I + S z ≈ −(iπJ + R2 medio + η xy ) I + + 2I + S z dt d I + − 2I + S z ≈ −( −iπJ + R2 medio − η xy ) I + − 2I + S z dt Donde DD CSA R2 medio = 12 ( R2DD I + R2 IS ) + R2 I

es el promedio de los términos de relajación de las componentes en fase y antifase debidas a la interacción dipolar más la contribución de la relajación mediada por la anisotropía de apantallamiento químico y η xy es la constante de velocidad del proceso de relajación cruzada entre los términos en fase y antifase causada por la correlación cruzada entre los dos mecanismos de relajación. El distinto signo de R2medio y η xy en la segunda de las ecuaciones anteriores hace posible, en principio, minimizar los efectos de relajación transversal. Esto será más efectivo cuando los valores de R2medio y η xy tengan magnitudes comparables. Dada la dependencia de la relajación debida a anisotropía de apantallamiento químico con el campo magnético externo, la optimización de la cancelación de la relajación transversal debida a ambos mecanismos se obtendrá a campos magnéticos elevados para núcleos que tengan una anisotropía de apantallamiento suficientemente grande. La manifestación de este efecto solamente se observará sin embargo si se mantienen separadas las dos componentes del doblete, es decir, en ausencia de desacoplamiento. Esta es la base de la estrategia TROSY para el estudio de moléculas de gran tamaño. Es evidente que para la otra componente del doblete los efectos debidos a los mecanismos individuales y a la correlación cruzada se suman, por lo que la anchura espectral aumenta. En algunos casos, este aumento de anchura llega a hacer desaparecer la señal y solamente se observa la componente estrecha, sin necesidad de efectuar ningún otro tipo de selección.

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2.3. Mecanismos dominantes El conocimiento del mecanismo de relajación no es una cuestión trivial en general, sin embargo para ciertos casos uno o dos mecanismos dominan la relajación. Es el caso de la relajación de heteroàtomos unidos a un protón y razonablemente aislados del resto de espines de la molécula: en una proteína marcada con 15N, el nitrógeno de los grupos NH del enlace peptídico relaja de forma dominante a través de la interacción dipolar con el protón que tiene directamente unido. La relajación dipolar con otros protones de la molécula es generalmente descpreciable debido a la dependencia de este mecanismo con la distancia. Los otros núcleos unidos al nitrógeno son mayoritariamente de carbono 12 que tiene espín cero. La otra contribución a la relajación del nitrógeno es debida a la anisotropía de apantallamiento químico y aumenta con el campo magnético utilizado. El estudio de heteroátomos unidos a dos protones implica tener en cuenta la correlación cruzada entre la relajación dipolar con cada uno de ellos. En el caso de un grupo carbonilo marcado con 13C el mecanismo dominante de relajación es la anisotropia de apantallamiento, a pesar de que, en general, el carbono carbonílico estará unido a otro átomo de 13Co de 15N. La poca importancia de los mecanismos dipolares en este caso es debida a la baja constante giromagnética (γ) de estos núcleos, que determina el valor del momento magnético asociado con los mismos. Finalmente, en el caso de la relajación de núcleos cuadrupolares, este mecanismo va a ser el dominante. El marcaje con deuterio se utiliza a veces con este propósito, aunque a menudo se utiliza también en el contexto de medidas de relajación de otros núcleos para eliminar la contribución dipolar debida a los protones. La deuteración parcial se utiliza a veces como una estrategia para eliminar los efectos de correlación cruzada entre interacciones dipolares. En este caso, la medida se realiza sobre las especies NHD o CHD presentes en la mezcla de isotopómeros y requiere, a veces, la eliminación selectiva de las contribuciones de las otras formas (NH2 o CH2 u ND2 o CD2). Debe recordarse, en este punto, que la perdeuteración de macromoléculas se ha convertido en una estrategia habitual para reducir la anchura de las señales de RMN o limitar la difusión de espín (la transmisión en cadena de magnetización debida a relajación cruzada por interacción dipolar entre una serie de espines). 3. Descripción de la movilidad: las funciones de densidad espectral El interés real en las velocidades de relajación proviene de la información dinámica que proporcionan sobre el sistema molecular. En concreto, la información que puede derivarse directamente de las medidas experimentales, una vez identificado o supuesto un mecanismo de relajación, es el valor de la función de densidad espectral J(ω) a ciertas frecuencias singulares. A modo de ejemplo, las velocidad de relajación longitudinal y transversal de un espín X (=13C o 15N) , perteneciente a un sistema aislado HX y despreciando la correlación cruzada, son

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R1 =

d2 [J (ωH − ω X ) + 3J (ωH ) + 6 J (ωH + ω X )] + c 2 J (ω X ) 4

R2 =

2 d2 [4 J (0) + J (ωH − ω X ) + 3J (ωH ) + 6 J (ωH ) + 6 J (ωH + ω X )] + c [4 J (0) + 3J (ω X )] 8 6

σ =

d2 [− J (ωH − ω X ) + 6 J (ωH + ω X )] 4

donde µ 0 hγ X γ H − 3 ∆σω X rHX y c= donde el tensor de apantallamiento se supone 2 8π 3 axialmente simétrico y ∆σ es el valor de la anisotropía. d=

La más minimalista de las interpretaciones de las medidas de relajación consiste simplemente en obtener los valores accesibles de la función de densidad espectral a partir de los datos experimentales. Esta aproximación se denomina “Spectral density mapping” que tal vez podría traducirse por Muestreo de Densidad Espectral. Aunque cada una de las velocidades de relajación o relajación cruzada (R1, R2, σ) depende de los valores de densidad espectral a distintas frecuencias, dado que el número de frecuencias relevantes es discreto, es posible en general medir un número suficiente de parámetros de relajación. Para obtener los cinco valores de J(ω) se necesitan, además de las tres medidas antes citadas, dos medidas adicionales: estas son en la propuesta inicial de Peng y Wagner las velocidades de relajación de las coherencias en antifase y de orden de dos espines. Es muy difícil tener un sistema XH totalmente aislado ya que la relajación del protón con otros protones de la molécula en general no puede despreciarse debido a su alta constante giromagnética. Esto introduce la necesidad de corregir esta contribución mediante una medida adicional de la relajación de protón. A campos altos cuando X = N, J (ω H + ω X ) ˜ J (ω H ) ˜ J (ωH − ω X ) y los tres términos se substituyen por una valor J promedio (ω H ) . La función de densidad espectral se caracteriza entonces solamente por los tres valores J promedio (ωH ) , J (ω N ) y J (0) , por lo que se requiere la medida de tres velocidades de relajación. Esta aproximación se denomina Muestreo de Densidad Espectral Reducido. La función de densidad espectral describe la contribución de distintas frecuencias al movimiento aleatorio causante de la relajación. El proceso de reorientación puede describirse comparando el valor promedio del producto de dos funciones que dependen de la orientación, evaluadas en tiempos separados por un intervalo τ. Es la llamada función de correlación. Si la orientación cambia durante el tiempo τ, el producto podrá tomar valores positivos y negativos y el promedio tenderá a cero. La función de correlación decrecerá con el tiempo t de forma más rápida si la molécula se mueve rápidamente y disminuirá lentamente para moléculas que se reorienten con lentitud. Para una esfera rígida, la función de correlación tiene una forma exponencial caracterizada por un tiempo característico que denominamos tiempo de correlación, τc. C (τ ) = 15 exp[− τ / τ c ]

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En este caso, la función de densidad espectral tiene forma Lorentziana J (ω ) =

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τc (1 + ω 2τ c2 )

Para macromoléculas “rígidas” es posible separar las contribuciones de dos tipos de movimiento: el movimiento global y el movimiento local. Para que ello sea posible ambos movimientos no deben estar correlacionados. Además, para que puedan separarse sus contribuciones, las escalas de tiempo deben ser muy distintas. La función de correlación resultante es el producto de dos términos C (τ ) = C0 (τ ) ⋅ C I (τ ) La reorientación global de una molécula rígida sigue las leyes de la hidrodinámica y puede calcularse a partir de la estructura tridimensional de la molécula utilizando el programa HYDRONMR. A menudo se asume que la molécula es esférica y está caracterizada por un único tiempo de correlación o axialmente simétrica, y en este caso estaría caracterizada por dos tiempos de correlación. Los tiempos de tiempos de correlación rotacional de las macromoléculas que se estudian por RMN son del orden de los nanosegundos. La función de correlación interna estará referida a un sistema fijo sobre la molécula. En general los procesos dinámicos internos que originan la relajación son complejos y la forma de la función de correlación puede ser muy complicada. Pueden existir procesos difusivos (como el descrito para una esfera) o procesos descritos mediante saltos discretos entre diferentes situaciones (por ejemplo conformaciones discretas que difieren por el giro alrededor de un enlace). Es tentador proponer modelos de sofisticación creciente hasta conseguir una concordancia perfecta entre el modelo y los datos experimentales. Es evidente, sin embargo, que, ya que los datos experimentales sólo ofrecen el valor de la densidad espectral a unas pocas frecuencias pueden existir fácilmente modelos alternativos que expliquen los mismos resultados. El análisis que se ha convertido en el más habitual para estudiar la dinámica de macromoléculas que puedan considerarse esencialmente rígidas es debido a Lipari y Szabo. Esta aproximación evita referirse a un modelo microscópico concreto y por eso se denomina “model free”. En este caso, en vez de proponer un modelo de movimiento se asume una forma de la función de densidad espectral “minimalista” caracterizada por un pequeño número de parámetros cuyos valores se extraen ajustando el modelo a los datos experimentales. Una forma habitual de la función de densidad espectral es:  S 2τ c (1 − S 2 )τ  J (ω ) =  +  2 2 1 + ω 2τ 2  1 + ω τ c 1 1 1 = + τ τc τi 2 5

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Donde aparecen como parámetros τc, τi y S2. El primero es el tiempo de correlación global, el segundo el tiempo de correlación efectivo del movimiento interno y S2 es el cuadrado del parámetro de orden generalizado que caracteriza la amplitud del movimiento intramolecular. Existen extensiones del formalismo de Lipari y Szabo que incorporan términos adicionales para movimientos internos en dos escalas de tiempo y a menudo se adiciona una contribución fenomenológica de intercambio a R2. Los valores de los parámetros se obtienen minimizando la desviación entre los valores calculados y experimentales, teniendo en cuenta la incertidumbre de las medidas. El protocolo empieza con el ajuste a las formas más simples (con menos parámetros ajustables) de la función de densidad espectral y aumentando de forma progresiva la complejidad del modelo, mientras la mejora del ajuste esté justificada estadísticamente mediante una prueba F. En general los valores de S2 y τc están bien determinados por los datos experimentales. Los valores de τi en cambio presentan a menudo fuertes incertidumbres tanto para valores bajos (τi < 30 ps) como para valores altos que se acerquen a τc. El parámetro de orden, S2, es una medida de la distribución de las orientaciones de un vector, definido por la interacción considerada, en un sistema de referencia fijado sobre la molécula y toma valores entre cero y uno. Para el caso de la relajación de 15N del esqueleto de regiones con estructura secundaria bien definida en proteínas se obtienen valores típicos de 0.86 que pueden ser interpretados, en función de los modelos considerados, como fluctuaciones del vector NH con un ángulo cuadrático medio de unos 12º o difusión en la superficie de un cono con un ángulo de 18º. Si tanto τi como (1-S2) son pequeños, el cociente entre las velocidades de relajación longitudinal y transversal es independiente de la movilidad interna y puede utilizarse para caracterizar el movimiento global de la molécula. La separación entre movimientos globales y locales no se cumple para sistemas que no son rígidos: proteínas en las que hay movimientos entre dominios o en el caso de pequeñas moléculas de RNA. En estos casos puede resultar útil el recurso a simulaciones de dinámica molecular para extraer información que permita validar la separación de movimientos. Las trayectorias tienen que ser largas comparadas con el tiempo de correlación de la molécula considerada. Para moléculas pequeñas esto es posible utilizando dinámica molecular convencional con trayectorias de 10-50 ns. Para moléculas de mayor tamaño esto no es computacionalmente accesible y debe recurrirse a métodos menos precisos, como son la dinámica Browniana. Brüschweiler ha propuesto el formalismo iRED en el que a partir de la trayectoria calculada se analiza la matriz de covarianza de las orientaciones relativas de un conjunto de vectores fijados en distintos puntos de la molécula. La construcción de dicha matriz es muy sencilla y está formada por elementos de la forma M ij = P2 (cos(Ω i − Ω j )

donde

P2(x) = (3x2-1)/2

(Ωi − Ω j ) es el ángulo formado por los vectores i y j en una de las instantáneas de la trayectoria y el promedio se toma sobre todo el conjunto de instantáneas. La matriz de covarianza no contiene información temporal pero si las correlaciones entre los distintos

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vectores. Diagonalizando esta matriz se obtienen los modos de reorientación, cada uno de ellos con un valor propio asociado. En una molécula rígida habrá cinco modos de reorientación que serán claramente diferenciables del resto por sus valores propios. En moléculas no rígidas los distintos modos con valores propios no despreciables proporcionan la base para interpretar los parámetros de relajación.

4. Intercambio químico La modulación de las interacciones dipolares o de apantallamiento anisotrópico tienen lugar en la escala de tiempo de los pico- nanosegundos. Otros procesos estocásticos tienen lugar en la escala de tiempo de los micro- milisegundos y pueden afectar a la relajación a través de la modulación del desplazamiento químico isotrópico debido a cambios en el entorno químico del espín. Las macromoléculas, aun en su forma nativa, deben interpretarse como conjuntos dinámicos de conformaciones en equilibrio. Aunque la forma de menor energía representa el estado más probable, otras conformaciones son accesibles y pueden ser relevantes para entender la función biológica. La baja población de estos “estados excitados” dificulta su estudio mediante métodos estructurales habituales. Las medidas de relajación de RMN en la escala de tiempo del micro- milisegundos ofrecen una herramienta muy poderosa para su estudio. La contribución del intercambio químico para el componente dominante del valor esperado de coherencia de espines perteneciente a en un sistema en equilibrio entre dos estados depende de las constantes de velocidad del proceso químico en ambos sentidos sentidos, kex = k12 + k21 , la diferencia entre las frecuencias características de la coherencia en ambos estados, ∆ω, y de las poblaciones, p1 y p2 : k12 A1 A2 k21 k 1 Rex = ex − 2 8

[

 2 2 2 2 2 2 2 k ex − ∆ω + (k ex + ∆ω ) − 16 p1 p 2 ∆ω k ex 

]

1

2

  

1

2

Esta ecuación describe la contribución de intercambio a la señal observable (la del componente mayoritario). A menudo, la contribución del componente minoritario no se observa directamente pero afecta la relajación, y por tanto la anchura de línea, de la señal observada. En el caso límite de intercambio rápido (en el que existe una única señal a la frecuencia promedio) la contribución de intercambio se simplifica a Rex = p1 p 2 ∆ω 2 k ex−1

La extracción de la información cuantitativa sobre intercambio es posible debido a que la contribución aparente del intercambio químico puede modificarse por la aplicación de campos de radiofrecuencia, sea en la forma de una serie de pulsos de 180º en una secuencia CarrPurcell-Meiboom- Gill (CPMG) o mediante una secuencia de confinamiento de espines. Las expresiones anteriores se refieren a una determinada coherencia y deben corregirse experimentalmente las interconversiones entre coherencias, por ejemplo en fase y antifase debido al acoplamiento escalar. Las curvas que describen la dependencia de la velocidad de relajación aparente con la duración del eco de espín, τcp, en los experimentos CPMG se denominan curvas de dispersión

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de relajación (“relaxation dispersion”). La forma de las curvas de dispersión de relajación ha sido deducida analíticamente. Para el límite de intercambio rápido, una forma aproximada es  2 tanh(τ cp k ex / 2)  Rex (1 / τ cp ) = p1 p 2 ∆ω 2 k ex−1 1 −  τ cp k ex  

Las ecuaciones contienen los parámetros que definen el intercambio y la variable experimental τcp . Del ajuste de los datos experimentales pueden obtenerse los parámetros de intercambio. La contribución debida al intercambio químico no depende del peso molecular. Las otras contribuciones de la relajación transversal dependen del tiempo de correlación y aumentan para moléculas de gran tamaño. Para poder ser medida, la contribución del intercambio no debe ser despreciable respecto a la de otros mecanismos de relajación transversal. Esto ha hecho aparecer nuevos experimentos en los que se utilizan las aproximaciones TROSY para minimizar la relajación transversal y permitir el estudio de intercambio químico para moléculas de gran tamaño. En este sentido es especialmente interesante la observación que la correlación cruzada entre las contribuciones dipolares CH dentro de un grupo metilo no contribuye a la relajación de las coherencias de cero y doble cuanto. Si se eliminan otras contribuciones externas, mediante la deuteración exhaustiva de la molécula, exceptuando los grupos metilo de interés, un experimento basado en las secuencias HMQC permite la medida de intercambio químico en proteínas de elevado peso molecular. El grupo de Kay ha demostrado la existencia de intercambio químico en un 20% de los grupos metilos de la proteína malato sintasa G , de 82 kDa. Una aplicación espectacular de las medidas de intercambio químico ha sido presentada por el grupo de Kern con la medida de la dinámica de sistemas enzima-sustrato durante la catálisis. Inicialmente se estudió un enzima que causa una isomerización cis-trans, en un estudio posterior se ha demostrado que la reacción de interconversión reversible entre ATP+AMP y dos moléculas de ADP catalizada por el enzima adenilato kinasa muestra una velocidad de reacción determinada por el equilibrio conformacional entre una forma abierta y cerrada del enzima, cuya velocidad pudo ser determinada por medidas de dispersión de relajación. Conclusiones Los procesos de relajación constituyen un elemento esencial de los experimentos de RMN tanto por las restricciones que imponen en la obtención de espectros (sensibilidad, resolución) como por la información estructural y dinámica que proporcionan. En particular, las medidas de relajación en RMN proporcionan una herramienta única para el estudio de la dinámica a distintas escalas de tiempo. Los procesos dinámicos implicados van desde movimientos internos más rápidos que el movimiento Browniano de la molécula completa a procesos lentos asociados con cambios conformacionales u otras formas de intercambio químico. La sensibilidad de los métodos de relajación permite detectar contribuciones de especies en equilibrio con una población muy pequeña. Para el caso de proteínas, esto ha sido descrito como la caracterización de sus estados excitados. Las fluctuaciones que afectan a estos estados, en algunos casos han sido asociadas a procesos de catálisis enzimática, enfatizando la relevancia de las medidas dinámicas, accesibles mediante medidas de relajación, para la comprensión de la función de las biomacromoléculas.

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Bibliografía Los trabajos de A.G. Palmer proporcionan descripciones rigurosas pero extremadamente lúcidas sobre los fenómenos de relajación. Las contribuciones más importantes de su grupo se refieren a las medidas de intercambio químico. Para preparar esta contribución me he basado en distintos trabajos de su grupo y en notas de clases impartidas por el Profesor Palmer. Revisiones de carácter general. Palmer, A.G., Williams, J. Mc. Dermott J. Phys. Chem. 1996, 100, 13293-13310. Dayie, K.T., Wagner, G., Lefèvre, J.-F. Annu. Rev. Phys. Chem. 1996, 47, 243-282. Fischer, M.W.F., Majumdar, A., Zuiderweg, E.R.P. Progress NMR Spect. 1998, 33, 207-272 Korzhnev, D.M., Billeter, M., Arseniev, A.S., Orekhov, V.Y. Progress NMR Spec. 2001, 38, 197-266. Revisiones sobre aspectos concretos. La aparición del último volumen de Métodos en Enzimología, editado por T.L. James y publicado por Elsevier ha puesto a nuestra disposición una serie de revisiones muy actualizadas sobre temas tratados en este capítulo. Palmer, A.G., Grey, M.J. Wang, C. Methods in Enzymology 2005, 394, 430-465. Kern, D., Eisenmesser, E.Z., Wolf-Watz, M. Methods in Enzymology 2005, 394, 507-524. García de la Torre, J., Bernadó, P., Pons, M. Methods in Enzymology 2005, 394, 419-430. Showwalter, S.A., Hall, K.B. Methods in Enzymology 2005, 394, 465-480. Wider, G. Methods in Enzymology 2005, 394, 382-398.