CAPITULO 13. INTERACCION PROTEINA-DNA. CROMATINA

13.1

Proteínas asociadas al DNA. Histonas y otras.

13.2

El nucleosoma

13.3

Posicionamiento de nucleosomas

13.4

Estructuras de orden superior

13.5

Modificación de DNA e histonas y su relación con la activación de la cromatina.

Bibliografía

Blackburn & Gait Telsenfeld & McGhee. Cell, 44 (1986) 375. Daban & Cantor. J.Mol.Biol., 156 (1982) 771. Kornberg & Klug. Scientific American, 244, (1981), 52 Lewin, Genes. Willey, NY 1983. Richmond and cowokers Nature, 289, 251 (1997).

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13.1

Proteínas asociadas al DNA. Histonas y otras. El DNA interacciona con numerosas proteínas, como veremos en el capítulo 17.

Estas proteínas son de muy diverso tipo: enzimas involucrados en transcripción, replicación, preserores, reguladores,..... Una de estas proteínas son las histonas, que juegan un papel clave en el empaquetamiento del DNA en la célula. El problema del empaquetamiento no es trivial, ya que aún un organismo simple como E-Coli tiene alrededor de 3 106 pares de bases de DNA. Ello implica en DNA doble hélice aproximadamente 1 mm! Es decir, mucho más que la longitud total de la célula. La situación es aún más dramática en una célula eucariota (véase Fig. 1 y 2). Es por lo tanto imprescindible que el DNA se compacte para ocupar menos espacio. El nivel de compactación más inmediato es el de cromatina.

Figura 1. Cromosoma eucariota explotado por choque osmótico. Obsérvese la cantidad de fibra de DNA que contenía. -2-

Figura 2. Esquema de compactación del DNA eucariota. En células procariotas y en virus se pueden producir sistemas de empaquetamiento primitivos. Por ejemplo el empaquetamiento hexagonal, donde las fibras de DNA se agruparían como si fuesen un manojo de lápices. Este tipo de empaquetamiento queda estabilizado por la interacción de proteínas muy básicas no histonas: las protaminas. Otra posibilidad de compactación la encontramos en las cabezas de los fagos. Parece que en este caso el DNA esta enrollado como una manguera, sacando partido de la capacidad del DNA para curvarse. El DNA enrollado forma una estructura de unos 170 Å de radio lo que da una estructura muy compacta que queda estabilizada por medio de iones divalentes y de valencia superior. Este tipo de empaquetamiento “curvado” coincide con datos experimentales y teóricos que demuestran la tendencia del DNA a curvarse espontáneamente en presencia de muchos cationes de elevada valencia.

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Desde los años setenta se sabe que el DNA eucariota se encontraba en la cromatina compacto formando unas estructuras que involucraban proteínas y que tenían un tamaño aproximado de 200 pares de bases (el número exacto varia entre organismos). Estudios posteriores han demostrado que lo que existe es un octámero de proteínas muy básicas: las histonas, entorno al cual se enrollo 1 3/4 vueltas de DNA doble hebra. También se ha demostrado que existe otra histona: la H1 que ayuda al empaquetamiento, pero que no está en el octámero. Esta información se derivó a partir de datos de digestión con nucleasa micrococal de cromatina. Al hacerlo con DNA marcado en uno de los extremos se observó que se obtenían fragmentos de excisión cada 200 pares de bases (i.e. fragmentos de 200, 400, 600,…). Es decir, que existína (cada 200 pb) unas estructuras repetitivas que daban protección al DNA frente a nucleasa microcal. La longitud de estas estructuras era de 200 pb. Sabemos ahora que estas estructuras están formadas por el DNA sobreenrollado sobre un core proteico formado por las histonas (Figura 3) con otra histona (la H1) dispuesta de modo exterior al core proteico (véase más abajo).

Figura 3. Esquema de un DNA enrollado 1 ¾ vueltas sobre el core proteico del nucleosoma. Nótese que es una doble hélice levógira.

Las histonas son proteínas muy básicas (lógico porque tienen que interaccionar con el DNA), lo que viene dado por su alto contenido de Arg y Lys. Se habla de 5 tipos

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de histonas: H1, H2A, H2B, H3 y H4 (Figura 4). Estas se clasifican por su contenido en: ricas en Arg (H3 y H4), moderadamente ricas en Lys (H2A, H2B) y muy ricas en Lys (H1 y H5 (una variante de H1 que se da en las aves)). Es interesante notar que las histonas son de las proteínas más conservadas por la evolución. De hecho la única variabilidad notable se da en la histona H1 (H5), que es la histona más externa al octámero. Esto da una idea de la importancia de la nucleación de la cromatina en nucleosomas para la vida de la célula. La unión de las histonas al DNA da lugar a las estructuras comentadas más arriba, estructuras que tienen igual masa de DNA que de proteína. Digestión con nucleasas o proteasas permiten eliminar o la parte de ácido nucleico o la de proteína de las estructuras nucleosómicas.

Figura 4. Contenido relativo de residuos básicos de las 4 histonas.

13.2

El nucleosoma

Pasaremos ahora a analizar las estructuras repetitivas del DNA en la cromatina: los nucleosomas. Como se comentó más arriba fueron los datos de digestión por nucleasa micrococal los que permitieron detectar la existencia de los nucleosomas. Fueron también importantes estudios posteriores en los que al incubar en condiciones de degradación más agresivas se encontraron subpartículas más pequeñas. Así, del

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fragmento de 200 pb se puede obtener por digestión la excisión de un fragmento de 34 pb y una estructura que contiene todas las histonas más DNA enrollado sobre el core central. Esta estructura de 166 pb (más histonas) se llama cromatosoma. Si se fuerzan las condiciones de degradación se escinde la histona H1 y se llega a lo que se cosidera el fragmento core del nucleosoma que tiene unos 145 pares de bases. Si se fuerza aún mas las condiciones llegamos a la partícula núcleo que contiene el core proteico y unas 136 pb. Así se demostró que la histona H1 esta fuera del core proteico (Figura 5), que se encuentra formado por H2A, H2B, H3 y H4. Los contactos entre las histonas (esto es: su disposición dentro del nucleosoma) se detectó por técnicas de crosslinkers, es decir por grupos bifuncionales que unen proteínas de modo covalente. Posteriormente el grupo A.Klug y col. obtuvieron una estructura de baja resolución por difracción de rayos X (Figura 6) en el año 1984, donde ya se veían detalles del empaquetamiento de las histobnas. En septiembre de 1997 el grupo de T.J.Richmod (Nature, 289, 251, 1997) resolvió por rayos X la estructura de un nucleosoma de un fragmento palindrómico de DNA del satélite humano, que incluía la partícula proteica y 146 pares de bases de DNA. En este trabajo, tras décadas de trabajo se consiguió resolver el nucleosoma a 2.8 Å de resolución, lo que ya nos permite ver ya los detalles completos de la estructura del nucleosoma (Figuras 7 y 8).

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Figura 5. Esquema de la estructura del nucleosoma. Como vemos existe un núcleo proteico entorno al cual se enrolla en sentido levógiro 1 3/4 vueltas de DNA. El diámetro es aproximadamente 11 nm (110 Å) y la altura es 5.5 nm (55 Å).

Figura 6. Estructura de baja resolución de la partícula núcleo.

Se ha visto en la estructura de alta resolución que el nucleosoma es bastante como se postuló a partir de datos de baja resolución y análisis de reactividad química, pero que también se habían escapado algunos detalles sutiles en los datos de baja resolución. Primero se ve que el DNA no se encuentra enrollado de manera uniforme, sino que en algunas zonas es casi recto, mientras que en otras tiene una muy fuerte curvatura. Esto sugiere que las propensiones intrínsecas a doblarse del DNA marcan en parte la estructura real del nucleosoma. Interesante, las histonas que constituyen el core proteico emiten fragmentos polipeptídicos que se prolongan fuera del core. En algunos casos estas cadenas polipeptídicas “atraviesan” entre 2 cadenas de DNA (ver Figuras 7

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y 8) y salen hacia el exterior. Es posible que estas cadenas sean importantes para niveles de estructuración más elevados del DNA.

Figura 7. Estructura del nucleosoma a 2.7 Å de resolución.

Figura 8. Detalles de la curvatura del DNA sobre el nucleosoma y de las proturberancias de cadenas de histona por los surcos. -8-

Las histonas son muy ricas en hélices alfa y dan lugar a empaquetamientos que nos recuerdan a -bundle o -corner (ver Figuras 7,8). Las histonas se presentan a pares y de hecho se observan como dos heterodímeros formados por H3-H4 y por H2A-H2B, como ya se sabia estos dímeros se repiten 2 veces dando lugar a una estructura bastante simétrica (ver Figuras 7 y 8). Estos dímeros se forman por interacciones de apilamiento, que si las observamos nos resultan familiares en empaquetamientos tipo -bundle. Las interacciones entre DNA y proteína son muy intensas y justifican que el DNA se curve. Tal como teóricamente se habia previsto las interacciones son básicamente electrostaticas, y son los fosfatos del DNA los residuos que más interaccionan con residuos de la proteína. Estos residuos son en muchos casos grupos básicos de las proteínas, y en otros grupos polares como OH, o incluso los grupos amida. También se dan muchas interacciones con los grupos apolares de las proteinas y las ribosas. Finalmente, se han detectado contactos muy itensos entre fragmentos de la proteína y el hueco que generan los minor groove de 2 cadenas de DNA. Podemos pensar que esta interacción es clave para enmascarar la fuerte repulsión fosfato-fosfato que se da fruto de la empaquetación del DNA. De hecho los autores del trabajo en Nature 389, 251 (1997) sugieren que parte de la propensión que ciertas secuencias, por ejemplo pasos A.T tienen para formar nucleosomas es debido a la tendencia de estos pasos a formar estructuras con minor grooves muy estrechos. Estos surcos concentrarán mucha carga negativa, y que por tanto formarán puentes salinos muy fuertes con las histonas. Los estudios de difracción de rayos X a alta resolución han confirmado que la razón que causa el enrollamiento del DNA sobre el nucleosoma son interacciones electrostáticas entre las abundantes cargas positivas de las histonas, y los grupos fosfatos del DNA. Por otro lado, respecto a la forma del DNA sobre el nucleosoma, se ha visto que es un DNA curvado, pero a parte de eso no está excesivamente distorsionado. Es interesante notar que el DNA no está “encerrado” o “protegido” por la proteína, sino solo depositado sobre su superficie. Esto que ahora queda claro por la estructura del nucleosoma se demostró hace tiempo en un experimento clásico con DNAasa I. Este enzima corta una cadena de DNa (nick) con gran eficacia, aún en sitios -9-

en los que este está cercano a proteínas, pero no es capaz de desnaturalizar proteínas, o tener efecto proteasas. Al incubar DNAasa I a nucleosomas y hacer electroforesis lo que aparecen son bandas de aproximadamente 10 pares de bases (bp). Esto liga de manera clara con la hipótesis de que el DNA está enrollado sobre el core proteico, pero no protegido por él. Recordar que el DNA (B) es una doble hebra de unos diez pares de bases por vuela, y por tanto cada 10 pares de bases el DNA estará accesible a la acción de las nucleasas, y podrá ser cortado. 13.2

Posicionamieno de nucleosomas

Recientemente se ha combinado degradación por micrococal nuclease (MNase) con Deep sequencing para determinar el posicionamiento de los nucleosomas en el genoma. Para algunos organismos como sacharomyces se tienen mapas de alta resolución, para otros como el hombre estos no son tan completos. En cualquier caso se ha visto como los nucleosomas no se posicionan al azar sino en muchos casos tienen posiciones marcadas, sea por cuestiones físicas del DNA, por la presencia de proteínas competidoras, o por el efecto de factores de remodelación de la cromatina. La pauta de posicionamiento es especialmente clara en la región cercana a los orígenes de transcripción, que muestran una región claramente deplecionada de nucleosomas justo antes del origen de replicación rodeada de dos señales de 2 nucleosomas bien posiscionados 1 downstream (el nucleosoma +1) y el otro upstream (el -1)

Figura 9. Esquema de posicionamiento de nucleosomas respecto a lugares singulares. Resultados de Widom and coworkers Nature 2012, 486, 496.

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El mantenimiento de estas posiciones promedio parece ser clave para una buena regulación de la expresión génica.

13.4

Estructuras de orden superior Es evidente que el DNA tiene que compactarse mucho más que el nivel de

compactación que le proporciona el nucleosoma. Un ejemplo de compactación lo representa el cromosoma (Figura 1). Entre el primer nivel de empaquetamiento y el último hay un número de etapas intermedias. Así en primer lugar los nucleosomas se agrupan dando fibras más o menos lineales. Esta fibra de nucleosomas se estructura más aún formando unas “superhebras” helicoidales de unos 30 nm de anchura, y con un paso de rosca de unos 6.7 nucleosomas por vuelta (Figuras 2 y 9). No se conoce en detalle la estructura, pero parece que la histona H1 juega un papel clave para estabilizar el interior de la hebra (ver Nature 368, 351 (1994)).

Figura 10. Imagen de microscopía electrónica de la fibra de 30 nm. Observar el detalle de los nucleosomas (partículas blancas). Existen varios modelos para explicar la estructura de esta sueprfibra, el más extendido es el modelo del solenoide simple (T17.4). Este modelo no está totalmente caracterizado a nivel estructural por el tamaño del sistema. La mayoría de los libros - 11 -

recogen un modelo como el que se muestra en la Figura 10 con los nucleosomas como apilados en un eje oblicuo al de la superfibra. Sin embargo otros autores soportan modelos ligeramente diferentes (véase Figura 11).

Figura 11. Posible modelo del solenoide de la fibra de 30 nm. Las superfibras constituyen ya un nivel de empaquetamiento elevado, pero no osbtante, es preciso un nivel mucho mayor de empaquetamiento. Los niveles por encima de la superfibra de 30 nm no están claros. Se piensa que varias superfibras se pueden agrupar para dar una suprahélice. En cualquier caso, el paso final de empaquetamiento es el cromosoma, en el que el elevado grado de empaquetamientod se consigue a base de formar lazos de super o suprahélice. Se especula que hay unos ocho lazos en un cromosoma estandard:

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Figura 12. Modelo alternativo del solenoide en la fibra de 30 nm.

13.5

Modificación de DNA e histonas y su relación con la activación de la

cromatina. Es un tema amplio que veremos solo superficialmente (ver capítulo 30 de Lewin), en tanto se comentarea en otras asignaturas. Una pregunta clave cuando hablamos de nucleosoma y actividad del DNA es: está el DNA (en cromatina) organizado en nucleosomas cuandos e encuentra activo?, o solo cuando esta “almacenado”?. Los datos experimentales son claros: los enes “activos” contienen un porcentaje de nucleosomas igual a los genes inactivos. Es decir, no se produce perdida de estructura nucleosomal cuando el DNA se activa. No sabemos en detalle cual es la estructuración del DNA en el momento exacto de la replicación o transcripción. El tamaño de los enzimas implicados en este proceso es muy grande, con lo que se especulan que “chocarían” con el nucleosoma si este estuviera formado. Así,

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la idea generalizada es que en el momento justo de la replicación o transcripción el nucleosoma se desestructurará, pero en cuanto a los enzimas implicados pasan de largo estos se reforman. En este proceso no queda claro si cuando se produce la reformación ésta se produce en la misma posición. Los resultados no son concluyentes, pero los experimentos más recientes soportan un cierto “conservadurismo” en cuando a la posición que ocupa el nucleosoma. Notad que la estructura del nucleosoma podría jugar un papel clave al acercar en el espacio secuencias lejanas, para el reconocimiento del DNA por proteínas). Lo que si que esta claro es que el empaquetamiento del DNA por las histonas produce en general una inhibición en la unión de otras DNA-binding proteins, como los factores de transcripción. Mirando la estructura se ve que esta inhibición no se debe tanto a la reducción del area accesible del DNA (73% de la normal en el nucleosoma), sino a la distorsion que se genera en la estructura del DNA. Por último, es interesante destacar que a priori la formación del nucleosoma puede crear centros de reconocimiento. Es decir, al distorsionar el DNA puede crear un centro de reconocimiento que sea propio de ese DNa cuando esta en el nucleosoma, pero no cuando no está. Esta hipótesis se conforma por algunas proteínas, por ejemplo la integrasa del HIV que tiene preferencia por unirse a fragmentos de DNA que se encuentran en nucleosomas. Se especula (ver Cell 69, 769 (1992), y PNAS 91, 5913 (1994)) que esto se da por la especificidad de ciertas proteínas por reconocer fragmentos de gran curvatura.

MODIFICACION QUIMICA DE HISTONAS Las histonas no son proteínas estáticas sin reactividad alguna, como podría sugerir su papel estructural. Por el contrario, sus cadenas laterales sufren un gran número de reacciones tales como acetilaciones (ejemplos en las Lys), fosforilaciones, o incliso “ubiquitinación”. La importancia biológica de todos estos procesos es algo que no ha sido clarificado, aunque a menudo se relaciona con la formación o rotura del nucleosoma. Por ejemplo, la acetilación de ciertas Lys en la histona H4 se ha sugerido que conduce a una desestabilización del nucleosoma. También se sabe que el proceso de formación/rotura del DNA implica a menudo fosforilaciones de residuos de las histonas. - 14 -

Dada la relación entre rotura/formación de nucleosomas y la funcionalidad del DNA parece obvio que estos procesos de modificación química de las histonas estén perfectamente regulados.

MODIFICACIONES QUIMICAS DEL DNA Los nucleosomas pueden interaccionar con numerosas moléculas. No obstante, la reactividad más relevante que poseen viene dada por su capacidad de metilarse y desmetilarse. La metilación se da en citosinas, especialmente en secuencias ricas en CG. Evidencias diversas paraecen demostrar que el pattern de metilación puede ser muy constante (siempre en iguales zonas del DNA), y de hecho se supone que el proceso de metilación esta catalizado por enzimas específicos: loas DNA methylasas, lo que sugiere una importancia elevada de este proceso para la vida de la célula. Evidencias experimentales sugieren que la desmetilación viene asociada a la expresión del gen.

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