XXVIII Congreso Interamericano de Ingeniería Sanitaria y Ambiental Cancún, México, 27 al 31 de octubre, 2002

ESTUDIO IN VIVO DEL TRANSPORTE DE METALES PESADOS DENTRO DE AGREGADOS METANOGENICOS POR RESONANCIA MAGNETICA NUCLEAR

*Osuna, M. B.1, 3 Licenciada en Ciencias (Biológia Técnica). Doctorado “Toxicidad Combinada de Compuestos orgánicos y metales pesados en procesos anaerobios”. Beca de Formación de Personal Investigador de la Universidad del País Vasco. Beca Marie Curie en el Centro de Entrenamiento de la Universidad Agrícola de Wageningen, área "Heavy metals and Sulfur". Acceso a Grandes Infraestructuras de Investigación, en el Centro de RMN de Wageningen (WnmrC project: IHP Programme). Lens P.N.L.1 1 Sub-department of Environmental Technology, Agricultural University of Wageningen, NL-6700-EV Wageningen, The Netherlands (email: [email protected]) Gerkema E.2 2 NMR Center, Department of Agrotechnology and Food Sciences, Wageningen University, The Netherlands. van As H.2 2 NMR Center, Department of Agrotechnology and Food Sciences, Wageningen University, The Netherlands. Iza, J.3 3 Chemical and Environmental Engineering Dept., School of Engineering, University of Basque Country, Bilbao, Spain *Chemical and Environmental Engineering Dept., School of Engineering, University of Basque Country, Alameda de Urquijo sn, Bilbao, Spain ,– 48920 – Tel.:+34(94)6017297– Fax: +34(94)6014179. e-mail: [email protected] RESUMEN Se han utilizado imágenes de agregados metanogénicos obtenidas por técnicas de resonancia magnética nuclear in vivo (RMN) para estudiar el proceso de difusión y reacción de los metales pesados en el seno de los agregados. Utilizando estas técnicas se puede estudiar el fenómeno de absorción de los metales tanto espacial como temporalmente. Para ello se aprovechan las características de resonancia del agua, siempre presente en estos sistemas de tratamiento, que va intercambiándose con iones paramagnéticos, lo que proporciona una muy elevada sensibilidad, especialmente con especies fuertemente paramagnéticas tales como Cu2+, Cr3+, Vo2+. Otros iones, p.e. Co2+, Fe3+ y Ni2+, también presentan cambios, pero son de menor intensidad y, además, dependientes de la frecuencia de operación. El objetivo principal del trabajo era estudiar el transporte metálico dentro del agregado, siguiendo los tiempos de relajación T1 y T2 de la molécula de agua, y cuantificando la transferencia de masa por difusión en gránulos anaerobios

metanogénicos. Dada su importancia para las bacterias metanogénicas, los metales estudiados fueron el cobalto, hierro y níquel. Para obtener un contraste suficiente en las imágenes RMN fue necesario operar con concentraciones elevadas de metal (>20 mM). Dado que existe una relación lineal entre concentración y susceptibilidad, se llevaron a cabo curvas de calibrado. Los mapas de intensidad de la señal fueron utilizados para interpretar las diferencias de contenido de agua. La evolución temporal de las imágenes muestra que la absorción transcurre por difusión, con un frente que se va ampliando con el tiempo. Los datos obtenidos han permitido el cálculo de los coeficientes de difusión de Co2+ y Fe3+ dentro de gránulos metanogénicos CLAVES: Imágenes RMN, agregados anaerobios, penetración de metales

INTRODUCCION El uso del fenómeno de la Resonáncia magnética nuclear ha sido utilizado ampliamente en el campo de las ciencias médicas para obtener imágenes de los tejidos blandos del cuerpo humano. La técnica se ha desplazado también a los laboratorios, donde se está aplicando con éxito a estudiar diferentes aspectos fisiológicos y bioquímicos de las bacterias. Esto ha sido posible con la aplicación de nuevas tecnologías de imanes permanentes de gran potencia, que ha permitido construir equipos de RMN de alta resolución utilizables con muestras in vivo. Uno de los aspectos más atractivos de la aplicación de la RMN al estudio de la fisiología celular es la posibilidad de llevar a cabo medidas no-invasivas, dadas su características de técnicas que utilizan radiofrecuencias y campos magnéticos. En muchos procesos industriales se produce la solubilización (por lixiviación) de metales pesados, muchos de los cuales son persistentes en el medio ambiente. Por esta causa, para el tratamiento de estas aguas residuales es muy interesante la posibilidad de utilizar como biomasa materiales naturales que tengan capacidad de intercambio iónico o capacidad adsorbente. Los metales se adsorben al fango anaerobio de tipo granular por diferentes tipos de interacciones entre la biomasa y el metal (1), y sus efectos sobre el rendimiento de estas biopelículas es bien conocido. Algunos metales pesados han de estar presentes como trazas para el crecimiento no limitado de la biomasa anaerobia. Como la actividad (concentración) de los iones en su forma libre es la que controla la reacción entre el metal con los centros activos superficiales de los agregados anaerobios, la biodisponibilidad del metal para la óptima actividad del sistema en dichos medio, dependerá de dicha concentración. A lo largo de los años se ha prestado atención al efecto de la adición de diferentes metales traza en el comportamiento de los sistemas metabólicos anaerobios, pero todavía existen carencias en las herramientas analíticas para determinar el transporte difusional in situ en las propias biopelículas. El objetivo principal de este proyecto es estudiar el transporte metálico dentro de los agregados bacterianos conocidos por gránulos metanogénicos, siguiendo el intercambio de estos metales con el agua a través de los tiempos de relajación T1 y T2 de la molécula de agua, y cuantificar la transferencia de masa de tipo difusional en diferentes biopelículas esféricas formadas naturalmente (gránulos). Con ello esperamos conseguir un mejor entendimiento de las relaciones entre las condiciones de operación, la transferencia de materia y las velocidades de conversión metabólica del biorreactor.

MATERIALES Y METODOS Para estudiar el efecto de la penetración del metal dentro de los gránulos metanogénicos, se utilizaron dos tipos diferentes, obtenidos en las depuradoras de las aguas residuales de una cervecera (Heineken, Países

Bajos) y de una papelera (Eerbeek, Países Bajos). Los metales empleado en los estudios de transporte fueron metales con diferentes propiedades de paramagnetismo: Fe, Co y Ni en forma de FeCl3, CoCl2 y NiCl2. Los experimentos se llevaron a cabo en el Wageningen NMR Center (Países Bajos) obteniendo imágenes de un único gránulo. Para este propósito, en dicho centro se desarrollaron técnicas que permitían obtener imágenes de RMN de protón (1H) utilizando para ello un equipo de LF de 30 Mhz. Los tiempos de relajación T1 y T2 de las moléculas de agua se midieron utilizando RMN de eco de spin múltiple. Para obtener la información sobre el transporte y la sorción de los metales se combinaron dos técnicas: obtención rápida de imágenes por diferencias de contraste (debidas al transporte del metal) con medidas de la difusión del agua mediante pulsos de gradiente de campo magnético. Además, se tomaron imágenes individuales a lo largo del proceso para determinar el proceso de penetración del metal. La imagen original se contrastó con la imagen final, una vez sometido al contacto con el metal. RESULTADOS Los resultados indican que, mediante esta técnica, no sólo es posible obtener imágenes intactas de la estructura interna presente en los diferentes agregados anaerobios (Figura 1), mostrando diferencias en función de su composición (cavidades, intrusiones metálicas, etc.) sino que, además, permite el seguimiento del transporte metálico hacia el interior del gránulo (Figura 2). Basándose en el efecto producido por la presencia de los iones Co2+, Fe3+ y Ni2+ sobre el tiempo de relajación T1 del agua, los resultados obtenidos indican que se producen cambios en la estructura del gránulo tanto en función de las propiedades paramagnéticas del metal en estudio como de la concentración utilizada. Cuando se hicieron pruebas, utilizando las concentraciones de metal habituales recomendadas para el óptimo funcionamiento de sistemas anaerobios, las imágenes no mostraron grandes diferencias de contraste (debidas al transporte del metal desde la solución acuosa).

a)

b)

Figura 1: Imagen individual de un granulo anaerobio (sin adición de metal) a) Heineken y b) Eerbeek. (m_msme, TR 0.5s, 128*128, 10*10*3 mm). Los resultados mostraron que, para una clara diferenciación entre señales, es necesario trabajar con concentraciones de metal en solución elevadas (> 20 mM), de tal forma que se puede seguir con más facilidad el proceso de transporte al interior del granulo. El incremento en la concentración de metal permite establecer diferencias mayores de contraste en las imágenes, mostrando que el intercambio iónico

se lleva a cabo en un intervalo de tiempo muy rápido. Por otro lado, el proceso de absorción (transporte) no provocó cambios en la estructura externa del granulo durante el proceso. Se llevaron a cabo curvas de calibración para los distintos metales, mediante la toma de imágenes de soluciones individuales de metal, y para distintas concentraciones. Esto facilitó la interpretación de las diferencias encontradas en la intensidad. Por otro lado, se utilizaron mapas de amplitud (cantidad de agua) para la interpretación de los datos (diferencias de intensidad). La adquisición de imágenes individuales, como función del tiempo, mostraron que los metales (Fe, Co y Ni) son absorbidos con un frente de reacción que se ensancha a lo largo del tiempo. Los ensayos con Fe (100 mM) son mostrados en la figura 1, en la que se muestra el intercambio iónico entre metal y los protones del agua presentes en el gránulo. La desaparición de la imagen es debida a la saturación del gránulo con Fe. Este efecto es debido a las propiedades paramagnéticas del hierro, dado que su tiempo de relajación T2 es mayor (mayor longitud) que el tiempo de repetición utilizado para la obtención rápida de la imagen. Los datos obtenidos se usaron para calcular los coeficientes de difusión del Co2+ y Fe3+ en los gránulos metanogénicos (datos no mostrados).

a)

b

c)

d)

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g)

h)

Figura 2: Evolución temporal de un agregado individual (Eerbeek) tras la adición de una solución de Fe (100 Mm); a) sin adición, b) adición de la solución metálica, tiempo cero. Las siguientes imágenes corresponden a c) +10 min, d) +20 min, e) +30 min, f) +40 min, g) +50 min, y h) +1 h.

CONCLUSIONES La utilización de la técnica de obtención de imágenes por Resonancia Magnética Nuclear permite no sólo la diferenciación de la estructura interna de agregados anaerobios, sino también la visualización del proceso de transporte metálico al interior de los gránulos. La obtención de imágenes individuales en función del tiempo muestra diferencias en la estructura del gránulo tras la adición de metal (contraste), debidas al proceso de transporte de dichos metales (Fe, Co y Ni).

AGRADECIMIENTOS Los autores quieren agradecer las diferentes ayudas recibidas para la realización de este trabajo: Beca Marie Curie en el Centro de Entrenamiento de la Universidad Agrícola de Wageningen, área "Heavy metals and Sulfur, MCFH-1999-00950"; Beca de Formación de Personal Investigador de la Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea, y las Acciones de Acceso a Grandes Infraestructuras de Investigación, en el Centro de RMN de Wageningen (WnmrC project: IHP Programme - Access to Research Infrastructures. Contract HPRI-CT-1999-00085) dentro del Programa de Mejora del Potencial Humano de la Comunidad Europea.

BIBLIOGRAFIA

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