CAPÍTULO 2.2.10.

FIEBRE Q

RESUMEN La fiebre Q (del inglés Query, interrogante) es una zoonosis presente en la mayoría de los países. El hombre adquiere la infección a partir de los animales, en especial de los rumiantes domésticos. La fiebre Q es una enfermedad muy infecciosa debida a la multiplicación de Coxiella burnetii, una bacteria pequeña y pleomórfica que mide 0.3-1.5 µm de largo por 0.2-0.4 µm de ancho. Como se trata de una bacteria estrictamente intracelular, C. burnetii sólo puede crecer en huevos embrionados o cultivos celulares o, cuando resulta necesario, en animales de laboratorio inoculados. Se presenta en dos formas antigénicas: la fase patógena I, que se encuentra en animales infectados o en el hombre, y la fase avirulenta II, que se obtiene por pases repetidos en huevos embrionados o en cultivos celulares. Debido a que este microorganismo es extremadamente peligroso, el manejo de C. burnetii viable debe llevarse a cabo en servicios que cumplan los requisitos de la OIE para patógenos del Grupo 3 de Contención. En el hombre, la fiebre Q se presenta como una forma aguda (episodio febril autolimitado, neumonía, hepatitis) o como una forma crónica grave (endocarditis) después de una infección inicial que puede pasar desapercibida. La forma aguda se resuelve rápidamente después de una terapia antibiótica adecuada, pero la manifestación crónica requiere una terapia antibiótica prolongada (durante 2 años o más), junto a un seguimiento serológico. En algunos países, se dispone de vacuna para grupos de población potencialmente expuestos por motivos profesionales. En el ganado, los síntomas de la fiebre Q incluyen aborto, descendencia muerta o debilitada, retención placentaria, metritis e infertilidad. En los pequeños rumiantes, la fiebre Q está a menudo asociada a abortos esporádicos o a brotes de abortos seguidos de una recuperación sin complicaciones. La infección por Coxiella burnetii persiste durante varios años, y probablemente dura toda la vida. Las ovejas, cabras y vacas son mayoritariamente portadores asintomáticos, pero pueden liberar cantidades masivas de bacterias en el parto, y de forma intermitente en varias secreciones y excreciones. Algunos animales domésticos, como gatos, conejos, pájaros, etc., también son susceptibles a la infección y deben considerarse como fuentes potenciales de infección para los animales y el hombre. Identificación del agente: Para el diagnóstico laboratorial, se pueden tomar muestras de la placenta, de descargas vaginales y del hígado, pulmones o contenido del estómago de fetos abortados, o de la leche, calostro o heces. La bacteria se puede visualizar por tinción en frotis de tejidos mediante un microscopio con objetivo de inmersión. Debido a que es alcohol-ácido resistente, se puede teñir por diversos métodos: el de Stamp, el método modificado de Ziehl-Neelsen, el de Gimenez, el método de Giemsa, o el método de Koster modificado. Esta detección constituye una evidencia presuntiva de fiebre Q, pero unida con pruebas serológicas, datos clínicos, y otros agentes infecciosos abortivos, puede ser suficiente para establecer un diagnóstico de la enfermedad a nivel del rebaño o de la explotación. En la actualidad, se considera que la demostración del agente por inmunohistología usando anticuerpos específicos o por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) resulta más específica y sensible que los métodos clásicos de tinción. Sin embargo, no existen anticuerpos específicos para inmunoquímica que estén disponibles a nivel comercial, y la técnica de PCR requiere laboratorios convenientemente equipados. La PCR constituye una prueba útil para diagnosticar gran número de muestras y varios tipos de muestras. Además, las muestras se pueden inactivar por calor, con la consiguiente seguridad para el personal de laboratorio.

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Coxiella burnetii se puede aislar por inoculación de muestras en cultivos celulares convencionales o en le saco vitelínico de huevos embrionados o en animales de laboratorio. La inoculación en animales de laboratorio (cobaya, ratón, hámster) es útil en casos en que se requiere el aislamiento a partir de tejidos contaminados con varios microorganismos o para obtener los antígenos de Coxiella en fase I. Pruebas serológicas: A menudo el diagnóstico de la fiebre Q se apoya en la serología. Se pueden usar varias pruebas, en particular la prueba de inmunofluoresecencia indirecta, el enzimoinmunoensayo, y la prueba de fijación de complemento. Actualmente, hay pruebas comerciales disponibles que permiten la detección de anticuerpos anti-C. burnetii en fase II. La presencia de anticuerpos IgG específicos representa una evidencia de una exposición a C. burnetii reciente o pasada. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Se han vacunas inactivadas contra la fiebre Q, pero sólo aquellas que contengan C. estén preparadas a partir de ella deben considerarse protectoras. En infectadas, se recomienda una vacunación anual repetida, particularmente animales jóvenes.

desarrollado varias burnetii en fase I o áreas densamente en el caso de los

En Eslovaquia hay una vacuna inactivada de fase I que está disponible comercialmente. Un estudio reciente ha demostrado su eficacia respecto al aborto y a la diseminación de C. burnetii en cabras gestantes que fueron vacunadas experimentalmente y luego infectadas, pero no existe información sobre su seguridad.

A. INTRODUCCIÓN La fiebre Q tiene una amplia distribución por todo el mundo excepto Nueva Zelanda. Aunque la fiebre Q está prácticamente presente en todo el reino animal, incluyendo los artrópodos, la enfermedad afecta sobre todo al hombre, al ganado bovino, ovino y caprino (18, 21). El agente etiológico, Coxiella burnetii, es una bacteria gramnegativa estrictamente intracelular, adaptada para desarrollarse en el interior del fagolisosoma del fagocito. Históricamente se ha clasificado dentro de la familia Rickettsiaceae; sin embargo, investigaciones filogenéticas basadas principalmente en el análisis de la secuencia del ARN ribosomal 16S indican que el género Coxiella está distante del género Rickettsia en la subdivisión alfa de las Proteobacterias (49). Ahora Coxiella burnetii se sitúa en la familia Coxiellaceae en el orden Legionellales de la subdivisión gamma de las Proteobacterias (17). Recientemente se ha logrado la secuenciación completa del genoma de C. burnetii y se confirma su posición sistemática (38). A diferencia de las rickettsias, C. burnetii origina una forma semejante al esporo, pequeña, densa y muy resistente, que es muy estable en el medio ambiente, una característica importante para su transmisión (22). Esta capacidad se ha atribuido a la existencia de variantes en el ciclo de desarrollo de C. burnetii: variantes con células grandes (LCV), variantes con células pequeñas (SCV) y células pequeñas densas (SDC) (10,39). Las variantes SDC y SDV representan las formas de la bacteria con mayores posibilidades para sobrevivir extracelularmente como partículas infecciosas. Otra característica esencial es que C. burnetii tiene dos formas antigénicas: la fase I patógena, aislada de animales o humanos infectados, y la fase II avirulenta, obtenida in ovo o in vitro. Durante los pases en serie ocurre un cambio en el LPS (lipopolisacárido): las células en fase I, que contienen cadenas O de una longitud completa en el LPS, cambian a fases intermedias disminuyendo la longitud de las cadenas O del LPS y luego a fase II, con un LPS incompleto. La variación de fase del LPS se acompaña de una delección cromosómica permanente que hace imposible la reversión celular de fase II a fase I. La fiebre Q es una zoonosis. En humanos la infección presenta una forma aguda y una forma crónica (29). En general, las formas agudas incluyen un episodio febril autolimitado, neumonía y hepatitis granulomatosa. La manifestación clínica principal de la fiebre Q crónica es una endocarditis en pacientes con valvulopatías. Las complicaciones de la forma aguda pueden ser graves o fatales en ausencia de un tratamiento adecuado con antibióticos (6). Además, la infección por C. burnetii puede provocar inflamación de la placenta y a menudo acarrea nacimientos prematuros, limitaciones del crecimiento, aborto espontáneo o muerte fetal en las mujeres embarazadas (27). La infección es endémica en muchas áreas originando casos esporádicos o epidemias explosivas. Su incidencia es posiblemente mayor que la descrita. La epidemiología de la fiebre Q sugiere que la infección probablemente se transmite por la inhalación de partículas desecadas de aerosol, y a través del contacto con animales infectados y sus tejidos reproductores (20, 21). A menudo se ha sugerido la ingestión, en particular a través del consumo de productos lácteos derivados de leche sin procesar, e incluso posiblemente después de ser pasteurizada (9, 29, 44). La fiebre Q se transmite muy raramente de persona a persona; sin embargo, esto es posible por contagio durante el nacimiento, a través de transmisión sexual o por transfusión sanguínea (23). En los animales puede ocurrir una transmisión vertical y sexual, además de a través de las rutas respiratorias y digestivas (16,47). Los artrópodos, sobre todo garrapatas, pueden estar implicados en la transmisión de la fiebre Q.

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En vacas, ovejas y cabras, la fiebre Q se ha asociado fundamentalmente con abortos tardíos y con desórdenes tales como nacimientos prematuros, muerte o debilidad de las crías, metritis e infertilidad (18). Sin embargo, las respuestas serológicas en una especie determinada o incluso el aislamiento de C. burnetii no se correlacionan necesariamente con la expresión de la enfermedad clínica (11, 18, 35). El agente puede persistir en los animales infectados, eliminarse intermitentemente a través de la leche, las heces y la orina, y estar presente en la sangre. Puede recuperarse en grandes cantidades en los productos del parto (placenta, líquido amniótico y feto), y los animales no grávidos representan menor riesgo. Se considera que los reservorios principales de C. burnetii son los rumiantes domésticos, pero también se ha descrito que los gatos, perros, conejos, pájaros, etc., pueden eliminar el germen involucrándose en la contaminación humana (14, 20, 21, 42). Por tanto, los animales domésticos y silvestres infectados normalmente liberan el agente sin signos visibles de enfermedad, y deberían considerarse como posibles fuentes de infección para el hombre. Con frecuencia, se ha investigado el aborto en rumiantes para determinar si se trata de fiebre Q, ya que puede afectar a la salud humana y a la de otros animales. A estos efectos, el diagnóstico de la fiebre Q, y de otras enfermedades abortivas, cuando se realiza sobre datos de microscopía de muestras clínicas, y se complementa con resultados serológicos positivos, suele ser normalmente adecuado (18, 32, 34). El diagnóstico de la fiebre Q también resulta necesario para análisis epidemiológicos de poblaciones "de riesgo" o sospechosas en áreas limitadas (después de brotes recientes en el hombre o en animales), o con fines comerciales de exportación. No obstante, en la actualidad no se lleva a cabo la identificación de eliminadores de C. burnetii ni de portadores asintomáticos (2). Cuando varios animales resultan seropositivos, se recomienda por lo general una intervención adecuada. Las medidas se pueden adaptar al contexto epidemiológico y de seroprevalencia concreto. Se debe asegurar una pasteurización correcta de los productos lácteos (44). Usando lejía al 10%, se puede reducir la cantidad de agente en el medio con una limpieza regular y la desinfección de las instalaciones animales, teniendo un cuidado particular en las áreas de parto. Los animales gestantes deben mantenerse en corrales separados, y las placentas y fetos abortados deben retirarse rápidamente y eliminarse de modo apropiado para evitar su ingestión por perros, gatos o animales silvestres. Debe evitarse la dispersión del estiércol de granjas contaminadas por áreas suburbanas y por jardines. Aunque no está evaluada la eficacia de la inactivación de C. burnetii mediante fermentación por compostaje o por descontaminación mediante tratamiento químico (como por ejemplo con 0,4% de cianamida cálcica o con cal), estos métodos son todavía recomendables. Para adquirir y mantener una población de animales libres de fiebre Q, se debe reducir la introducción de animales, el reagrupamiento de rebaños, el contacto con animales silvestres y la infestación por garrapatas. Aunque se han desarrollado vacunas contra la fiebre Q animal, en la mayoría de los países no están disponibles comercialmente. Finalmente, es importante recordar que C. burnetii es muy peligrosa para el hombre, y que las infecciones en el laboratorio son frecuentes. Debido a su baja dosis infectiva, su resistencia ambiental, y la ruta de transmisión por aerosoles, se considera a C. burnetii como un agente potencial de bioterrorismo (5). Deben tomarse precauciones adecuadas con este agente de grupo de riesgo 3. Los cultivos vivos o el material contaminado de animales infectados deben manejarse solamente en instalaciones que cumplan los requisitos para patógenos del Grupo de Contención 3 que se indican en el Apéndice I.1.6.1. del Capítulo I.1.6. Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología.

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1.

Identificación del agente

Se puede evidenciar Coxiella burnetii de varios modos, dependiendo del tipo de muestra y el propósito del diagnóstico (6, 32, 34). Las muestras deben tomarse tan pronto como se pueda de los fetos abortados, de la placenta, y de las descargas vaginales, después del parto o del aborto. También se pueden tomar muestras de los tanques de leche, de la leche individualizada o del calostro, y de las heces.

a)

Tinción En caso de sospechar que un aborto esté causado por infección, se preparan frotis del cotiledón de la placenta sobre portas para microscopía (33). Del mismo modo puede usarse el contenido del pulmón, hígado o rumen de los fetos abortados o las descargas vaginales. Estas muestras se tiñen siguiendo métodos rápidos: el de Stamp, el método modificado de Ziehl-Neelsen, el de Gimenez, el de Giemsa, el de Machiavello y el método de Koster modificado (8, 26, 32, 33, 35). Por ejemplo, el método de tinción de Stamp, que es muy similar al de Ziehl-Neelsen modificado, se realiza con una solución de fucsina básica al 2%, seguida de una decoloración rápida con una solución de ácido acético al 0,5%, y haciendo una tinción de contraste con una solución de azul de metileno o de verde malaquita al 1%. Los frotis se examinan microscópicamente con objetivo de inmersión (x500 o más aumento). Coxiella burnetii se caracteriza por la presencia de un número muy grande de pequeñas bacterias teñidas de rosa en forma de cocobacilos

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destacando sobre un fondo azul o verde. A veces son difíciles de detectar debido a su pequeño tamaño (0,3-1,5 µm de largo x 0,2-0,4 µm de ancho), pero esto se compensa por su gran número; a veces aparecen dentro de la célula hospedadora inclusiones como manchas rojizas en un fondo azul o verde. Se debe tener cuidado en la interpretación de los resultados, ya que se puede confundir microscópicamente C. burnetii con Chlamydophila abortus o con Brucella spp. Sin embargo, usando el mismo proceso de tinción, Chamydophila tiene perfiles más definidos, son células ovales, pequeñas y pueden parecer glóbulos. Las células de Brucella son más grandes (0,6-1,5 µm de largo x 0,5-0,7µm de ancho), más claramente definidas y se tiñen más intensamente. Se deben de usar portas con controles positivos de C. burnetii, Chlamydophila abortus y Brucella para comparación. El diagnóstico realizado por microscopía, junto a resultados serológicos positivos, suele ser adecuado a efectos rutinarios (34). Cuando la tinción biológica no resulta concluyente, se debe usar algún otro método (ver más adelante) como prueba confirmativa.

b)

Métodos de detección específica También se puede realizar la detección de C. burnetii en muestras por inmunodetección específica (enzimoinmunoensayo de captura [ELISA], inmunohistoquímica) o por amplificación del ADN (4, 6, 45). La inmunohistología se puede hacer con tejidos incluidos en parafina o en frotis fijados con acetona (28). El método consiste en una inmunofluorescencia indirecta o en un ensayo con inmunoperoxidasa usando anticuerpos policlonales frente a C. burnetii, procedentes de un antisuero bien caracterizado de origen humano o de un antisuero específico producido en animales de laboratorio (conejo o cobaya). Para visualizar la bacteria se usa luego un conjugado anti-IgG obtenido en otra especie (hombre, conejo o cobaya), que esté marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) o con peroxidasa. Se debe disponer para comparación de portas con preparaciones positivas de antígeno de C. burnetii. No existen anticuerpos específicos para inmunoquímica a nivel comercial. En la actualidad se están desarrollando varios métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y la PCR se ha usado con éxito para detectar ADN de C. burnetii en cultivos celulares y en muestras biológicas. Como es probable que el número de células de C. burnetii sea menor en la leche, en el calostro o en las heces que en el material derivado de abortos, la PCR se puede usar para analizar esta gran diversidad de muestras (2). Esta técnica puede realizarse en laboratorios con equipamiento adecuado utilizando cebadores derivados del gen IS1111, el más ampliamente usado, que codifica una transposasa (número de acceso M80806) (2). En el genoma están presentes al menos 19 copias de este gen (12). Los otros genes que pueden ser usados como diana en la PCR específica para C. burnetii son: el gen de la superóxido dismutasa (sodB) (número de acceso M74242); el gen com1, que codifica una proteína de 27 kDa de la membrana externa (número de acceso AB004712); y el operón de choque térmico que codifica dos proteínas de choque térmico (htpA y htpB) (número de acceso M20482). La PCR en tiempo real, de reciente desarrollo, supone un medio adicional de detección y cuantificación (43). Existe una necesidad urgente de desarrollar un método molecular para determinar la viabilidad bacteriana, especialmente en muestras de leche. El desarrollo de una PCR múltiple constituye otro auténtico desafío para ensayar todos los agentes infecciosos abortivos.

c)

Aislamiento del agente Para determinadas investigaciones de laboratorio, puede ser necesario aislar el agente. Cuando el examen microscópico revela un gran número de células de C. burnetii y un bajo nivel de contaminación con otras bacterias, es posible el aislamiento directo por inoculación de huevos de gallina embrionados o de cultivos celulares (11). Por ejemplo, se homogeniza una porción de la placenta en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga antibióticos (100-200 µg/ml de estreptomicina y 50-100 µg/ml de penicilina o gentamicina). Después de centrifugar a baja velocidad, se inoculan diluciones del sobrenadante en huevos de gallina embrionados de 5 días a través del saco vitelino. Preferiblemente, los huevos deben ser de gallinas libres de patógenos específicos (SPF). Los embriones que mueren durante los primeros 5 días después de la inoculación se desechan. Los sacos vitelinos se recogen después de 10-15 días de incubación. Los frotis del saco vitelino teñidos se examinan para comprobar la ausencia de contaminación bacteriana y determinar la presencia de C. burnetii. Para confirmar la presencia de C. burnetii se puede usar un análisis por PCR. Se pueden necesitar varios pases para obtener un aislamiento en cultivo puro. Para aislar bacterias estrictamente intracelulares, o intracelulares facultativas, incluyendo a C. burnetii, se ha adaptado un sistema de microcultivo celular disponible comercialmente para el cultivo de virus, el vial cerrado de cultivo celular 1 .Tal método se describió en 1990 para C. burnetii (6, 30). Se inoculan suspensiones de la muestra en fibroblastos de pulmón de embrión humano (células HEL) que se cultivan sobre un cubre de 1 cm2 dentro de un vial cerrado. La centrifugación a 700 g durante 1 hora favorece la fijación y la penetración de la bacteria en las células. Para la misma muestra se usan tres viales cerrados, y los días 3, 10 y 21 se examina el efecto citopático (ECP) -es decir, las características vacuolas de C. burnetii en las células HEL- mediante un microscopio invertido. En el cubre dentro del vial cerrado se puede realizar directamente a los 10 días la detección de C. burnetii creciendo dentro de las células, por medio de un ensayo de inmunofluoresencia directa con anticuerpos policlonales anti-C. burnetii y un

1

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Sterilin, Bibby Sterilin Ltd, Stone, Staffordshire ST15 O5A, Reino Unido.

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anticuerpo apropiado anti-especie conjugado con FITC. Las células del último vial cerrado se recogen y se transfieren a un recipiente de cultivo de 25 cm2. Se puede incubar durante 3 meses, cambiando el medio de cultivo una vez a la semana. La infección puede seguirse por microscopía de las células centrifugadas de un sobrenadante del cultivo y teñidas por la tinción de Gimenez y mediante análisis por PCR del sobrenadante del cultivo. Cuando las observaciones de ECP y las de la tinción de Gimenez, o los resultados de la PCR, son positivos, se realiza un pase a un recipiente de cultivo de 75 cm2. El sobrenadante se inocula luego en capas confluentes de células Vero o de células L929 de fibroblastos de ratón en un recipiente de cultivo de 150 cm2 para establecer un aislamiento de C. burnetii. Este método fue desarrollado para el caso de humanos pero podría adaptarse a animales (41). Con muestras muy multi-contaminadas, como las derivadas de placentas, descargas vaginales, heces o leche, puede ser necesaria la inoculación en animales de laboratorio. Los animales más apropiados a este respecto son los ratones y cobayas (36). Se controla la temperatura corporal y el estado de anticuerpos después de la inoculación intraperitoneal de una dosis de 0,5 ml por animal. Este método debería realizarse siempre en paralelo con pruebas serológicas en otros cobayas o ratones que se hayan inoculado con las mismas muestras. Si aparece fiebre, se sacrifica el animal y se recoge el bazo para aislar el agente por inoculación en huevos de gallina embrionados o en cultivos celulares. El examen microscópico de C. burnetii se lleva a cabo usando frotis y tinciones de los bazos recogidos. Alternativamente, se puede realizar PCR en los bazos recogidos sistemáticamente a los 7-9 días después de la inoculación (4). Aunque la caracterización de los aislamientos parece necesaria para comprender la variable epidemiología de la fiebre Q en diferentes áreas geográficas, no existen en la actualidad métodos diferenciadores de tipos. A este respecto, los esfuerzos deberían ir dirigidos al desarrollo de métodos para tipificación genética.

2.

Pruebas serológicas

Entre las diversas técnicas que pueden emplearse, las tres más usadas son: la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI), el método ELISA y la prueba de fijación de complemento (FC) (6). En el diagnóstico rutinario ya no se emplean tres pruebas serológicas más antiguas: la técnica de microaglutinación, la prueba de aglutinación capilar y la prueba de hemólisis indirecta. Se ha evaluado también una prueba de aglutinación con partículas de alta densidad (HDPA) (24). Los ensayos serológicos son adecuados para analizar poblaciones, pero la interpretación a nivel del animal individual puede resultar difícil. Los animales pueden permanecer seropositivos durante varios años después de una infección aguda, algunos pueden liberar C. burnetii y suponer un riesgo de infección antes de desarrollar anticuerpos, y otros animales infectados no parecen sufrir seroconversión (1, 3, 4). Los títulos serológicos de corte se indican más adelante; la interpretación de los resultados requiere el uso de al menos diez animales (abortados o no). Para establecer la presencia de infección se necesita tanto la respuesta serológica como la evidencia de las bacterias.

a)

Prueba de la inmunofluorescencia indirecta En medicina humana, el método de referencia para el serodiagnóstico de la fiebre Q es la prueba IFI adaptada como una técnica de microinmunofluorescencia (6, 46). El procedimiento se puede adaptar para realizar un ensayo de inmunoperoxidasa. Se dispone de algunos antígenos comerciales adecuados para uso en FC, pero son preferibles los antígenos preparados para diagnóstico en humanos (6). Se ha demostrado que este método de preparación suministra antígenos con la sensibilidad más alta para detectar anticuerpos frente a C. burnetii. En resumen, se utilizan antígenos de C. burnetii tanto de la fase I como de la fase II; el antígeno de la fase II se obtiene creciendo la cepa de referencia C. burnetii Nine Mile (ATCC VR 615) en cultivo celular, mientras que el antígeno de la fase I se obtiene del bazo de animales de laboratorio inoculados con C. burnetii en fase II en cultivos celulares. En la población en fase II aún pueden estar presentes unas cuantas células en fase I y pueden ser seleccionadas y propagadas dentro de los animales. El antígeno se diluye, se gotea en pocillos de un porta de vidrio para microscopio, se deja secar y se fija con acetona. Las dos formas de la infección, aguda y crónica, presentan perfiles serológicos distintos: durante la fiebre Q aguda, los anticuerpos IgG aumentan sólo contra la fase II, mientras que durante la fiebre Q crónica se observan niveles elevados de anticuerpos IgG contra la fase I y II de la bacteria (46). Además, se pueden comprar a suministradores portas con pocillos antigenados con antígeno de fase II 2 , o de fases I y II de C. burnetii 3 . Estos se pueden adaptar cambiando el conjugado humano por un conjugado adaptado a la especie animal. Se colocan diluciones dobles del suero a ensayar en un porta para inmunofluorescencia que contenga previamente uno o los dos antígenos. Si existen anticuerpos específicos, se fijan al antígeno en el porta. La

2 3

Coxiella burnetii-Spot IF, bioMérieux sa, Marcy-l´Etoile, Francia Q fever IFA Test Kits, MRL Diagnostics, Cypress, California, EE.UU.

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formación de este complejo se detecta luego en un microscopio de fluorescencia después de la adición del conjugado fluorescente que reconoce las inmunoglobulinas de esa especie. •

Preparación del antígeno

El antígeno debe prepararse en dependencias que cumplan los requisitos para patógenos del Grupo de Contención 3, como se describe en el Apéndice I.1.6.1. del Capítulo I.1.6. de este Manual. C. burnetii Nine Mile (ATCC VR 615) en fase II se cultiva en monocapas confluentes de células Vero o L929 en recipientes de cultivo de 150 cm2 con medio mínimo esencial (MEM) al que se adiciona glutamina 2mM y 4% de suero fetal bovino. La infección se sigue mediante examen microscópico de las células que se recogen de la parte inferior de los recipientes después de teñirlas por el método de Gimenez. Cuando se observa una gran infección por C. burnetii, se centrifugan individualmente los sobrenadantes de 15 recipientes (5.000 g, 15 minutos), se resuspenden en 1 ml de PBS con formaldehído al 0.1% y se mantienen 24 horas a 4°C. Después de juntar los sedimentos, se lisan por sonicación las células que queden. Los restos celulares se eliminan por dos centrifugaciones sucesivas (cada una a 100 g, 10 minutos). A continuación, la suspensión de 15 ml se centrifuga en 20 ml de PBS con 25% de sacarosa (6.000 g, 30 minutos sin interrupción). El sedimento que resulta se lava tres veces en PBS (6.000 g, 10 minutos), se resuspende en el menor volumen posible de agua destilada estéril y se ajusta por espectroscopía de luz UV a 2 mg/ml. Se añade azida sódica a una concentración final de 0,1% como conservante antibacteriano. El antígeno preparado de este modo se congela a –20°C. Para obtener antígeno correspondiente a la fase I, se inoculan ratones con la cepa de C. burnetii Nine Mile crecida en células (principalmente en fase II). Nueve días después se extraen los bazos. Cada uno se disgrega en 7,5 ml de MEM y se inocula en tres recipientes de cultivo de 75 cm2 con monocapas de células L929 o Vero (2,5 ml por recipiente). La amplificación de la fase I de C. burnetii se lleva acabo durante 4 semanas, cambiando el medio de cultivo una vez por semana. Después se recogen las células infectadas y se purifican las bacterias como se describe anteriormente (principalmente en fase I). La producción de antígeno también puede hacerse cultivando C. burnetii en huevos embrionados SPF. El microorganismo se inocula en el saco vitelínico de huevos embrionados de 5-6 días de edad, y se recogen luego a los 12-15 días después de la muerte del embrión. Los sacos vitelínicos infectados tienen un color amarillento pajizo característico. Los no infectados son de color naranja y presentan una consistencia viscosa. Cualquier embrión que muera entre los 5 y 10 días de incubación se elimina. La cepa usada en la inoculación de los huevos es una dilución al 1/100 de un homogenado de saco vitelínico en PBS con penicilina (500 Unidades Internacionales/ml) y estreptomicina (0,5 mg/ml). Los sacos vitelínicos se juntan y se homogenizan con tres partes de PBS. La suspensión se inactiva durante 24 horas a 37°C con formaldehído al 1,6%. El sobrenadante lipídico se desecha. La suspensión se centrifuga luego a una velocidad moderada (unas 500 g) durante 30 minutos. Se elimina el sobrenadante, se añade más PBS y se repite la centrifugación. La suspensión final se diluye con PBS. Se añade thiomersal a una dilución final de 1/10.000 como conservante antibacteriano. En los homogenados de los sacos vitelínicos suspendidos en PBS, se comprueba la abundancia de C. burnetii y la ausencia de contaminantes bacterianos por examen microscópico de un frotis sobre un porta y tinción por el método de Stamp. Para obtener antígeno de fase I, se puede propagar C. burnetii recogida de material del bazo de animales de laboratorio infectados, ya que estos extractos se transfieren a continuación a sacos vitelinos, pues la cantidad de células en fase I es todavía alta hasta el sexto pase en el vitelo (EP6). Es suficiente realizar la titulación del antígeno con al menos tres sueros diferentes conocidos (con título alto, moderado y bajo, respectivamente) para disponer de la dilución apropiada para otros ensayos de inmunofluorescencia. •

Materiales y reactivos

Microscopio equipado con fluorescencia, incubador con humidificador, pila de lavado. Se necesitan portas adecuados para el antígeno. Éste puede prepararse en el laboratorio o comprarse a un proveedor (véase más arriba). El método descrito está adaptado de la preparación comercial de BioMérieux a título de ejemplo. Los portas preparados contienen 12 pocillos por porta, cada uno de 7 mm de diámetro, recubiertos con antígeno de fase II obtenido de cultivos en células Vero y pueden guardarse a 4°C o a –20°C. Conjugado fluorescente concentrado, para ser diluido cuando sea necesario con PBS + azul de Evans al 1%, a las diluciones recomendadas por la casa comercial. PBS, glicerina tamponada, colorante azul de Evans en solución al 1%.

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Procedimiento de la prueba

i)

Inactivar el suero problema durante 30 minutos a 56°C, luego diluir en PBS de 1/40 a 1/640.

ii)

Dejar que los portas recubiertos con el antígeno tomen la temperatura ambiental. No tocar los pocillos.

iii)

Añadir a los pocillos 20 µl de cada dilución de suero. Añadir sueros de control positivo y negativo. A un pocillo, añadir como control de antígeno 20 µl de PBS.

iv)

Incubar en una cámara húmeda 30 minutos a 37°C. Lavar el porta dos veces con PBS durante 10 minutos cada vez. Lavar con agua destilada y dejar secar al aire.

v)

Añadir a los pocillos, incluyendo los de los controles, 20 µl de conjugado dirigido contra la especie apropiada (por ejemplo, anticuerpos obtenidos en conejo contra IgG [H+L] de cabra u oveja marcados con FITC), diluidos en el momento en PBS + azul de Evans. Incubar en una cámara húmeda 30 minutos a 37°C. lavar con agua destilada y secar al aire. Añadir unas cuantas gotas de glicerina tamponada y tapar con un cubre. Examinar en un microscopio de fluorescencia con aumentos de x40 o más.

•

Interpretación de los resultados

Una reacción positiva se manifiesta por la presencia de pequeños puntos brillantes en un fondo oscuro. Hay que comprobar que el conjugado solo y el control de suero negativo dan un resultado negativo (ausencia de los pequeños puntos brillantes). La fluorescencia inespecífica suele tomar forma de manchas de tamaño irregular. El control positivo debe corresponder al título conocido + un orden de dilución. La reacción se considera positiva si aparece inmunofluorescencia a dilución 1/160 o mayor. En medicina humana, este método se usa para determinar anticuerpos contra las fases I y II en las fracciones de IgG, IgM e IgA, lo que permite la diferenciación entre la forma aguda y la crónica de la fiebre Q. Para eliminar las IgG antes de determinar las IgM e IgA se usa absorbente de factor reumatoide. El análisis de los sueros se realiza con antígeno de la fase II, y los sueros positivos se ensayan después para detectar la presencia de las diferentes clases de Ig dirigidas contra los antígenos de la fase I y la II. No obstante, ni las respuestas de anticuerpos a las fases I y II ni las respuestas de las clases de Ig implicadas se han estudiado con detalle en los animales domésticos.

b)

Prueba de fijación de complemento Este micrométodo de fijación en frío, de tipo semejante al desarrollado por Kolmer, se realiza en placas de microtitulación con 96 pocillos de fondo cóncavo. La prueba detecta la presencia en el suero de anticuerpos fijadores de complemento. Esta prueba FC es específica, pero menos sensible que la IFI o ELISA (6, 25). La seroconversión se detecta por la prueba FC más tarde que por la prueba IFI o ELISA, aunque los anticuerpos FC pueden persistir durante largos períodos después de la enfermedad y esta prueba da resultados excelentes para diagnóstico rutinario de enfermedades abortivas a nivel de poblaciones (32, 34). En muchos países la prueba FC es aún muy usada por muchos laboratorios. Con frecuencia en este método se utiliza antígeno en fase II preparado a partir de una mezcla de dos cepas (Nine Mile y Henzerling) 4 . En Francia, este método está estandarizado (AFNOR-NFU47-006). La reacción se hace en dos etapas. Primero se mezcla el antígeno con los anticuerpos fijadores de complemento, y se añaden eritrocitos de oveja que están sensibilizados por suero anti eritrocitos de oveja. Durante el primer paso, la fijación del complemento por el complejo antígeno/anticuerpo no permite la lisis de los eritrocitos; por el contrario, si no existen anticuerpos fijadores de complemento, el complemento induce entonces la lisis de los eritrocitos sensibilizados, Por consiguiente, la velocidad de hemolisis es inversamente proporcional al nivel de anticuerpos específicos que están presentes en la muestra de suero. •

Reactivos

Tampón Veronal/calcio/magnesio (VB), pH 7.2 El sistema hemolítico: una mezcla a partes iguales de una suspensión de eritrocitos de oveja al 2% en VB y de suero hemolítico diluido en VB según su título específico. Complemento: preparación comercial liofilizada de suero fresco de cobaya. Antígeno: Usar antígenos comerciales al título recomendado por el fabricante, si la titulación del antígeno se realiza por este método. Los resultados pueden variar de un antígeno a otro, y son preferibles los antígenos preparados de varias cepas (ovinas, bovinas y humanas) o de cepas autóctonas.

4

Dade Behring, Marburg, Alemania

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Capítulo 2.2.10. — Fiebre Q

Controles de suero positivo y negativo. •

Pre-titulaciones

i)

Diluir los etritrocitos de oveja a una concentración final de 2% en VB.

ii)

Titular el suero hemolítico en una microplaca: 25 µl de complemento a una concentración hemolítica conocida (por ejemplo, 1/30); 25 µl de diluciones crecientes de suero hemolítico + eritrocitos de oveja al 2%. Incluir controles sin complemento. Incubar 30 minutos a 37°C. Establecer la dilución equivalente a 2 unidades hemolíticas.

iii)

Diluir el antígeno como recomienda el fabricante. El antígeno puede también titularse: hacer diluciones crecientes de antígeno (25 µl horizontalmente) y un suero positivo de título conocido (25 µl verticalmente). Añadir 25 µl de la suspensión de eritrocitos sensibilizados e incubar 30 minutos a 37°C. El título del antígeno es la dilución más alta que produce una reacción positiva con la dilución más alta del suero. Comprobar a diferentes diluciones la ausencia de actividad anti-complementaria del antígeno.

iv)

Titular el complemento en una microplaca: hacer diluciones seriadas del complemento o del suero de cobaya en VB, por ejemplo de 1/15 a 1/200. A cada pocillo con 25 µl de esta dilución, añadir 25 µl de antígeno y 25 µl del sistema hemolítico. Incubar 30 minutos a 37°C y establecer la dilución equivalente a 2 unidades hemolíticas de complemento.

•

Procedimiento de la prueba

i)

En seis pocillos hacer diluciones dobles de 1/10 a 1/320 del suero problema inactivado (con el complemento eliminado) y en otros cuatro pocillos a diluciones de 1/10 a 1/80 para detectar actividad anti-complementaria (25 µl por pocillo) (pocillos control de suero).

ii)

Añadir 25 µl de antígeno diluido o 25 µl de VB a los pocillos de control de suero.

iii)

Añadir 25 µl de complemento a todos los pocillos. Cubrir la placa con una lámina de plástico adhesivo e incubar 18 horas a 4°C.

iv)

Sacar las placas del refrigerador, dejarlas que alcancen la temperatura ambiente, y añadir 25 µl de sistema hemolítico recién preparado. Incubar a 37°C durante 30 minutos. Centrifugar las placas a 500 g durante 5 minutos a 4°C. Examinar los controles y leer los resultados.

•

Interpretación de los resultados

Los títulos comprendidos entre 1/10 y 1/40 son característicos de una infección latente. Los títulos de 1/80 o más, en uno o más sueros de un grupo de cinco a diez animales, revelan una fase evolutiva de la infección.

c)

Enzimoinmunoensayo Esta técnica presenta una alta sensibilidad y una buena especificidad (6, 31, 48). Es fácil de realizar en laboratorios que tienen el equipo necesario (un espectrofotómetro) y reactivos. Las pruebas ELISA tienden a reemplazar a las pruebas IFI y FC como técnicas de elección porque son adecuadas para análisis a gran escala y, en particular, para los diagnósticos en Veterinaria, ya que es una técnica fiable para demostrar anticuerpos contra C. burnetii en varias especies animales (13,40). Requiere un antígeno relativamente puro. Para recubrir las placas pueden usarse los antígenos preparados para la prueba FC. Existen preparaciones comerciales disponibles que pueden detectar anticuerpos contra la fase II o contra la fase I y II 5,6 . Está en fase de desarrollo la obtención de preparaciones de ELISA capaces de distinguir entre los anticuerpos contra la fase I y contra la fase II. Los pocillos de la microplaca se recubren con el antígeno de células enteras de C. burnetii inactivado. Se añaden a los pocillos muestras de suero diluido que reacciona con los antígenos unidos al soporte sólido. El material no unido se elimina mediante lavado después de un período adecuado de incubación. El conjugado (Ig anti-rumiante marcada con peroxidasa de rábano) reacciona con los anticuerpos específicos unidos al antígeno. El exceso de conjugado que no reacciona se elimina mediante lavado después de un período adecuado de incubación. Se añade el substrato del enzima. La velocidad de conversión del substrato es proporcional a la cantidad de anticuerpos unidos. La reacción se termina después de un período adecuado de tiempo y el color desarrollado se mide espectrofotométricamente. •

Materiales y reactivos

Placas de microtitulación con 96 pocillos de fondo plano, recién recubiertas o recubiertas de antemano con antígeno de la fiebre Q; lector de microplacas (espectrofotómetro; filtros de 405 y/o 492 nm); incubador con 5 6

428

CHEKIT-Q-Fever EIA kit, Intervet (Bommeli Diagnostics), Liebefeld-Bern, Suiza Q fever IgG o IgM ELISA kits, PanBio Pty Ltd, Brisbane, Australia.

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Capítulo 2.2.10. — Fiebre Q

humidificador a 37°C; pipetas de 8 y 12 canales con puntas desechables de plástico; agitador de microplacas (opcional). Sueros control positivos y negativos; conjugado (inmunoglobulina anti-rumiante marcada con peroxidasa); diluyente diez veces concentrado (PBS-Tween); agua destilada; substrato o cromógeno (OPD [ortofenilén diamina], ABTS [2,2´-azino-bis-(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico] para la peroxidasa); peróxido de hidrógeno. •

Procedimiento de la prueba

i)

Diluir las muestras de suero, incluyendo los sueros control, a una dilución apropiada (normalmente 1/100) y distribuir por duplicado 0,1 ml por pocillo. Los sueros control son sueros positivos y negativos suministrados por el fabricante y un suero positivo de referencia interna del laboratorio para comparar los títulos en ensayos diferentes.

ii)

Cubrir la placa con tapa e incubar a temperatura ambiente durante 30-90 minutos. Vaciar el contenido y lavar tres veces a temperatura ambiente con solución de lavado.

iii)

Añadir a los pocillos la dilución adecuada de conjugado recién preparado (0,1 ml por pocillo).

iv)

Cubrir cada placa e incubar como en el paso ii. Lavar de nuevo tres veces.

v)

Añadir a cada pocillo 0,1 ml de substrato cromogénico recién preparado (por ejemplo: OPD [0.1 mg/ml] en ácido acético 0,1 M, PO4HNa2 0,2 M, pH 4,8, y solución de H2O2 al 30% [0,2 µl/ml]; o ABTS 0,25 mM en tampón citrato fosfato, pH 5,0, y solución de H2O2 al 30% [0,1 µl/ml]).

vi)

Agitar la placa; después de incubar, detener la reacción añadiendo a cada pocillo solución de parada, por ejemplo, 0,05 ml de ácido sulfúrico 3M para la peroxidasa o 10% de dodecilsulfato sódico para ABTS.

vii)

Leer la absorbancia de cada pocillo con el lector de microplacas a 405 nm (ABTS) o a 492 nm (OPD). Los valores de absorbancia se usan para calcular los resultados.

•

Interpretación de los resultados

En el caso de preparaciones comercializadas, las interpretaciones y los valores se suministran con la preparación. Por ejemplo: calcular la absorbancia media (Ab) de la muestra de suero y de los sueros control positivos (Abpos) y negativos (Abneg), y calcular el porcentaje para cada suero:

Ab - Ab neg x 100 Abpos - Abneg Intrepretar los resultados del siguiente modo: Ab 40% suero positivo

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO. 1.

Vacuna

La vacunación es la estrategia más lógica para evitar la fiebre Q en sujetos y en ganados expuestos. Sólo se puede preparar una vacuna contra C. burnetii cuando lo hace una plantilla entrenada y en condiciones adecuadas de protección (como mínimo en un laboratorio de nivel 3 de bioseguridad). Se recomienda obtener la vacuna de fabricantes capaces de completar y certificar pruebas sobre seguridad, inactivación y esterilidad. Las directrices para la producción de vacunas veterinarias se presentan en el Capítulo I.1.7. Principios de producción de vacunas veterinarias. Las normas dadas aquí y en el Capítulo I.1.7 intentan ser de naturaleza general y se pueden suplementar con requisitos nacionales y regionales. En algunos países, se practica la vacunación para personal sujeto a exposición ocupacional, como trabajadores de mataderos, veterinarios y personal de laboratorio. En 1989 las autoridades australianas aprobaron una vacuna inactivada con formaldehído (Q-VAX, CSL Ltd, Australia) preparada a partir de la cepa Henzerling de C.

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Capítulo 2.2.10. — Fiebre Q

burnetii en fase I (19). Las vacunas de fase I son más eficaces, pero está contraindicada la vacunación de individuos con seroconversión o expuestos a C. burnetii antes de la inmunización. Se han desarrollado varias vacunas contra la fiebre Q animal. Hasta la fecha, los resultados son más favorables hacia el uso de una vacuna de fase I, ya que las vacunas de fase II son 100 veces menos eficaces que las de fase I en evitar la colonización del bazo de ratón (7). En Eslovaquia existe una vacuna comercial inactivada de fase I para la vacunación del ganado. Un estudio sobre la fiebre Q en Eslovaquia sugiere que el descenso en los casos de fiebre Q en el hombre y en los animales podría deberse a la vacunación a gran escala realizada allí en el ganado durante 10 años, y a las mejoras en el control veterinario del transporte de animales dentro del país (37). La vacuna contiene un antígeno muy purificado de la cepa Nine Mile en fase I (pases de cultivo 2 a 6 en huevo) e inactivado con formaldehído. Recientemente, un estudio ha demostrado la eficacia de esta vacuna en Francia mediante vacunación y posterior infección experimental de cabras gestantes: la vacuna evitó el aborto y la liberación del agente en la leche, disminuyendo considerablemente la liberación en las secreciones vaginales y en las heces (4). En teoría, la eficacia de la vacuna se debe demostrar por pruebas en todas las especies a las que puede ir dirigida. En el caso de vacunación de animales ya infectados, no se dispone de información sobre posibles efectos adversos ni sobre la liberación del agente de la fiebre Q. Por consiguiente, algunos autores piensan que resulta preferible seleccionar para la inmunización las explotaciones o los animales seronegativos, y continuar en los animales jóvenes la vacunación durante varios años (15). Hasta ahora, no existen datos comparativos de costebeneficio de esta estrategia respecto a una estrategia no selectiva en el control de la fiebre Q.

2.

Materiales de diagnóstico

Ver Sección B.2.a. (Preparación de antígeno).

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