CARACTERIZACIÓN, ANÁLISIS ESPACIAL Y MANEJO INTEGRADO DEL MOHO BLANCO (Sclerotinia minor Jagger y S. sclerotiorum (Lib.) de Bary) EN LECHUGA BATAVIA (Lactuca sativa L. var. capitata L.) EN LA VEREDA LA MOYA (COTA - CUNDINAMARCA)

ALEXANDER SMITH MAY

TRABAJO DE GRADO Presentado Como Requisito Parcial Para Optar al Título de

Microbiólogo Agrícola y Veterinario

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA Bogotá, D. C. 14 de febrero, 2007

NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la resolución no. 13 de Julio de 1946: “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velara por que no se publique nada en contra al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ella el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

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A Dios y mis padres por todo

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AGRADECIMIENTOS A Jaime Jiménez Gómez, coordinador del programa Manejo Integrado de Plagas (MIP) del Centro de Investigaciones y Asesorías Agroindustriales de la Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano (CIAA - UJTL) por haberme dado la oportunidad de trabajar en su grupo de investigación, sus enseñanzas y apoyo durante el desarrollo del presente trabajo. Al Instituto Colombiano Para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología “Francisco José de Caldas” (COLCIENCIAS) y el CIAA - UJTL por la financiación de este trabajo dentro del proyecto 898 w. A Rodrigo Gil Castañeda, investigador del programa MIP del CIAA - UJTL por su colaboración, dedicación en los análisis estadísticos, enseñanzas e intención para realizar un buen trabajo. A Clemencia Forero de La Rotta, docente asistente del departamento de Microbiología de la Pontificia Universidad Javeriana (PUJ) por sus enseñanzas y buenos consejos. A Roberto García Tauta, señora madre María Emma Tauta de García q.e.p.d. y familia por haber permitido el desarrollo de está investigación dentro de sus predios, y de igual forma por haberme cobijado dentro de su núcleo familiar, compartiendo experiencias gratas. Así mismo a los agricultores del municipio productor de Cota y a la Unidad Municipal de Asistencia Técnica Agropecuaria (UMATA). A Ligia Espinosa Blanco, investigadora y demas personal en el programa MIP del CIAA - UJTL; María Romero Pinto, investigadora programa Agricultura Sostenible CIAA - UJTL; Juan Carlos Bernal, Cristina Díaz Mora y Eudoro Mora Jiménez, operarios del CIAA - UJTL por su cooperación, y en general a todos los miembros del CIAA - UJTL que tuvieron una disposición a ayudar.

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A Bernardo Chaves Córdoba, docente asociado a la facultad de Agronomía en la Universidad Nacional de Colombia (UN) por su asesoría estadística. Al personal del laboratorio de Control Biológico de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (CORPOICA) en Tibaitatá por proveer la cepa antagónica. A Rocío Parra Ávila, estudiante de Ingeniería Agrónoma de la UN y German Menza Alos, estudiante de Microbiología Agrícola y Veterinaria de la PUJ por su colaboración. A Martha Bohórquez Castañeda, docente asociada al departamento de Estadística y Matemáticas de la UN por sus enseñanzas en lo referente a la geoestadística. A Daniel Carrillo Quiroga, (c) M.Sc. Universidad de Florida por su apoyo durante la planeación inicial del presente trabajo. A Gloria García Londoño, Aura Rosa Monascero Gómez y Henry Córdoba Ruiz, docentes de la PUJ, a quienes siempre estaré agradecido por su valiosa ayuda durante mi inicio en la PUJ. A mis hermanos Vida y Jack Smith May, mi familia y mi amigo Carlos Rodríguez Prieto por ofrecerme su colaboración, el apoyo espiritual y moral. Igualmente a Sonia, Juan Carlos, Otto, Verónica, María Alejandra y sobre todo a Margarita. Finalmente, a la comunidad educativa de la PUJ a quien agradezco la vivencia y formación, al igual que a todas aquellas personas que de alguna u otra manera contribuyeron a la obtención de este logro.

14 de febrero, 2007

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TABLA DE CONTENIDO Resumen………………………………………………………………..…………….........15 Abstract……………………………………………………………………………………..16 1. Introducción……………………………………………………………………..……….17 2. Marco teórico y revisión de literatura…………………………………………………19 2.1. La lechuga……………………………………………………………………………..19 2.2. Producción de lechuga en Colombia……………………………………………….20 2.3. Enfermedades limitantes para el cultivo…………………………………………...20 2.4. Patogénesis, síntomas y signos del moho blanco…………..……………………21 2.5. Etiología del moho blanco..…….……………………………………………………23 2.6. Hospederos de Sclerotinia spp...……………………………………………………25 2.7. Epidemiología y ciclo de vida..………………………………………………...……26 2.7.1. Factores de distribución del inoculo......…………………………………….……30 2.7.1.1. Geoestadística...………………………………………………………………….31 2.8. Manejo integrado del moho blanco...………………………………………………32 2.8.1. Humedad..….……………………………………………………………………….32 2.8.2. Malezas.....…………………………………………………………………….…….32 2.8.3. Rotaciones....…………………………………………………………………..……33 2.8.4. Restos de cultivos anteriores…………………………………………………...…33 2.8.5. Manejo cultural………………………………………………………………...……33 2.8.5.1. Desinfección del suelo………………………………………………………...…33 2.8.5.1.1. Solarización del suelo..………………………………………………………..34 2.8.6. Manejo químico....………………………………………………………………….34 2.8.7. Manejo biológico.…………………………………………………………………...34 2.8.8. Manejo botánico....…………………………………………………………………35 3. Formulación del problema y justificación……………………………………..………37 4. Objetivos…………………………………………………………………………..……..38 4.1. Objetivo general………………………………………………………………………38 4.2. Objetivos específicos…………………………………………………………………38 5. Hipótesis…………………………………………………………………………………39 5.1. Hipótesis 1……………………………………………………………………………..39 5.2. Hipótesis 2…………………………………………………………………………..…39

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5.3. Hipótesis 3……………………………………………………………………………..39 6. Materiales y métodos…………………………………………………………………...40 6.1. Zona de estudio………………………………………………………………….……40 6.2. Diseño experimental…………………………………………………………….……41 6.3. Muestreo espacial……………………………………………………………….……41 6.3.1. Aislamiento y cuantificación de esclerocios…………………………………..…42 6.3.1.1. Identificación morfológica.…………………………………………………….…43 6.3.1.2. Prueba de patogenicidad...……………………………………………………...43 6.3.2. Análisis espacial………………………………………………………………….…44 6.4. Manejo integrado del moho blanco………………………………………..……….46 6.4.1. Solarización del suelo……………………………………………………...………46 6.4.1.1. Efecto de la solarización del suelo en la población de malezas…..………..47 6.4.1.2. Establecimiento del cultivo………………………………………………………48 6.4.1.3. Efecto de la solarización del suelo en la población de esclerocios…………49 6.4.2. Productos para el control…………………………………………………………..49 6.4.2.1. Selección de extractos vegetales…………………………………………..…..49 6.4.2.2. Selección del biocontrolador……………………………………………….……51 6.4.2.3. Selección del producto químico…………………………………………….......51 6.4.2.4. Aplicación de productos.…………………………………………………….......51 6.5. Evaluaciones……………………………………………………………………….….52 6.6. Análisis estadístico..………………………………………………………………….53 6.6.1.

Valor

del

Área

Bajo

la

Curva

de

Progreso

de

la

Enfermedad

(ABCPE)…………………………………………………………………………………….53 6.6.2. Modelación……………………………………………………………………..……54 7. Resultados y discusión…………………………………………………………...…….55 7.1. Identificación de Sclerotinia spp....……………………………………………….…55 7.2. Prueba de patogenicidad …...……………………………………………………….58 7.3. Análisis espacial………………………………………………………………………59 7.3.1. Abundancia de esclerocios……………………………………………………..…59 7.3.2. Correlación espacial……………………………………………..………………...61 7.4. Manejo integrado del moho blanco…………………………………………………65 7.4.1. Efecto de la solarización del suelo………………………………..………………65 7.4.1.1. Efecto de la solarización del suelo en la población de malezas………..…..66

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7.4.1.2. Efecto de la solarización del suelo en la población de esclerocios……..….67 7.4.2. Efecto de diferentes productos en el control del moho blanco..………………69 7.4.2.1. Valor del ABCPE…………………………………………………………………69 7.4.2.2. Modelación.………………………………………………………………............78 7.5. Impacto social derivado de está investigación...…………………………………..83 8. Conclusiones…………………………………………………………….………………85 9. Recomendaciones………………………………………………………………………86 10. Literatura citada………………………………………………………………………..88 11. Anexos……………………………………………………………………..……........116 11.1. Anexo 1: Medios de cultivo……………………………………………………….116 11.2. Anexo 2: Distribución de los materos en las pruebas de patogenicidad…….117 11.3. Anexo 3: Propiedades de la turba……………………………………..…………118 11.4. Anexo 4: Distribución de las parcelas………...……………………...…….……119 11.5. Anexo 5: Análisis de Fertilidad en Suelo…………………………………….….120 11.6. Anexo 6: Ficha técnica lechuga Batavia…………………………………...……122 11.7. Anexo 7: Características del prototipo de producto granulado: T. koningii Th003...…..…….……….…………………………………………………………………125 11.8. Anexo 8: Ficha técnica fungicida comercial (i.a. Procimidona)……………….126 11.9. Anexo 9: Número total de esclerocios de S. minor y S. sclerotiorum.....…….128 11.10. Anexo 10: Análisis estadístico de la grilla para la distribución espacial de esclerocios de S. minor.…………………………………………………………………131 11.11. Anexo 11: Análisis estadístico de la grilla para la distribución espacial de esclerocios de S. sclerotiorum.……………………………………………….………...134 11.12. Anexo 12: Análisis estadístico para las temperaturas registradas durante la solarización del suelo……….……………………………………………………………137 11.13. Anexo 13: Análisis estadístico para la población de malezas después de la solarización del suelo……………………………………………………...…………….138 11.14. Anexo 14: Análisis estadístico para la población de esclerocios después de la solarización del suelo..………………………………………………….……………….139 11.15. Anexo 15: Análisis estadístico para el valor del ABCPE…………………….140

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LISTA DE ANEXOS Anexo 1: Medios de cultivo……………………………………………………………...116 Anexo 2: Distribución de los materos en las pruebas de patogenicidad…………...117 Anexo 3: Propiedades de la turba………………………………………………………118 Anexo 4: Distribución de las parcelas………………………………………………….119 Anexo 5: Análisis de fertilidad en suelo.……………………………………………...120 Anexo 6: Ficha técnica lechuga Batavia……………………………………………….122 Anexo 7: Características del prototipo de producto granulado: T. koningii Th003……………………………………………………………………………….……..125 Anexo 8: Ficha técnica fungicida comercial (i.a. Procimidona)……………………...126 Anexo 9: Número total de esclerocios de S. minor y S. sclerotiorum………………128 Anexo 10: Análisis estadístico para la distribución espacial de esclerocios de S. minor………………………………………….....…………………………………………131 Anexo 11: Análisis estadístico para la distribución espacial de esclerocios de S. sclerotiorum……………………………………………………………….…….………...134 Anexo 12: Análisis estadístico para las temperaturas registradas durante la solarización del suelo...……………………….……………………………………...….137 Anexo 13: Análisis estadístico para la población de malezas..………….………….138 Anexo 14: Análisis estadístico para la población de esclerocios después de la solarización del suelo..…………......……………………………………………………139 11.15. Anexo 15: Análisis estadístico para el valor del ABCPE.…………………....140

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LISTA DE FIGURAS Figura 1: Ancestro de la lechuga..……………………………………………………….19 Figura 2: Cultivos de lechuga....………………………………………………………….20 Figura 3: Etapas de aparición de los síntomas durante el ciclo de la lechuga.…..…22 Figura 4: Esclerocios y germinación en Sclerotinia spp..........………………………..25 Figura 5: Zona de competencia de S. minor...….…………….……………...…………28 Figura 6: Apotecios e infección en diferentes hospederos....………………...……….28 Figura 7: Ciclo de vida de Sclerotinia spp…..............................................................29 Figura 8: Vista panorámica de la zona rural en el municipio de Cota………………..40 Figura 9: Franja de estudio……………………………………………………………….41 Figura 10: Muestreo espacial de suelo..………………………………………………...42 Figura 11: Distribución de las plantas en las pruebas de patogenicidad.…………...44 Figura 12: Semivariograma teórico, según un modelo esférico………………………46 Figura 13: Solarización del suelo………………………………………………………...47 Figura 14: Establecimiento del cultivo…………………………………………………...48 Figura 15: Efecto de diferentes dosis del extracto vegetal de ajo sobre el RCM de S. sclerotiorum………....................................................................................................50 Figura 16: Preparación y aplicación de productos para el control del moho blanco........................................................................................................................52 Figura 17: Esclerocios……………………………………………………………………..56 Figura 18: Colonias de S. minor y S. sclerotiorum..……………………………………56 Figura 19: Colonia de Fusarium spp. asociada con el crecimiento de esclerocios en S. minor……………………………………………………………………………………..58 Figura 20: Pruebas de patogenicidad……………………………………………………59 Figura 21: Semivariogramas omnidireccionales………………………………………..62 Figura 22: Mapas en 3D de superficie del patrón de distribución espacial de esclerocios…….……………………………………………………………..……………..63 Figura 23: Promedio de temperaturas máximas registradas en las parcelas con y sin solarización…………………………………………………………………………………66 Figura 24: Efecto de la solarización del suelo en las malezas………………………..67 Figura 25: Valor del ABCPE en cada uno de los tratamientos en las parcelas con y sin solarización……………………………………………………………………………..70

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Figura 26: Síntomas característicos del moho blanco…………………………………80 Figura 27: Apotecios e infección carpogénica en lechuga…………………………….81 Figura 28. Taller participativo..……………………………………………………………83 Figura 29. Principales agentes fitosanitarios en Cota…………………..…………….84 Figura 30. Principales cultivos dados en Cota.…………………………..……………..84 Figura 31. Preferencia por el sitio de investigación….…………………………………84

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LISTA DE TABLAS Tabla 1: Tratamientos……………………………………………………………………..52 Tabla 2: Abundancia de esclerocios……………………………………………………..60 Tabla 3: Parámetros del semivariograma……………………………………………….61 Tabla 4: Relación varianza-media………………………………………………………..62 Tabla 5: Temperaturas en las parcelas con y sin solarización………………………..65 Tabla 6: Abundancia de esclerocios de S. minor en las parcelas con y sin solarización…………………………………………………………………………………68 Tabla 7: Análisis de contrastes ortogonales para el valor del ABCPE en cada uno de los tratamientos..…………………………………………………………………………...70 Tabla 8: UFC/g de suelo de Trichoderma spp. en las parcelas principales.………...73 Tabla 9: Valores de los parámetros estimados en el Modelo Logístico……………..82 Tabla 10: Análisis de contrastes ortogonales de los parámetros del Modelo Logístico…………………………………………………………………………………….82

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RESUMEN La principal enfermedad asociada al cultivo de lechuga en Cota, es el moho blanco (Sclerotinia spp.) debido al inapropiado manejo. En un lote comercial con alta prevalencia del moho blanco, se identifico las especies y el patrón de distribución espacial de sus esclerocios. Seguido por la evaluación de productos ecológicos solos y en conjunto con la solarización del suelo para el control del moho blanco. Las especies se identificaron según caracteres morfológicos y patológicos. El análisis espacial se desarrollo desde un muestreo sistemático de 96 muestras de suelo. Las estrategias de control se evaluaron a partir del establecimiento de un diseño de parcelas divididas. La parcela principal constituyó el uso de la solarización del suelo y las subparcelas productos ecológicos (extractos vegetales y Trichoderma koningii Th003), un testigo comercial (i.a. Procimidona) y un testigo absoluto. Los tratamientos tuvieron cinco repeticiones. Se evaluó el efecto de solarización en la reducción de esclerocios. Al igual que en conjunto con los productos, comparando la eficacia, con el testigo comercial. Semanalmente, desde transplante hasta cosecha, se evalúo la incidencia sobre 28 plantas/tratamiento. Con los valores se construyeron curvas de progreso de la enfermedad para cada tratamiento. Se calculó el Área Bajo la Curva de Progreso de la Enfermedad (ABCPE) de cada repetición. Adicionalmente, se ajustaron las curvas al Modelo Logístico, analizando tres parámetros: máxima incidencia, tiempo para el alcance de la tasa máxima y tasa máxima de desarrollo de la enfermedad. Los valores de ABCPE y cada uno de los parámetros del modelo se compararon mediante una prueba de t. Se identificó S. minor y S. sclerotiorum como especies presentes. Ambas especies, presentan un patrón de distribución agregado, con predominacia de S. minor. La solarización redujo la población de esclerocios y malezas. El mejor control se obtuvo con Procimidona, seguido por T. koningii Th003.

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ABSTRACT White mold (Sclerotinia spp.) is the main disease in lettuce crop, within Cota municipality (ubicated north west from Bogotá, D. C. - Colombia) due to inappropriate management. In a commercial field with a high prevalence of white mold, species were identified and determined their spatial sclerotia distribution. Followed by the evaluation of several ecological products with and without soil solarization for white mold control. Those species were identified by means of morphological and pathological characters. Spatial analyses were performed by means of systematic soil sampling. Statistical design for control strategies were assessed by a split plot settling, with the treatments: with and without soil solarization in the main plot and randomized subplots with ecological products (vegetal extracts and Trichoderma koningii Th003), a commercial control (a.i. Procymidone) and a control, with five repetitions. Solarization effect was assessed by the reduction of sclerotia from soil and altogether with each product for the control of white mold. The incidence of the disease was evaluated in a population of 28 plants per repetition, for each particular treatment. Assessment was performed weekly, starting from the time of transplant and going on until the harvest. Disease progress curves were built based on disease incidence values. The Area Under the Disease Progress Curves (AUDPC) for each replica was estimated and furthermore those curves were made fit to the logistic model, analyzing three parameters: Maximum disease incidence, time to reach the maximum disease rate and the maximum development of disease rate. The value of AUDPC and each parameter were compared by means of a t test. S. minor and S. sclerotiorum were identified. Both species have an aggregated spatial distribution. Solarization reduced sclerotia and the thriving of weeds. The best control was achieved by means of Procymidone, followed by T. koningii Th003.

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1. INTRODUCCIÓN El moho blanco de la lechuga es una enfermedad de distribución mundial que afecta a todas las variedades de lechuga. En Colombia la producción de lechuga se concentra principalmente en el departamento de Cundinamarca. Donde el municipio de Cota es uno los principales productores de está y otras hortalizas. Pero en los últimos años ha disminuido la producción de lechuga, debido al aumento en la prevalencia del moho blanco. El moho blanco es causado por dos especies emparentadas: Sclerotinia minor y S. sclerotiorum caracterizados por originar los mismos síntomas, pero a través de diferentes mecanismos de infección, como el contacto de tejido vegetal con las estructuras de resistencia y reproducción (esclerocios y ascosporas) producidas por ambas especies de Sclerotinia spp. Las especies se diferencian por la forma y el tamaño de los esclerocios. Los cuales son redondos y de menor tamaño en S. minor, mientras en S. sclerotiorum son irregulares y más grandes. Contrario a S. minor, la formación de apotecios y la poca formación de esclerocios frecuentemente se presentan en S. sclerotiorum. Las estructuras, principalmente esclerocios, pueden permanecer viables en el suelo durante varios años, originando diferentes patrones de distribución espaciotemporal, producto de la reincorporación de los esclerocios y restos de plantas enfermas por las prácticas culturales inadecuadas realizadas por los agricultores y de igual forma por procesos naturales. De está forma el inoculo de Sclerotinia spp. puede ser distribuido entre lotes y permanecer latente dentro de un lote de cultivo, dificultando el manejo de la enfermedad. La mayoría de los agricultores que continúan el cultivo, utilizan métodos de control inapropiados, principalmente la sobre aplicación de fungicidas comerciales, ya que muchas veces, el i.a. no está formulado contra Sclerotinia spp. De está forma el producto final se satura de moléculas sintéticas, hay un aumento en los costos de producción y la prevalencia del moho blanco aumenta. El conocimiento de la

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distribución espacial de esclerocios de Sclerotinia spp. contribuiría en el desarrollo de planes de muestreo y manejo del moho blanco en combinación con la aplicación de un i.a. eficaz en el control de Sclerotinia spp. De aquí, que la evaluación de métodos de control ecológicos, como la solarización del suelo en combinación con la aplicación de extractos vegetales o T. koningii Th003, comparando la efectividad de estos productos con un fungicida comercial (i.a. Procimidona), contribuiria a la estructuración de un plan de manejo integrado del moho blanco.

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2. MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA

2.1. La lechuga La lechuga pertenece a la familia Asteraceae (anteriormente Compositae). Se cree que su origen está en el mediterráneo, debido a la existencia de una forma silvestre (Figura 1), comúnmente llamada lechuga irritante (L. serriola L.) y por las pinturas parecidas a lechugas tipo espárrago (similares a las que se cultivan hoy día en Egipto) que datan de hace 4500 años a. C. en tumbas egipcias (Mejía et al., 2003 y Ryder, 1996).

U.S. Geological Survey

Figura 1. Ancestro de la lechuga

Fue conocida en Grecia, Persia y Roma por su gastronomía y sus propiedades medicinales. Posiblemente los romanos extendieron su cultivo hacía el norte y oeste de Europa, en donde se produjeron diferentes variedades. Así, la lechuga Batavia probablemente fue desarrollada a partir de un ancestro que formaba cabezas rudimentarias bajo condiciones climáticas frías (Mejía et al., 2003 y Ryder, 1996). En América, donde su cultivo se ha difundido aceleradamente (Ryder, 1996), fue introducida por los primeros colonizadores. El mayor productor a nivel mundial son los EE.UU., con los estados de Arizona y California (Ryder, 1996 y Subbarao, 1998). En Colombia, según el Anuario Estadístico de Frutas y Hortalizas - AEFH (2001 2003) desarrollado por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, la producción se encuentra principalmente en los departamentos de Antioquia y Cundinamarca (Anónimo, 2004).

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2.2. Producción de lechuga en Colombia De acuerdo con la Corporación Colombia Internacional (2000), en Pérez (2003), el cultivo es considerado dentro del grupo de cultivos altamente intensivos y tecnificados, caracterizados por obtenerse en parcelas de menos de 2 ha (Figura 2).

Figura 2. Cultivos de lechuga

En 2003, de acuerdo al AEFH (2001 - 2003) (Anónimo, 2004) se sembraron 881 ha de lechuga, de las cuales 636 corresponden a la Sabana de Bogotá, el cual es el mayor productor, con una producción de 9276 ton y un rendimiento de 14 585 kg/ha; siendo Antioquia el segundo productor con 98 ha sembradas y una producción de 2818 ton y 28 638 kg/ha de rendimiento (Anónimo, 2004). En Cota, según el Censo Hortícola de la Sabana de Bogotá (2002) desarrollado por el Departamento Administrativo Nacional de Estadística (DANE), se sembraron 30.44 ha, de las cuales se cosecharon 17.99 ha, con un rendimiento de 16.62 kg/ha (Anónimo, 2002).

2.3. Enfermedades limitantes para el cultivo Existen tres enfermedades significativamente limitantes a nivel mundial para la lechuga: mildeo velloso (Bremia lactucae Reglé), raíz corchosa (Rhizomonas suberifaciens) y el moho blanco de la lechuga (S. minor y S. sclerotiorum) (Smith, 1900; Subbarao, 1998; Subbarao et al., 1997 y Thomas, 1930), en el cual se basa

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este estudio. Walter (1950) en Pérez (2003) describe el moho blanco como una de las enfermedades más diseminadas y destructivas. La enfermedad del moho blanco está reportada con varios nombres comunes, en pocos departamentos de Colombia. Según Buriticá (1999), la enfermedad originada por S. minor (Sin. = S. intermedia Ramsey y S. sativa Drayton & Groves) se conoce como pudrición acuosa del tallo y S. sclerotiorum (Sin. = Whetzelinia sclerotiorum (Lib.) Korf & Dumont y S. libertiana Fuckel) pudrición algodonosa, presentes en Cundinamarca, y Antioquia y Cundinamarca respectivamente. El nombre común entre los agricultores de Cota es moho blanco (Anónimo, 2005; Espinosa, 2005a; García, comunicación personal y Romero et al., 2006), esclerotinia o pudrición blanda en otras zonas de Cundinamarca (Arias & Tautiva, 2006; Arias, Tautiva & Piedrahíta, 2006 y Ávila & Velandia, 1992) entre otros nombres como gota o pudrición acuosa, en las principales zonas productoras de los EE.UU. (Hao, 2000 y Subbarao, 1998 y 1996). En la Sabana de Bogotá, el moho blanco ocasiona pérdidas entre 20 - 70% (Pérez, 2003) y frecuentemente se presenta en los municipios de Cota y Mosquera; siendo el factor más limitante para la producción (Devia & Gomezplata, 2001). En EE.UU., afecta gravemente al estado de California (principal productor), con pérdidas cercanas al 60% (Subbarao, 1998).

2.4. Patogénesis, síntomas y signos del moho blanco En general cualquier variedad de lechuga puede ser afectada por Sclerotinia spp. Sin embargo, es en lechuga crespa (la variedad más cultivada) en la cual se han realizado la mayoría de investigaciones relacionadas con el manejo y atributos del moho blanco (Bell et al., 1998; Budge et al., 1995; Ekins et al., 2005; Hao & Subbarao, 2006, 2005 y 2003; Hao et al., 2003; Hao, 2000; Phillips, 1990; Subbarao, 1998; Twengstrom et al., 1998; Wilson et al., 2005 y Wu & Subbarao, 2006). La lechuga puede ser afectada en cualquier etapa de crecimiento, pero normalmente los síntomas se hacen más evidentes al final del período vegetativo

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(Ávila & Velandia, 1992). Así, Subbarao (1998) divide en dos fases la aparición del moho blanco en lechuga crespa (Figura 3). La primera fase ocurre en un bajo porcentaje de plantas, durante el estado de roseta (tres a cuatro semanas después de la germinación). En tanto, la segunda fase de mayor importancia económica, se presenta cerca o en el estado de maduración.

Figura 3. Etapas de aparición de los síntomas durante el ciclo de la lechuga, American Phytopathological Society

Generalmente la infección se inicia en las hojas más viejas (Abawi & Grogan, 1979; Hegedus & Rimmer, 2005; Patterson, 1986 y Purdy, 1979), donde por contacto directo las hifas se dividen dicotómicamente, formando un cojín o masa de hifas. Las cuales, se adhieren por sustancias mucilaginosas a la superficie del tejido vegetal, y por presión mecánica y secreción de enzimas, penetra la cutícula y la epidermis sin que haya evidencia de la pre-penetración y de la disolución de la cutícula. De está forma los tejidos son degradados por la acción enzimática y la producción de ácido oxálico intercelularmente (Hegedus & Rimmer, 2005; Laemmlen, 2001 y Riou et al., 1991).

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Los primeros síntomas, que normalmente se desarrollan en hojas o tallos, son zonas húmedas, que más adelante van aumentando hasta convertirse en pudriciones acuosas (Bolton et al., 2006; Hegedus & Rimmer, 2005; Lumsden, 1979 y Purdy, 1979). La planta adquiere el aspecto de una masa gelatinosa o viscosa en etapas avanzadas (Ávila & Velandia, 1992 y Bardin & Huang, 2001), producto de la total descomposición de los tejidos parenquimatosos (Purdy, 1979) por la colonización de Sclerotinia spp. Los signos del moho blanco cuando las condiciones ambientales son favorables, es la

formación

de

abundante

micelio

algodonoso

y

subsecuentemente

el

ensanchamiento de hifas (en algunas zonas de la masa micelial) al cabo de tres a siete días, donde se forman esclerocios (Abawi & Grogan, 1979; Hao et al., 2003; Hao, 2000; Kohn, 1979; Patterson et al., 1986 y Purdy, 1979), los cuales pueden permanecer por largo tiempo en el perfil del suelo (Adams & Ayers, 1979; Dillard & Grogan, 1985; Dillard, 1984 y Subbarao, 1998).

2.5. Etiología del moho blanco De acuerdo con Ainsworth y colaboradores (1973) en Lucero (2000) y Bolton y colaboradores (2006), Sclerotinia spp. se encuentra dentro de la siguiente clasificación taxonómica: Reino: Mycetae (Fungi) División: Eumycota Subdivisión (Filum): Ascomycota Clase: Discomycetes Orden: Helotiales Familia: Sclerotiniaceae Genero: Sclerotinia Especies: S. minor y S. sclerotiorum Ambas especies se diferencian por características morfológicas de los esclerocios, como la forma y el tamaño, germinación miceliogénica o carpogénica y el patrón de formación en medios de cultivo. En la germinación carpogénica se diferencian por el

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tamaño de ascas y ascosporas, y la cantidad de núcleos en estás últimas (Ekins et al., 2005; Khon, 1979 y Purdy, 1979). Las principales características de S. minor son: esclerocios redondos con un diámetro de 0.5 - 2 mm (Figura 4 A y C) (Kohn, 1979 y Subbarao, 1998) y ascosporas tetranucleadas de 8 - 17 x 5 - 7 µm (Backman et al., 1997 en Smith, 2004). La germinación carpogénica y producción de apotecios rara vez ocurre, talvez debido a factores ambientales aún no determinados (Subbarao, 1998). Aunque bajo condiciones in vitro es común la formación de apotecios, a partir de la agregación de esclerocios (Ekins et al., 2005). Sin embargo, la germinación miceliogénica es la forma más común (Abawi & Grogan, 1979; Hao & Subbarao, 2005; Laemmlen, 2001 y Subbarao, 1998). Los esclerocios se forman lateralmente en las hifas y en estás hay cuatro cromosomas haploide (Willetts & Wong, 1974). S. sclerotiorum presenta esclerocios irregulares de 2 - 20 x 3 - 7 mm (Bardin & Huang, 2001; Kohn, 1979; Laemmlen, 2001 y Subbarao, 1998). Los esclerocios se forman en posición terminal en las hifas y tienen ocho cromosomas haploide (Willetts & Wong, 1974). Cada esclerocio puede germinar carpogénicamente, produciendo de uno a varios apotecios en forma de copa (Figura 4 B y D) (Ferraz et al., 1999; Gracia et al., 2002; Sansford & Coley-Smith, 1992 y Thaning & Nilsson, 2000); aunque algunas veces son expandidos y aplanados con un ensanchamiento central (Mylchreest & Wheeler, 1987; Phillips, 1986; Singh & Singh, 1984; y Twenströmg et al., 1998). Usualmente los apotecios son de color blanco, amarillo o café. Las ascas son cilíndrico-clavadas, con medidas hasta de 130 x 10 µm y con ocho ascosporas binucleadas. Las ascosporas son no septadas, uniseriadas, hialinas y elípticas de 9 - 13 x 4 - 5 µm. La aplicación de fragmentos de restricción polimorfonucleares en el DNA mitocondrial y otras técnicas moleculares ha confirmado la diferencia entre las dos especies de Sclerotinia (Ekins et al., 2005; Kohn, 1979 y Willetts & Wong, 1974).

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A

B

C

D

Figura 4. Esclerocios y germinación en Sclerotinia spp. A y C: Esclerocios y germinación miceliogénica de S. minor, y B y D: esclerocios y germinación carpogénica de S. sclerotiorum. Figura C y D Laemmlen (2001)

2.6. Hospederos de Sclerotinia spp. S. sclerotiorum es un patógeno de amplia distribución e importancia económica en muchos cultivos. Puede atacar los productos vegetales tanto en campo, como bajo condiciones de almacenamiento (Ávila & Velandia, 1992). Se encuentra entre los patógenos de plantas no específicos, omnívoros y destructivos (Purdy, 1979). En el más reciente reporte Melzer y colaboradores (1997) indican que S. minor es patógeno de 94 especies de plantas, agrupadas en 66 géneros y representados por 21 familias; de las cuales infecta a varias angiospermas y dos monocotiledóneas. Mientras Boland (1994) en Subbarao (1998), demuestra que S. sclerotiorum afecta a 408 especies, pertenecientes a 278 géneros y representados por 78 familias. La mayoría

son

herbáceas,

dicotiledóneas,

gimnospermas.

25

y

algunas

monocotiledóneas

y

Entre las especies más susceptibles están la lechuga, el tomate (Lycopersicum esculentum Mill.), la zanahoria (Daucus carota, L.), la alcachofa (Cynara scolymus L.), el apio (Apium graveolens L. var. dulce (Mill.) Pers.), el pepino (Cucumis sativus L.), la habichuela (Vicia faba L.) y el fríjol (Phaseolus vulgaris L.). Cultivos como la papa (Solanum spp.), el espárrago (Asparagus spp.), la remolacha (Beta vulgaris L.), la espinaca (Spinacia oleracea L.), la alfalfa (Medicago sativa L.), el algodón (Hibiscus spp.), los pastos y los cereales (Gramineae) rara vez son infectados a menos que las condiciones ambientales sean favorables para Sclerotinia spp. (Ávila & Gerardino, 1991 y McDonald & Boland, 2004). Entre la familia Asteraceae, a la cual pertenece la lechuga, S. minor infecta a 21 especies y S. sclerotiorum a 106 especies (Boland, 1994 en Subbarao, 1998 y Melzer et al., 1997).

2.7. Epidemiología y ciclo de vida En aquellas zonas donde prevalecen las especies de S. minor o S. sclerotiorum, el moho blanco de la lechuga es causado por alguno de estos dos patógenos o ambos; siendo favorecido por una alta humedad. Usualmente y aunque la permanencia de S. sclerotiorum es esporádica, puede llegar a permanecer por más de un año, produciendo epidemias durante los siguientes años. En contraste, la ocurrencia de S. minor es constante (Abawi & Grogan, 1979; Hao, Subbarao & Duniway, 2003 y Matheron & Porchas, 2005). En condiciones óptimas de humedad, los esclerocios pueden permanecer viables por pocos meses en ausencia de un huésped. Por el contrario, bajo condiciones secas conservan su viabilidad por largo tiempo, de uno (Davis, 1925 en Adams & Ayers, 1979) a diez años (Laemmlen, 2001). Aunque, en varios reportes (BenYephet et al., 1993; Fernández, 1952 y Walker, 1959 en Ávila & Gerardino, 1991 y Schwartz & Steadman, 1978) se afirma que la viabilidad de los esclerocios en general es de tres años.

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Varios autores (Abawi & Grogan, 1979; Clarkson et al., 2004; Matheron & Porchas, 2005; Schwartz & Steadman, 1978 y Young et al., 2004) reportan diferentes rangos de parámetros ambientales para Sclerotinia spp. Sin embargo, los más comunes son los reportados por Hao (2000), quien indica que la temperatura óptima es de 15 - 20 ºC, con una alta humedad de -0.03 a -0.07 MPa. Abawi & Grogan (1979) y Hao & Subbarao (2005) indican las diferencias que presentan las dos especies de Sclerotinia para infectar plantas de lechuga. El desarrollo de ambos patógenos está influenciado por condiciones ambientales que afectan el desarrollo por micelio y en mayor frecuencia la formación de apotecios e infección por ascosporas liberadas a partir de estos (Abawi & Grogan, 1979; Ferraz et al., 1999; Gracia et al., 2002; Patterson, 1986 y Phillips, 1986). El moho blanco se transmite comúnmente a través de la germinación miceliogénica de esclerocios localizados cerca de las raíces y tallos de la planta (Abawi & Grogan, 1979; Adams & Ayers, 1979; Dillard & Grogan, 1985; Hao & Subbarao, 2005; Hao, 2000 y Subbarao et al., 1994) en o cerca de la línea de contacto con el suelo. Las lesiones se desarrollan en los tallos y el patógeno destruye gradualmente los tejidos vasculares de la corona, al tiempo que la planta se marchita y colapsa (Purdy, 1979 y Laemmlen, 2001). Este mecanismo, hace referencia al concepto de zona de competencia introducido teóricamente por Grogan y colaboradores (1980), y más tarde desarrollado por Hao & Subbarao (2006); el cual se define como la distancia máxima de la raíz principal (2 cm) y la profundidad (8 cm) desde la superficie del suelo (horizontal y verticalmente) a la cual un esclerocio de S. minor puede causar infección (Figura 5). Lo cual da origen a los términos de distancia y profundidad de competencia, respectivamente. La zona de competencia también tiene implicaciones en los muestreos de suelos para determinar la densidad de inoculo (Subbarao, 1998).

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Figura 5. Zona de competencia de S. minor

La enfermedad transmitida por S. sclerotiorum ocurre principalmente a través de la infección por ascosporas. Las ascosporas se pueden diseminar aéreamente en un rango de 25 m a varios km (Brown & Butler, 1936 y Suzuki & Kobayashi, 1972 en Phillips, 1990). Por lo tanto no es raro observar infecciones en la cabeza de la lechuga, el follaje del apio, repollo (Brassica oleracea L. var. capitata L.), brócoli (B. oleracea L. var. italica), coliflor (B. oleracea L. var. botrytis L.) y vainas del fríjol, al igual que en las partes aéreas de otros hospederos (Abawi & Grogan, 1979 y Laemmlen, 2001) (Figura 6).

Figura 6. Apotecios e infección en diferentes hospederos. A: formación de apotecios en S. sclerotiorum junto con la nube de ascosporas emanando; B, C, D, E, F y G: Zanahorias, vainas de fríjol, cabeza de repollo, tallos de soya, tejidos aéreos de girasol y hojas de canola colonizados por el Moho Blanco

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Una vez Sclerotinia spp. haya colonizado el tejido vegetal y producido nuevo inoculo, este puede llegar a ser re-distribuido en el lote por las prácticas culturales de los agricultores y factores bióticos, permaneciendo viables durante varios años, hasta que se produzcan las condiciones óptimas para la reactivación (Figura 7).

Figura 7. Ciclo de vida de Sclerotinia spp. Modificado de Subbarao (1998)

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2.7.1. Factores de distribución del inoculo Bajo condiciones de campo se espera que el moho blanco siga diferentes patrones de distribución espacio-temporal, debido al tipo de infección que se presente (Marois & Adams, 1985 en Hao & Subbarao, 2005). En la enfermedad originada por S. minor, las plantas enfermas serán el reflejo de la distribución de esclerocios en el perfil del suelo, debido a la alta correlación entre la densidad de esclerocios y la incidencia de la enfermedad (Dillard & Grogan, 1985; Dillard, 1984; Hao et al., 2003; Hao, 2000 y Subbarao et al., 1996). En S. sclerotiorum el patrón de distribución depende no solo de los esclerocios, sino de la temperatura y humedad del sustrato que influyen sobre la formación y viabilidad de apotecios (Ferraz et al., 1999; Gracia et al., 2002; Schwartz & Steadman, 1978 y Singh & Singh, 1984), y la velocidad y dirección de los vientos que permiten la descarga y deposición de ascosporas (Abawi & Grogan, 1979 y Newton & Sequeira, 1972 en Hao & Subbarao, 2005). Sin embargo, el patrón de distribución no es comprendido según los modelos matemáticos existentes (Hao & Subbarao, 2005 y Hao, 2000). El análisis y comprensión del patrón de distribución de Sclerotinia spp., al igual que el de otros patógenos, ofrece información sobre el inoculo primario, la relación entre la densidad de inoculo y la incidencia de la enfermedad, el mecanismo de dispersión, dirección y distancia del avance de la enfermedad, y el efecto de factores ambientales en la epidemia del moho blanco (Chellemi et al., 1988; Dillard, 1984; Goodchild & Haining, 2004; Gumpertz, 1997; Gumpertz et al., 1997; Hao & Subbarao, 2005 y 1997; Jaime-Garcia & Cotty, 2003; Nelson et al., 1999; Real & McElhany, 1996; Ristaino & Gumpertz, 2000; Subbarao et al., 1996; Subbarao et al., 1995; Waggoner & Taylor, 2000; Wu & Subbarao, 2006 y 2003; Wu et al., 2001 y Zadoks, 1999); lo cual constituiría la base hacía la estructuración de un plan de muestreo para comprender la distribución espacial de Sclerotinia spp. y un plan de manejo integrado del moho blanco (Duque, 2000; Giraldo, 2002; Hao & Subbarao, 2005 y Stein et al., 1994). Existen diferentes métodos para realizar un análisis espacial, como la relación varianza-media, mapeo, el índice de dispersión Morisita, índice de Lloyd, distribución de frecuencias y autocorrelación espacial, los cuales indican el tipo de

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distribución espacial, sin tener en cuenta la ubicación y correlación (dependencia) espacial entre los puntos muestreados (Duque, 2000; Stein et al., 1994 y Wu et al., 2006). Caso contrario es la geoestadística, que aporta mayor conocimiento en este sentido.

2.7.1.1. Geoestadística Inicialmente desarrollada por geólogos en el campo de la minería (Cressie, 1993; Gumpertz et al., 1997; Isaaks & Srivastava, 1989; Quador, 2006; Real & McElhany, 1996; Ristaino & Gumpertz, 2000 y Samper & Carrera, 1990) y más tarde introducida por Chellemi y colaboradores (1988) para las primeras aplicaciones en el campo de la sanidad vegetal. Permite cuantificar y correlacionar espacialmente la incidencia de una enfermedad o poblaciones de microorganismos e inoculo: microesclerocios, esclerocios, esporas, etc., durante un determinado período de tiempo y la predicción o estimación de aquellos valores en sitios no muestreados (Benítez, 2002; Castaño, 2002; Giraldo, 2002; Jaime-Garcia & Cotty, 2005 y 2003; Nelson et al., 1999; Rekah et al., 1999; Wu et al., 2006 y 2001; y Wyngaarden, 2002). El

análisis

de

correlación

espacial

puede

ser

analizado

direccional

u

omnidirecionalmente por medio de semivariogramas. Los cuales cuantifican la dependencia o correlación espacial por medio de la medición de la variación de los valores entre puntos muestreados, separados por una distancia y a partir de la dependencia espacial se puede estimar valores en sitios no muestreados por medio de la interpolación o kriging (Cressie, 1993; Isaaks & Srivastava, 1989; Wu et al., 2001 y Wyngaarden, 2002). Entre los principales trabajos desarrollados en el país están los de: Torres (2006) quien evaluó la distribución espacial de la sigatoka negra (Mycosphaerella fijiensis Morelet) en una plantación de banano (Musa spp.), Gil (2005) determino la distribución espacio-temporal del agente causal (Tyrophagus putrescentiae Schrank) de la deformación de las hojas de la espinaca, Barreto (2004) analizo la distribución del acaro Tetranychus urticae Koch en un cultivo de rosa bajo invernadero (Rosa spp.), Murcia & Huertas (2002) establecieron la distribución espacial del agente

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causal de la sarna polvosa (Spongospora subterranea (Wallroth) Lagerheim f. sp. subterranea Tomlinson) en un cultivo de papa (Solanum spp.), entre otras investigaciones (Benítez, 2001; Florez, 2001 y Florez & Corredor, 2000).

2.8. Manejo integrado del moho blanco Tanto S. minor como S. sclerotiorum sobreviven durante los períodos de ocurrencia de los cultivos o cuando estos no tienen lugar, en forma de esclerocios en el suelo o como micelio en restos de tejidos vegetales infectados (Abawi & Grogan, 1979 y Ávila & Velandia, 1992). Subbarao (1998) recomienda la combinación de métodos de control cultural, físico, químico y biológico para un mejor manejo del moho blanco; ya que el empleo de un solo método es ineficaz. Ávila & Velandia (1992) sugieren tener en cuenta aspectos como la humedad, abundancia de malezas, rotación de cultivos y evitar la alimentación de animales con restos de tejidos vegetales afectados por la enfermedad.

2.8.1. Humedad Posiblemente es el factor más importante directamente relacionado con la incidencia. Deben evitarse los excesos de riego y mantener buenos drenajes para una rápida evacuación de aguas sobrantes.

2.8.2. Malezas Existen malezas susceptibles, portadoras e inmunes; según la relación que se establezca con el patógeno. Las malezas pertenecientes a la primera y segunda categoría son las más importantes por cuanto Sclerotinia spp. puede multiplicarse y sobrevivir indefinidamente en ellas. Entre las primeras están: manzanilla (Matricaria spp.), vira-vira (Gamochaeta coarctata (Wild.) Kerguélen) y llantén (Plantago major L.); dentro de las segundas: lengua de vaca (Rumex crispus L.), borraja (Borago officinalis L.), cenizo (Chenopodium murale L.), bledo (Amaranthus hybridus L.), y al tercer grupo pertenecen las gramíneas como pastos, maíz (Zea mays L.) y trigo (Triticum spp.).

32

Desde el punto de vista sanitario, el cultivo debe permanecer sin malezas para permitir la circulación de aire entre las plantas. Lo cual evita la formación de un micro-ambiente que favorezca el establecimiento, multiplicación y supervivencia de Sclerotinia spp.

2.8.3. Rotaciones Deben sembrarse especies no susceptibles. En terrenos donde se ha presentado el moho blanco no deben sembrarse cultivos que afecta Sclerotinia spp., porque favorece el aumento de inoculo en el suelo y consecuentemente la incidencia de la enfermedad.

2.8.4. Restos de cultivos anteriores Los agricultores de la Sabana de Bogotá generalmente utilizan los residuos de cultivos (habitualmente constituidos por plantas enfermas) para la alimentación del ganado vacuno. Los esclerocios pasan por el tracto digestivo sin sufrir daño y son expulsados en el estiércol. Por este medio el inoculo puede dispersarse dentro y entre lotes de cultivo por el desplazamiento del ganado. Así mismo, la elaboración de abono orgánico a partir de estiércol facilita la diseminación del moho blanco rápida y uniformemente. Aunque, Silveira y colaboradores (2005) bajo condiciones in vitro reportan la inhibición del crecimiento micelial en S. sclerotiorum a partir de extractos de compost.

2.8.5. Manejo cultural La distribución espacial del moho blanco se presenta en focos, por lo cual es conveniente retirar todas las plantas afectadas y destruirlas con el fin de no incrementar el nivel de inoculo. Las hojas bajeras deben recogerse cuando presentan amarillamiento (Ávila & Velandia, 1992).

2.8.5.1. Desinfección del suelo La desinfectación del suelo es una de las aproximaciones para el control de patógenos radiculares, en cultivos intensivos y de alto valor comercial. Su principio básico es eliminar un amplio espectro de fitopatógenos del suelo antes de establecer un cultivo, por medio de métodos químicos o físicos. Lo cual ofrece otros

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beneficios, como la erradicación de patógenos de menor importancia (también llamados parásitos débiles o microorganismos deletéreos) y sustancias tóxicas, producidas por los microorganismos del suelo o a partir de la descomposición de la materia orgánica (Katan, 2000 y 1993). Existen tres enfoques para la desinfestación del suelo: La aplicación de vapor y plaguicidas, desarrollados desde hace 120 años (y hasta hace poco los únicos métodos) y la solarización del suelo (relativamente nuevo) (Katan, 1993).

2.8.5.1.1. Solarización del suelo De acuerdo a Hio (2001) la solarización consiste en aprovechar la energía solar, para aumentar la temperatura del suelo mediante acolchado con plástico negro o transparente, durante la época de calor. Período en el cual ocurren cambios biológicos, físicos y químicos en el suelo durante y después de la solarización del suelo (Annesi & Motta, 1994; Benlioglu et al., 2005; Elmore, 1995; Gelsomino et al., 2006; Katan, 2000; Otieno et al., 2003; Patrício et al., 2006; Porras et al., 2006; Raio et al., 1997; Stevens et al., 2003; Tamietti & Valentino, 2006 y Wu et al., 2002).

2.8.6. Manejo químico La eficacia de este método de control depende en la elección del producto, de la época y de la forma de aplicación. Los i.a. como Iprodione, Vinclozolin, Benomil y Carbendazin han mostrado un control aceptable cuando se asperjan alrededor de las plantas (Ávila & Velandia, 1992). Sin embargo, la vida media de los i.a. es corta debido a la biodegradación por los microorganismos del suelo y a la interacción con las características físico-químicas del suelo (Subbarao, 1998).

2.8.7. Manejo biológico Se han reportado más de 30 especies entre bacterias y hongos como antagonistas y micoparásitos de Sclerotinia spp. (Adams y Ayers, 1979; Agrios, 2002 y Subbarao, 1998). Los mejores biocontroladores reportados son Sporidesmium sclerotivorum Uecker, Adams y Ayers en S. minor (Adams, 1990 y Adams & Wong, 1991 en Subbarao,

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1998) y Coniothyrium minitans en S. sclerotiorum (McLaren et al., 1996 en Subbarao, 1998). En Colombia bajo condiciones de campo en el Instituto Colombiano Agropecuario (ICA), Tibaitatá, Ávila & Velandia (1992) reportaron que el hongo T. harzianum Rifai asperjado mediante el mismo procedimiento empleado en las aplicaciones de productos químicos, presentó un 22,4% de plantas afectadas con respecto al tratamiento con Benomil 15,7%. Los microorganismos antagónicos ofrecen una alternativa al uso de fungicidas en la producción de cultivos. Sin embargo, existen muchos problemas relativos a la formulación, aplicación y supervivencia de los antagónicos bajo condiciones de campo; en las cuales comúnmente se desarrolla el cultivo de lechuga (Ávila & Gutiérrez, 1991). Actualmente el laboratorio de Control Biológico de CORPOICA, Tibaitatá viene adelantando investigaciones con la cepa de T. koningii Oudemans para el control del moho blanco (Moreno, comunicación personal).

2.8.8. Manejo botánico Tradicionalmente algunos agricultores han desarrollado actividades de agricultura sostenible, utilizando plantas nativas para varias prácticas agrícolas; de las cuales diferentes especies son reconocidas por sus propiedades bactericidas, fungicidas, nematicidas e insecticidas (Duke, 1995 en Rodríguez & Velandia, 1996 y Lee, 2002). Está forma de control ha despertado gran interés entre los investigadores, con resultados promisorios bajo condiciones in vitro y poco significativos en condiciones de campo (Adandonon et al., 2006; Clarke, 1966; Curtis et al., 2004; Muto et al., 2006; Natarajan et al., 2006 y Silveira et al., 2005). En la mayoría de estudios recientes se ha comprobado que los metabolitos secundarios de plantas con efectos insecticidas y fungicidas, pueden actuar como controladores de organismos plaga; sin afectar o alterar la micro y macro fauna en general (Hio, 2001).

35

Hio (2001) en Colombia, reporta el control de patógenos en cultivos de importancia económica. Mediante hidrolatos crudos de raíces, tallos, hojas, flores y frutos de plantas, aplicados directamente al suelo y a la zona donde se presente la sintomatología; logrando reducir poblaciones de plagas en cultivos. Entre las especies de plantas con sustancias supresivas están el ajo (Allium sativum L.), el cual contiene un alto contenido de bisulfuro de alipropilo y es recomendado para el control de Phytophthora infestans (Mont.) de Bary (Rodríguez y Velandia, 1996), Aphanomyces euteiches, Colletotrichum coccodes (Wallr.) S. J. Hugnes, Fusarium moniliforme Sheldon, F. oxysporum Schlecht, P. cinnamomi, Pythium aphanidermatum (Edson) Fitzp., Rhizoctonia solani Kuhn, Sclerotium rolfsii Sacc. y S. sclerotiorum (Auger et al., 2004); la caléndula (Calendula officinalis L.) para el control de bacterias en tomate; la ortiga (Urtica spp.) previene el ataque de Pythium sp. en semilleros y la cola de caballo (Equisetum spp.) es utilizada como fungicida contra diferentes hongos en Solanáceas (Rodríguez & Velandia, 1996). Los estudios para el control de Sclerotinia spp. son pocos y han sido desarrollados bajo condiciones in vitro. Espinosa (2005a) reporta el efecto inhibitorio en S. sclerotiorum (aislado de un cultivo de lechuga), a partir de extractos vegetales de ajo y manzanilla (Matricaria recutita L.). Diniz y colaboradores (2005) obtuvieron la inhibición de S. sclerotiorum (aislado de estevia, Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni) por aceites de tomillo (Thymus vulgaris L.), albahaca común (Ocimum basilicum L.), manjerona (Origanum majorona L.), menta (Menta piperita L. var. citrato (Ehr.) Briq.), estragón (Artemisia draconculus L.). Tassara y colaboradores (2001) lograron retardar la aparición de los síntomas por S. sclerotiorum en plántulas de lechuga (bajo condiciones controladas), a partir de la aplicación del extracto etéreo del alga Nostoc muscorum en los tallos de lechuga. Al igual que los diferentes i.a. de las plantas afectan el crecimiento de patógenos microbiales, se ha reportado el efecto inhibitorio de diferentes extractos vegetales sobre cepas de Trichoderma spp. (Anónimo, 2005 y Espinosa, 2005b).

36

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN Debido a la falta de estrategias eficientes y la aplicación de métodos de control inapropiados por parte de los agricultores de Cota, en los últimos años el moho blanco originado por S. minor y S. sclerotiorum asociado al cultivo de la lechuga, ha aumentado su prevalencia y disminuido la producción local. El principal mecanismo de diseminación y prevalencia, está relacionado con la abundante formación de esclerocios a partir de plantas enfermas y en segundo lugar el flujo de ascosporas por la formación de apotecios. Frecuentemente presentados por S. sclerotiorum, en otras latitudes. Ante esto es importante conocer ¿Cuál es la especie prevalente? Las estructuras de reproducción pueden permanecer viables durante años, debido a la resistencia a factores adversos y además pueden multiplicar su población durante los siguientes cultivos, debido a los múltiples hospederos. De está forma el inoculo llega a ser redistribuido a través del perfil del suelo, generando diferentes patrones de distribución espacial de la infección. Por lo cual, es importante saber ¿Cuál es la distribución espacial y densidad de inoculo en el lote de estudio? Ante está doble problemática: persistencia en el suelo y métodos de control inapropiados, el conocimiento del patrón de distribución espacial contribuiría a generar las bases para el diseño de métodos de control dirigidos a sitios específicos. A partir de la evaluación de diferentes productos ecológicos para el control del moho blanco. Por lo tanto es necesario determinar ¿Cuál de los productos ofrecerá un mejor control del moho blanco? Los resultados serán de gran utilidad para la implementación de planes de manejo integrado del moho blanco, generando información que contribuya a la sostenibilidad del cultivo.

37

4. OBJETIVOS

4.1.

Objetivo general

Identificar las especies de Sclerotinia spp. presentes, al igual que el patrón de distribución espacial de los esclerocios y ensayar diferentes productos ecológicos para el control de Sclerotinia spp., tendientes a contribuir con la estructuración de un plan de manejo integrado del moho blanco en el cultivo de lechuga.

4.2.

Objetivos específicos

o

Caracterizar morfológica y patológicamente la especie de Sclerotinia spp.

o

Cuantificar e identificar la población y la distribución espacial de esclerocios de Sclerotinia spp. en el lote.

o

Evaluar la eficacia de los productos a base de extractos vegetales y T. koningii Th003, en conjunto con la solarización del suelo, en la reducción de la incidencia del moho blanco.

38

5. HIPÓTESIS

5.1. Hipótesis 1 o

HO: La población de esclerocios de Sclerotinia spp. estara distribuido espacialmente al azar en el lote de cultivo afectado.

o

HI: Los esclerocios estaran distribuidos en forma agregada.

5.2. Hipótesis 2 o

HO: Los esclerocios de alguna de las especies de Sclerotinia spp., tendrán mayor abundancia.

o

HI: El número de esclerocios será aproximadamente igual para ambas especies.

5.3. Hipótesis 3 o

HO: Al menos uno de los tratamientos a base de extractos vegetales o T. koningii Th003, solo o en conjunto con la solarización del suelo, reducirá significativamente la incidencia del moho blanco.

o

HI: Ninguno de los tratamientos con base en extractos vegetales o T. koningii Th003, disminuirá significativamente la incidencia del moho blanco.

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6. MATERIALES Y MÉTODOS En el inicio de está investigación dentro del área rural del municipio de Cota (Figura 8), se desarrollo un muestreo piloto (octubre - noviembre de 2005), con el objetivo de encontrar un lote comercial, con una alta incidencia del moho blanco. Los criterios que se tuvieron en cuenta para escoger el sitio fueron: homogeneidad en las camas, alta cantidad de esclerocios en el suelo y distancias de siembra similares. La investigación se realizó en dos períodos definidos así: 1) Identificación y análisis espacial de Sclerotinia spp. y 2) manejo integrado del moho blanco.

Figura 8. Vista panorámica de la zona rural en el municipio de Cota

6.1. Zona de estudio La investigación fue desarrollada en un área plana de 700 m2 aprox. Dentro de un lote comercial destinado al cultivo de lechuga Batavia, de la Finca Pozo Azul, ubicada en la vereda La Moya, Cota (Cundinamarca, Colombia). El municipio se encuentra a 14 km hacía el noroccidente de Bogotá, D. C. (Figura 9) y geográficamente a 4º 49’ 05,665’’ latitud norte y 74º 07’ 20,904’’ longitud oeste. Está a una altura promedio de 2547 m.s.n.m., temperatura promedio anual de 13.7

40

ºC, precipitación anual 700 mm y suelos de origen volcánico con textura francoarenosa. Es uno de los mayores productores de hortalizas de la Sabana de Bogotá, donde en los últimos años ha habido una disminución de la producción de lechuga. Debido entre otras razones, a la alta prevalencia de Sclerotinia spp. agente causal de la enfermedad comúnmente llamada moho blanco.

Figura 9. Franja de estudio

6.2. Diseño experimental Para determinar la distribución espacial de esclerocios, se utilizó un muestreo sistemático (Steel & Torrie, 1988). En la evaluación de la eficacia de los productos ecológicos para el control del moho blanco, durante la segunda etapa de la investigación se utilizó un diseño de parcelas divididas (Reyes, 1992). Las cuales constituían las parcelas principales, previamente sometidas con y sin la solarización del suelo (Anexo 4). A la vez cada parcela principal estuvo divida aleatoriamente en subparcelas, conformadas por seis productos (tratamientos) para el control del moho blanco y un testigo absoluto.

6.3. Muestreo espacial El lote escogido estuvo compuesto por doce camas de 1.50 x 35 m (52.5 m2) después de haber sido cosechado (26 - 29 de diciembre, 2005) y rastrillado con un

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tractor (Ford®), según el manejo dado por el agricultor. Se realizó en el sitio correspondiente a cada cama (previamente demarcada en los extremos) un muestreo sistemático. Entre el 1 - 3 de enero, 2006 se realizo un muestreo espacial, tomando muestras de suelo (en bolsas plásticas previamente etiquetadas, con el número de surco y la ubicación o distancia del sitio donde fueron tomadas) cada 5 m centrales en un área de 10 x 10 x 10 cm (1000 cm3) a lo largo de cada cama (Figura 10).

A

B

C

Figura 10. Muestreo espacial de suelo. A: Lote rastrillado, B: Toma de muestras y C: Muestreo sistemático

En total fueron recolectadas 96 muestras, las cuales fueron almacenaron bajo condiciones de invernadero (invernadero de experimentación no. 6 del programa de Manejo Integrado de Plagas - MIP) en el Centro de Investigaciones y Asesorías Agroindustriales de la Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano (CIAA - UJTL) (ubicado sobre la carretera central del norte 3 km después de La Caro a 4º 52’ latitud norte y 74º 03’ longitud oeste), donde fueron procesadas entre enero - mayo de 2006 en el laboratorio de Fitopatología.

6.3.1. Aislamiento y cuantificación de esclerocios Se modifico la metodología de Pratt (1993) para el procesamiento de las muestras. Cada muestra fue homogenizada y llevada a un peso de 1000 g, para ser lavada con agua corriente en tamices de 850, 500 y 250 µm. Los residuos retenidos en los tamices se dejaron secar a temperatura ambiente sobre toallas de papel absorbente durante un día (Figura 9 A, B y C). Finalizado el procesamiento de las muestras, se identifico los esclerocios de acuerdo a las características de la especie de Sclerotinia spp. presente.

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6.3.1.1. Identificación morfológica Siguiendo los caracteres descriptivos de la clave taxonómica de Kohn (1979) y otras características descritas por Le Tourneau (1979) en cuanto al tamaño, la forma y el patrón de formación de esclerocios en agar Papa Dextrosa (APD) (Anexo 1) se identificaron las especies de Sclerotinia spp. Utilizando un estereoscopio con ocular de 50X, los esclerocios de Sclerotinia spp. se identificaron de acuerdo al tamaño y características morfológicas. Para determinar el patrón de formación de los esclerocios en APD, se desinfectaron superficialmente en una solución de hipoclorito de cloro 1.5% y después se lavaron por duplicado en agua destilada estéril, manteniéndolos en agitación durante un tiempo de 2: 2: 2 min. respectivamente. Después del cual se dejaron secar sobre toallas de papel absorbente estériles, para ser sembrados sobre la superficie del APD. Se dejaron bajo condiciones de incubación a 23 ± 2 ºC durante cinco días, a partir de los cuales se completo la identificación morfológica. De está manera los valores correspondientes al número de esclerocios de la especie de Sclerotinia spp. en cada sitio muestreado fueron registrados en una base de datos, para efectuar el posterior análisis espacial.

6.3.1.2. Prueba de patogenicidad Bajo condiciones de invernadero (temperatura mínima 12.3 ± 0.50 ºC y máxima 28.6 ± 1.01 ºC) en el CIAA - UJTL, se dispuso de un arreglo completamente aleatorizado (Anexo 2), con plantas de ocho semanas de lechuga Batavia. Sembradas en materos de 1 l y sustrato de siembra turba (Anexo 3). El número de tratamientos se basó en las especies de Sclerotinia identificadas. Cada tratamiento estuvo compuesto por cinco repeticiones y cuatro unidades experimentales, junto con un testigo absoluto, representando un total de 20 plantas por tratamiento (Figura 11). Las plantas correspondientes a Sclerotinia spp., fueron inoculadas con discos de APD (8 mm de diámetro) con micelio y esclerocios, a partir de aislamientos de Sclerotinia spp. en APD. Lo cual facilitó la transmisión de los síntomas por los

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esclerocios y el micelio. En cada planta se inserto un disco entre la axila de las hojas, para un total de diez discos por planta. Diariamente se evaluó el número de plantas enfermas, para evidenciar la aparición de los síntomas característicos de Sclerotinia spp.

Figura 11. Distribución de las plantas en las pruebas de patogenicidad

Durante el transcurso de la evaluación se aplicó riego, con una frecuencia de tres veces al día (mañana, medio día y tarde); aumentando la humedad para proporcionar el desarrollo de Sclerotinia spp. y la aparición de los síntomas en las plantas de lechuga. Cada dos días se aplicaba una solución nutritiva a las plantas. Al aparecer los primeros síntomas (característicos del moho blanco), se aislaron tejidos lesionados en APD y se colocaron en condiciones de incubación a 23 ± 2 ºC, durante cinco días. Después de la incubación se identifico la especie de Sclerotinia spp. de acuerdo con las características macro y microscópicas. De está forma se corroboraron los postulados de Koch (Agrios, 2002). Al final de la evaluación se expreso el número de plantas enfermas en porcentajes, por medio de la división del número de plantas enfermas entre el número total de plantas por tratamiento.

6.3.2. Análisis espacial Se utilizó la técnica de la geoestadística (Isaaks & Srivastava, 1989) por medio de la construcción de un semivariograma ajustado a un modelo matemático (Cressie,

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1993), para determinar la distribución y asociación espacial de esclerocios. El semivariograma es una gráfica de la semivarianza en función de la distancia (Figura 12). La semivarianza está definida como la mitad de la varianza de las diferencias entre observaciones separadas por una distancia h (Jaime-Garcia & Cotty, 2003). El semivariograma se cálculo de acuerdo con la ecuación uno.

γ ( h) =

1 N ( h) [Z ( xi ) − Z ( xi + h)]2 ∑ 2 N (h) i =1

(1)

Donde, y (h) es el valor estimado de semivarianza para h , N (h) es el número de pares de puntos separados por h , y Z ( xi ) y Z ( xi + h) son los valores para el número de esclerocios separados por una distancia h . La determinación de la anisotropía o isotropía se identifica mediante la orientación del semivariograma. Hay anisotropía cuando el semivariograma cambia en función de la dirección. Mientras la isotropía se da en torno al incremento de la distancia (Cressie, 1993 y Isaaks & Srivastava, 1989). De la misma manera, la forma del semivariograma puede variar. La semivarianza se incrementa con la distancia entre los puntos muestreados, presentando un valor constante (la meseta) a una determinada distancia (el rango de dependencia espacial). Las muestras separadas a distancias menores al rango tienen correlación espacial y aquellas separadas a distancias mayores no tienen una dependencia espacial (Figura 12) (Real & McElhany, 1996; Ristaino & Gumpertz, 2000 y Yates et al., 1986). El espacio comprendido entre el origen del semivariograma y el primer punto de la gráfica comúnmente es conocido como el efecto pepita, representa el error de medida (Cressie, 1993).

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Figura 12. Semivariograma teórico, según un modelo esférico. Donde, γ ( h ): es la semivarianza, C: la meseta, α : el rango o alcance y h : la distancia

También se diseñaron mapas en 3 D representando la distribución espacial de esclerocios y como medida directa del patrón de distribución se utilizó la relación varianza-media presentada por Duque (2000). Donde, una S2 = X es una distribución al azar, S2 > X es agregada y S2 < X uniforme. El análisis geoestadístico se desarrollo con el programa Surfer® 8 (Golden Software, Inc., 2002).

6.4. Manejo integrado del moho blanco Después del muestreo espacial, entre el 1 de marzo - 1 de junio, 2006 se estableció un segundo cultivo de lechuga Batavia, con el fin de evaluar diferentes productos ecológicos para el control del moho blanco.

6.4.1. Solarización del suelo El lote quedo constituido por once camas, cada una de 1.20 x 35 m (42 m2), y se dejo una cama de borde (en cada lado). Se eligieron aleatoriamente cinco camas para la evaluación de los productos (Anexo 4). Las camas seleccionadas se dividieron en dos partes iguales de 1.20 x 17.5 m (21 m2) y cada una de ellas represento una parcela principal. Antes de iniciar el proceso de solarización del suelo, se humedeció el lote a capacidad de campo, con el objetivo de reactivar las estructuras dormantes del moho blanco, al igual que el de otros patógenos (Elmore, 1995). La solarización del suelo consistió en cubrir las camas con plástico translúcido de polietileno de 152 µm de espesor durante 32 días (27 de enero - 27

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de febrero, 2006). La no solarización consistió en dejar las parcelas descubiertas durante el mismo tiempo. Las camas fueron cubiertas con el plástico templándolo, ajustándolo en los extremos con ganchos de enganche y cubriendo los bordes con suelo. De este modo cada cama quedo completamente cubierta y con un espacio libre entre la superficie del suelo y la cubierta plástica, permitiendo la circulación de aire y por lo tanto facilitando la difusión homogénea de calor. Además de evitar el levantamiento del plástico por las corrientes de viento. Durante el tiempo que se mantuvo la solarización del suelo, se registraron datos climáticos en una estación metereológica (Micrometos®), ubicada en la zona de estudio. En las parcelas con y sin solarización se registró la temperatura del suelo (a dos centímetros de profundidad) mediante el uso de sensores (Cox Tracer®), previamente programados para registrar la temperatura cada 10 min., durante los 32 días que duro el montaje de la solarización del suelo (Figura 13).

A

B

C

Figura 13. Solarización del suelo. A: Instalación del sensor, y B y C: Cubiertas plásticas

6.4.1.1. Efecto de la solarización del suelo en la población de malezas Finalizado el período de solarización, se levantaron las cubiertas plásticas, dejando intactas las camas para el establecimiento del cultivo. En cada parcela (con y sin la solarización)

se

seleccionaron

aleatoriamente

tres

puntos

de

muestreo,

estableciendo una cuadrícula de 0.5 x 0.5 m (0.25 m2) para cuantificar el número de malezas presentes (28 de febrero, 2006).

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6.4.1.2. Establecimiento del cultivo Antes del establecimiento del cultivo se realizó un análisis de aguas de riego y fertilidad del suelo, hecho en el laboratorio de Análisis Foliar y Nutrición Vegetal del CIAA - UJTL. Los análisis revelaron parámetros óptimos para el establecimiento del cultivo (Anexo 5). El material vegetal empleado para el cultivo fueron plántulas de lechuga Batavia (Anexo 6) del semillero del CIAA - UJTL. Se utilizaron rejillas para plantulación de 200 celdas, con sustrato de turba. Cuatro semanas después de la siembra y cuando las plantas presentaron cuatro hojas verdaderas desplegadas, se llevaron a campo (1 de marzo, 2006). Las plantas se sembraron a distancias de 0.3 x 0.3 m, obteniendo una densidad de siembra de 11 plantas/m2 (Figura 14).

A

B

D

C

Figura 14. Establecimiento del cultivo. A, B y C: Plántulas recién transplantadas y D: Desarrollo del cultivo

Las primeras dos semanas después de transplante se aplico riego por aspersión, con una frecuencia de dos veces al día, durante todos los días, siguiendo el manejo dado por el agricultor. Debido al intenso período de lluvias presentado, no hubo que continuar realizando el riego.

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6.4.1.3. Efecto de la solarización del suelo en la población de esclerocios El siguiente día después del transplante, en cada subparcela previamente demarcada se tomaron muestras de suelo (2 - 5 de marzo, 2006) en los 10 cm centrales entre plantas, a 2 cm de profundidad dentro de una cuadrícula de 10 x 10 cm (200 cm3). Obteniendo 70 muestras correspondientes a las subparcelas con y sin solarización. Las muestras de suelo correspondientes a cada subparcela fueron homogenizadas y se tomo una submuestra de 100 g. La cual fue procesada en el laboratorio de Fitopatología del CIAA - UJTL, de acuerdo a la metodología descrita anteriormente.

6.4.2. Productos para el control 6.4.2.1. Selección de extractos vegetales Después de un proceso de reconversión de agricultura convencional a orgánica por parte de un grupo de agricultores de Cota (Lee, 2002); los cuales adoptaron diferentes métodos ecológicos para el control de enfermedades y plagas en sus cultivos, como la preparación y aplicación de extractos vegetales tipo purines (García, 2004 y Vergara, 2001). El programa MIP del CIAA - UJTL evaluó la estandarización de los métodos de control (Anónimo, 2005 y Jiménez, comunicación personal). Debido a que la principal enfermedad limitante en el cultivo de lechuga en Cota es el moho blanco (Anónimo, 2006, Lee, 2002 y Romero et al., 2006), mediante ensayos previos bajo condiciones in vitro se determinó que los extractos vegetales de ajenjo (Artemisia absinthium L.), ají (Capsicum frutescens L.), ajo, caléndula, cola de caballo (Equisetum bogotense Kunth), helecho marranero (Polypodium vulgare L.), manzanilla dulce, ortiga blanca (Urtica dioica L.) y ruda (Ruta graveolens L.) inhiben el radio de crecimiento micelial (RCM) de S. sclerotiorum (Anónimo, 2005 y 2006 y Espinosa, 2005a). De los cuales, los extractos vegetales de ajo y manzanilla presentaron los mayores porcentajes de inhibición en el RCM de S. sclerotiorum (Figura 15) (Anónimo, 2006). Por ese motivo se selecciónaron los extractos vegetales de ajo y manzanilla para ser evaluados bajo condiciones de campo.

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Laboratorio de Fitopatología, CIAA - UJTL

Figura 15. Efecto de diferentes dosis del extracto vegetal de ajo sobre el RCM de S. sclerotiorum

Para la preparación de los extractos vegetales se establecieron parcelas de cultivo en el CIAA (siguiendo un manejo orgánico), con material vegetal procedente de Cota. En estás parcelas se seleccionaban plantas sanas y vigorosas, las cuales eran lavadas en agua pura antes de la preparación de los extractos vegetales. Los extractos vegetales se elaboraron a partir de dientes pelados de ajo, y flores y tallos tiernos de manzanilla, los cuales eran finamente picados y puestos en recipientes plásticos a fermentar en un volumen de agua acorde con la dosis establecida de 1 y 25 g/l del extracto vegetal (Anónimo, 2006 y Jiménez, comunicación personal) durante 15 días (agitando con un palo de madera la solución todos los días). Los recipientes eran cubiertos con una tela de tul, para evitar la contaminación (Figura 16 E, F, G, H e I). La preparación y fermentación de los extractos vegetales se realizo bajo condiciones semicontroladas de invernadero abierto, con una temperatura promedio de 14 ºC en el CIAA - UJTL. El agua empleada para la preparación de los extractos vegetales estaba libre de coliformes fecales y totales, de acuerdo a los análisis microbiológicos del laboratorio de Fitopatología (Niño, comunicación personal).

50

Después de fermentados los extractos vegetales, eran filtrados y envasados herméticamente en recipientes plásticos. Transportándolos al lote experimental, para la aplicación y evaluación en el control de Sclerotinia spp.

6.4.2.2. Selección del biocontrolador Se usó el hongo antagonista T. koningii Th003 (Garzón, 2002; Peña, 2002 y Moreno, 2003), aislado por Cotes (1993) de larvas de Anofeles (Díptera: Culicidae) muertas en un suelo agrícola de la Sabana de Bogotá (Moreno, 2003) y proporcionado por el Laboratorio de Control Biológico de CORPOICA, Tibaitatá (Anexo 7). La concentración de formulación suministrada fue de 5.8 x 109 conidias/g. El prototipo de producto se comenzó a aplicar desde la germinación de las plántulas en semillero cada ocho días, a una concentración de 1 x 109 conidias/ml (dosis 1 g/l de agua). Al momento de transplante en cada sitio de siembra correspondiente a la subparcela tratada con T. koningii Th003, se adicionó 1 g del producto granulado, cubriéndolo con compost y sobre este se ubico la plántula (Figura 16 A, B, C y D). Durante cada aplicación, desde semillero se realizó un control de calidad determinando el número de UFC/g en agar Rosa de Bengala (ARB) (Anexo 1).

6.4.2.3. Selección del producto químico En Cota el i.a. últimamente empleado para el control del moho blanco es la Procimidona (Anexo 8). El cual es también recomendado por diferentes autores (Patrício et al., 2006) y fue usado en está investigación como testigo comercial.

6.4.2.4. Aplicación de productos Cada uno de los productos se aplico alrededor de la base del tallo de las plantas de lechuga, con una fumigadora (Royal Condor®) de espalda (de 20 l) de cono hueco (Figura 16 J). Los productos se aplicaban entre las 7:00 - 10:00 a.m. para disminuir las pérdidas por evaporación. Las aplicaciones de los extractos vegetales eran de 30 ml/planta y el hongo antagonista 50 ml/planta, con una frecuencia semanal;

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mientras que el producto químico 50 ml/planta con una frecuencia quincenal (Tabla 1), de acuerdo a las recomendaciones de las respectivas entidades productoras. Todos los productos se aplicaron hasta el final del ciclo del cultivo. Dejando dos semanas como período de carencia, antes de cosechar.

A

B

C

E

F

G

H

I

D

J

Figura 16. Preparación y aplicación de productos para el control del moho blanco. A: Aplicación de T. koningii Th003, B y C: Establecimiento de T. koningii Th003 en campo, D: Trasplante, E: Plantas de Manzanilla, F y G: Preparación de extractos vegetales, H e I: Fermentación de extractos vegetales y J: Modo de aplicación Tabla 1. Tratamientos Tratamiento Frecuencia de aplicación

No. 1 2 3 4 5 6 7

Manzanilla (1 g/l) Manzanilla (25 g/l) Ajo (1 g/l) Ajo (25 g/l) T. koningii Th003 (1 g/l) Testigo comercial: Procimidona (1 g/l) Testigo absoluto

Semanal Semanal Semanal Semanal Semanal Quincenal Sin aplicación

Número total de plantas* 140 140 140 140 140 140 140

*

Número de plantas con o sin solarización

6.5. Evaluaciones Semanalmente en cada subparcela con 28 plantas, se determinó el número de plantas enfermas en cualquier estado de avance de la enfermedad, calculando

52

estos datos al dividir el número de plantas enfermas entre el total de plantas por subparcela, para ser expresado como el porcentaje de incidencia del moho blanco. Ocho días después de terrminado el experimento (última aplicación), se realizó un muestreo en las subparcelas tratadas con T. koningii Th003, al igual que en las demás subparcelas, con el objetivo de evaluar la colonización de T. koningii Th003. En cada subparcela se tomó una muestra de suelo alrededor de la base del tallo de las plantas de lechuga. Las muestras fueron etiquetadas y almacenadas en bolsas plásticas, transportándolas al laboratorio de Fitopatología del CIAA - UJTL donde fueron almacenadas en una nevera. Cada muestra fue homogenizada y de cada una se tomo una submuestra de 10 g para ser diluida y puesta en agitación en 90 ml de agua peptonada estéril (dilución 1:100), a partir de la cual se realizaron diluciones seriadas 1:10 hasta 1: 1000. De cada dilución se sembraron por triplicado 0.1 ml en superficie del ARB. Después de cinco días de incubación a 23 ± 2 ºC, se efectuó el recuento de UFC/g contando las colonias con características macro y microscópicas del genero Trichoderma, ya que este biocontrolador es un microorganismo de amplia distribución y los métodos de identificación empleados no brindaban garantía para la identificación de las colonias de T. koningii Th003.

6.6. Análisis estadístico 6.6.1. Valor del Área Bajo la Curva de Progreso de la Enfermedad (ABCPE) Para cada una de las curvas de progreso de la enfermedad en cada tratamiento se determinó el valor del ABCPE. Siguiendo el método de la integral del trapezoide, descrito por Campbell & Madden (1990) y Xu (2006) según la ecuación dos. n −1

ABCPE = ∑ i

(

yi + yi + 1 2

)(t i + 1 − t i )

(2)

Donde, yi es la proporción de la incidencia en la n observación, ti son los días después del transplante y n es el número total de observaciones.

53

El valor del ABCPE se cálculo en el programa Excel del paquete informático Windows 2000.

6.6.2. Modelación Las curvas de progreso del moho blanco en cada una de las subparcelas con y sin solarización se analizaron por medio de diferentes modelos estadísticos (Campbell & Madden, 1990 y Xu, 2006), obteniendo el mejor ajuste en el Modelo Logístico (Verhulst, 1838) dado por la ecuación tres de la forma derivada.

y=

α

1+ e

(3)

− K ( ddt −γ )

Donde, y es el número de plantas enfermas, α es la máxima incidencia (asintota horizontal de la curva), e la base del logaritmo natural, K la pendiente en el punto de inflexión, ddt los días después del transplante y

γ el tiempo en ddt en el cual se

presenta el punto de inflexión de la curva. A partir del Modelo Logístico se obtuvieron los parámetros α , K y

γ para cada uno de los tratamientos. El análisis

se desarrollo en la herramienta informática SAS (Statistical Analysis Systems Institute, Inc., Cary, NC, USA). Al valor del ABCPE y los parámetros α , K y

γ en cada uno de los tratamientos, y el

promedio de malezas y esclerocios (en las parcelas con y sin solarización del suelo) se les realizó una prueba de t por medio del procedimiento del Modelo Lineal General (de sus siglas en inglés GLM) en el programa SAS.

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7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

7.1. Identificación de Sclerotinia spp. Se identificaron las especies S. minor y S. sclerotiorum a partir de aislamientos en tejidos de lechuga Batavia, afectados por el moho blanco y de los caracteres morfológicos de esclerocios cuantificados por medio del tamizaje de suelo. Los esclerocios hallados correspondientes a S. minor eran casi redondos, con un diámetro entre 0.5 - 2 mm y una medula blanca (Figura 17 A). En APD formó micelio algodonoso (con poco micelio aéreo), hialino, septado y altamente enramado, acompañado por la abundante formación de esclerocios al cabo de cinco días. Los esclerocios presentaron dos patrones de formación en la superficie del medio: El primero fue aleatorizado y el segundo formación de círculos concéntricos, junto con la agregación de algunos esclerocios (Figura 18 A, B, C y D). S. sclerotiorum produjo esclerocios irregulares, con un diámetro entre 2 - 15 mm (Figura 17 B), definido por un patrón de formación en APD hacía los extremos y pocas veces acompañado en el centro de la colonia por una conformación radial. Al igual que S. minor, presento similares características macro y microscópicas en el micelio. El cual se torno gris en la zona vegetativa al avanzar la edad del cultivo. En algunos aislamientos se presentó poco micelio aéreo y en otros solo micelio vegetativo, con una escasa producción de esclerocios (Figura 18 E y F) a partir de siete días. Estás características son debido a factores ambientales y la edad de los esclerocios recolectados de campo (Arbaoui et al., 2004). Los esclerocios de ambas especies estuvieron cubiertos por un exudado, el cual contiene sustancias orgánicas e inorgánicas involucradas en la regulación del desarrollo del esclerocio (Le Tourneau, 1979). De acuerdo a Khon (1979) y Le Tourneau (1979) los caracteres morfológicos de los esclerocios y el patrón de formación en medio de cultivo, corresponden a S. minor y S. sclerotiorum. Aunque ambas especies de Sclerotinia están emparentadas, los caracteres representan una amplia variabilidad.

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B A Figura 17. Esclerocios. A: S. minor y B: S. sclerotiorum

A

B

C

D

E

F

Figura 18. Colonias de S. minor y S. sclerotiorum. Crecimiento de S. minor A: Formación aleatorizada de esclerocios; B, C y D: Formación de esclercios en forma de círculos concéntricos, con agregación de algunos esclerocios; y crecimiento de S. sclerotiorum E: Formación de esclerocios hacía los extremos de la colonia y F: Formación de esclerocios en halos concéntricos

Si bien al género Sclerotinia pertenecen 250 especies (Kohn, 1979; Finch-savage et al., 2003 y Mitkowski & Colucci, 2006), solo tres especies patogénicas son reconocidas: S. trifoliorum Erikss., S. minor y S. sclerotiorum (Ekins et al., 2005; Kohn, 1979; Öhberg et al., 2005 y Willetts & Wong, 1974). En la lechuga solo están registradas las especies identificadas en está investigación (Bardin & Huang, 2001; Subbarao, 1998). No obstante, S. minor y S. sclerotiorum son hospedantes de más de 90 especies vegetales (Melzer et al., 1997 y Subbarao, 1998). De acuerdo a Ekins y colaboradores (2005) el mejor criterio para la clasificación de S. minor y S. sclerotiorum es el tamaño de los esclerocios y el hospedero del cual se aislaron. Lo cual contrastó con la identificación realizada por estos autores en diferentes

56

aislamientos de Sclerotinia spp., mediante el uso de sondas de restricción en fragmentos polimorfonucleares. Sin embargo, pese a las diferentes técnicas moleculares utilizadas (Atallah et al., 2004; Freeman et al., 2002; Jamaux & Spire, 1994; Meinhardt et al., 2002 y MertTürk et al., 2007), los caracteres morfológicos empleados para la identificación de las especies de Sclerotinia respaldan los resultados. A diferencia de S. sclerotiorum el cual ya estaba reportado en la Sabana de Bogotá por diferentes autores (Arias & Tautiva, 2006; Arias, Tautiva & Piedrahíta, 2006; Ávila & Velandia, 1992; Ávila & Gutiérrez, 1991a y 1991b; Devia & Gomezplata, 2002; Espinosa, 2005a; Martínez, 1999; Rodríguez, 2001 y Torres & Rodríguez, 2006), la identificación de S. minor en este trabajo se encuentra entre los primero reportes para la zona de estudio. Asociados a los aislamientos de esclerocios, frecuentemente se presentaron colonias características del genero Fusarium spp. (Figura 19) (Barnett & Hunter, 1972 y Nelson et al., 1983). Las cuales inhibieron (con una alta frecuencia) la germinación miceliogénica de los esclerocios en APD. De acuerdo a diferentes autores (Adams & Ayers, 1979; Merriman, 1976 en Delgado, 1990 y Mette & de Neergaard, 1999) los esclerocios en el suelo se encuentran parasitados por diferentes hongos. Así, Zazzerini & Tosi (1985) aislaron las especies F. avenaceum (Fr.) Sacc., F. equiseti (Corda) Sacc. y F. solani (Mart.) Sacc. a partir de esclerocios de S. sclerotiorum y Rodríguez y colaboradores (2006) identificaron la Ciclosporina A, a partir de una cepa de F. oxysporum antagónica en S. sclerotiorum. Lo cual indica que aunque no se determinó la actividad antagónica de los aislamientos de Fusarium spp., los esclerocios están sometidos a las interacciones con otros micoparásitos. Lo cual podría estar contribuyendo en la disminución de la viabilidad del inóculo disperso en el suelo. Además de representar el aislamiento de Fusarium spp. un potencial biocontrolador.

57

Figura 19. Colonia de Fusarium spp. asociada con el crecimiento de esclerocios en S. minor

7.2. Prueba de patogenicidad El 85 y 75% de las plantas inoculadas con esclerocios de S. minor y S. sclerotiorum respectivamente, presentaron los síntomas y signos típicos del moho blanco (Figura 20 A, B y C). Los síntomas en las hojas inoculadas avanzaron en sentido acopétalo hacía el tallo y raíces. Caracterizados por pudriciones acuosas, y abundante formación en los tejidos de las plantas interna y externamente de esclerocios característicos de las dos especies de Sclerotinia spp. (Figura 20 D y E). S. minor presentó un período de incubación de tres días, a partir de los cuales se evidenciaron los primeros síntomas característicos del moho blanco; seguido por un período de latencia de cuatro días, en los cuales se presento micelio y esclerocios. En S. sclerotiorum el período de incubación fue de cuatro días y el período de latencia cinco días con la aparición de micelio y siete días con la aparición de esclerocios. De acuerdo a Lumsden (1979) los esclerocios de S. minor tienen reservas energéticas, lo cual permite la directa penetración de la cutícula por las hifas en el huésped. Mientras en la germinación miceliogénica de S. sclerotiorum las hifas inicialmente deben nutrirse y desarrollarse. Lo cual explica la aparición temprana de los síntomas y signos en las plantas inoculadas con S. minor. Las hifas se adhieren con sustancias mucilaginosas por contacto directo en el hospedero. Donde por presión mecánica y secreción de enzimas Sclerotinia spp., penetra inter e intracelularmente los tejidos. Formándose los esclerocios al cabo de 3 - 7 días (Lumsden, 1979). Lo cual se presentó en las plantas inoculadas.

58

En los tejidos vegetales Sclerotinia spp. produce proteasas, celulasas, β-1-4 glucosidasas, pectinasas y poligalacturonasas (Billon et al., 2002; Hegedus & Rimmer, 2005 y Riou et al., 1991), las cuales junto con la secreción de ácido oxálico (Bolton et al., 2006) degradan la lámina media y la pared celular de los tejidos vegetales. Presentándose los síntomas característicos del moho blanco. De está manera se comprobaron los postulados de Koch (Agrios, 2002), confirmando la etiología del moho blanco.

A

B

D

E

C

F

Figura 20. Pruebas de patogenicidad. A y B: Síntomas característicos del moho blanco, C: colonización y pudrición basal, D y E: aislamiento de S. minor y S. sclerotiorum

7.3. Análisis espacial 7.3.1. Abundancia de esclerocios Asociados con una incidencia de 42% en el cultivo, se localizaron esclerocios de S. minor y S. sclerotiorum. Mayoritariamente se encontraron esclerocios de S. minor en un rango de 1 - 31 esclerocios/1000 g de suelo, representados por un total de 549 esclerocios. Mientras, para S. sclerotiorum hubo 1 - 3 esclerocios/1000 g de suelo, representado por un total de 58 esclerocios (Anexo 9 y Tabla 2). Por lo cual, S.

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minor fue la especie predominante dentro del lote de cultivo, en relación a la población de esclerocios. Tabla 2. Abundancia de esclerocios

S. minor S. sclerotiorum

Número total de esclerocios 549 58

ds*

X**

6.64 0.97

6.24 0.66

Número mínimo de esclerocios 1 1

Número máximo de esclerocios 31 3

*

Desviación estándar ** Media

Diferentes autores (Abawi & Grogan, 1979; Schwartz & Steadman, 1978 y Subbarao, 1998) indican que la formación de esclerocios en S. minor es mayor con relación a S. sclerotiorum. Debido a que el principal modo de diseminación de S. sclerotiorum, es a través de ascosporas, liberadas a partir de apotecios (Abawi & Grogan, 1979; Clarkson et al., 2004; Hao et al., 2003; Subbarao, 1998 y Young et al., 2004). Lo cual se evidenció en cabezas de lechuga con los síntomas típicos del moho blanco. Los cuales son originados por la diseminación y colonización de ascosporas (Subbarao, 1998 y Young et al., 2004). Sin embargo, Ekins y colaboradores (2005) reportan en S. minor, la formación de apotecios bajo condiciones in vitro, a partir de esclerocios agregados. Lo cual no es usual bajo condiciones de campo (Abawi & Grogan, 1979 y Subbarao, 1998). No obstante, en este primer cultivo no se hallaron apotecios. Por tal razón, los sintomas originados en las cabezas de lechuga, aunque eran tipicos del moho blanco, no pudieron ser atribuidos a alguna de las especies de Sclerotinia. Lo cual indica que se desconoce la especie que pudo formar apotecios dentro del lote de cultivo. De acuerdo con Hao & Subbarao (2006) el volumen de competencia de un esclerocio de S. minor es de 100 cm3 con 4 - 5 esclerocios para originar una probabilidad de infección del 100%. Sin embargo, los resultados obtenidos, demuestran que 1 - 31 esclerocios/1000 cm3 de suelo están asociados con una incidencia general del 42%. Lo cual sugiere que bajo las condiciones del trópico colombiano el volumen de competencia para un esclerocio podría ser mayor. No obstante, la incidencia en el cultivo se indica de forma general, ya que no se

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clasificaron las plantas de lechuga afectadas de acuerdo a la especie de Sclerotinia presente.

7.3.2. Correlación espacial Se presentó un patrón de distribución espacial agregado, con ausencia de asociación espacial entre cada uno de los puntos muestreados para S. minor y positiva en S. sclerotiorum (Anexo 10 y 11). La distribución espacial de esclerocios de S. minor no se ajustó a ninguno de los modelos matemáticos presentados en el programa Surfer®. De acuerdo al semivariograma omnidireccional (Figura 21 A y Tabla 3) la distribución espacial de esclerocios de S. minor no tiene dependencia espacial entre cada uno de los focos de agregación (Figura 22 A). Lo cual es debido a las oscilaciones entre los puntos muestreados, sin que el semivariograma alcanzara un punto de estabilización, producto de la alta agregación y cantidad de esclerocios, evidenciado en el mapa de superficie de distribución en 3D y la relación varianza-media (Tabla 4). Mientras, S. sclerotiorum presentó asociación espacial isotrópica entre 1 - 6 m, de acuerdo al semivariograma y los parámetros del Modelo Exponencial ajustado (Figura 21 B y Tabla 3), con diferentes focos de agregación dentro del lote (Figura 22 B y Tabla 4). Después de 6 m entre los focos de agregación, los valores de la semivarianza pierden asociación espacial y decrecen. Lo cual pudo ser a causa del bajo número de esclerocios hallados. Debido a que la modelación de la distribución espacial de esclerocios permaneció constante direccional y omnidireccionalmente en 0°, 45°, 90° y 135°, no se modelaron los semivariogramas direccionales. Tabla 3. Parámetros del semivariograma Modelo Efecto pepita Meseta No ajustó 27 --S. minor 0.05 0.88 S. sclerotiorum Exponencial

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Rango (m) --1-6

A

B

Figura 21. Semivariogramas omnidireccionales. A: S. minor y B: S. sclerotiorum Tabla 4. Relación varianza-media S. minor S. sclerotiorum

S2* 44.1 0.94

X** 6.24 0.66 *

Patrón de distribución Agregado Agregado

Varianza ** Media

62

30

25

20

2 15

10

1 5

A

B

Figura 22. Mapas en 3D de superficie del patrón de distribución espacial de esclerocios. A y B: Distribución de esclerocios de S. minor y S. sclerotiorum respectivamente

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Contrario a la falta de asociación espacial reprtado por Wu & Subbarao (2006) para ambas especies de Sclerotinia, la asociación espacial de S. sclerotiorum evidenciada en este trabajo, se encuentra en el rango de 8 m reportado por Hao & Subbarao (2005). Según Chellemi y colaboradores (1988) la distribución espacial de plantas enfermas es el reflejo del patrón de distribución de inoculo en el suelo. Así, la distribución agregada de esclerocios resulta en un patrón de agregación de plantas enfermas (Dillard, 1984; Hao & Subbarao, 2005 Hao & Subbarao, 1997). Producto de las prácticas culturales desarrolladas durante la producción del cultivo (Dillard & Grogan, 1985; Hao & Subbarao, 2006; Kurle et al., 2001; Subbarao et al., 1996 y Subbarao et al., 1995). Lo cual tuvo una influencia en la distribución de esclerocios, debido a la reincorporación de restos de plantas enfermas por parte de los agricultores (práctica normalmente realizada). De está forma la diseminación de Sclerotinia spp. fue mayor. Similares resultados han sido reportados (Dillard & Grogan, 1985 y Hao & Subbarao, 2006) en cultivos de lechuga en California (EE.UU.) y por Xiao y colaboradores (1997) para la distribución de microesclerocios de Verticillium dahliae Kleb. en cultivos de coliflor, y Chellemi y colaboradores (1988) para la distribución de P. nicotianae Breda de Haan var. Parasitica en un cultivo de ají (Capsicum spp.). De acuerdo con Rossi y colaboradores (1992) en Real & McElhany (1996) el semivariograma puede ser afectado por diferencias a escala local en la media y la varianza. Lo cual pudo ser la causa principal para el alto valor de efecto pepita en el semivariograma de S. minor. Lo que indica la existencia de un proceso espacial que opera a distancias más pequeñas, que las que fueron tenidas en cuenta para los valores de cada punto muestreado. Por lo tanto, se deben desarrollar mejores técnicas de muestreo y un intervalo de muestreo más cortó, se debería incorporar en futuros estudios.

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7.4. Manejo integrado del moho blanco 7.4.1. Efecto de la solarización del suelo Los valores de temperatura (Tabla 5) registrados en las parcelas con y sin solarización mostraron diferencias significativas (gl = 4734, |t| = 79.16 y P < 0.0001, y Anexo 12). La solarización del suelo incremento substancialmente la temperatura (Figura 23 y Tabla 5). La precipitación acumulada durante el experimento (27 de enero - 27 de febrero, 2006) fue de 45.6 mm. Durante todos los días entre las 11:00 - 14:00 las parcelas solarizadas registraron temperaturas de 70 ºC. La máxima temperatura registrada, fue mayor a la de 50 ºC, reportada por Arias & Tautiva (2006) en un ensayo similar durante la misma época en el sur-occidente de la Sabana de Bogotá. De acuerdo a las recomendaciones de varios autores (Bond & Turner, 2005; Gamliel et al., 2000; Gamliel & Katan, 1993; Haidar et al., 1999 y Katan, 2000) temperaturas superiores a 60 ºC por 30 - 60 min. durante la solarización del suelo, son óptimas para reducir la población de malezas y patógenos. Sin embargo, en otros reportes (Gelsomino et al., 2006 y Porras et al., 2006) mencionan que el efecto de la solarización del suelo durante períodos prolongados de tiempo puede originar la acumulación de sustancias tóxicas, producto de la degradación de la materia orgánica y generar efectos letales en microorganismos benéficos; ocasionando la invasión por diferentes patógenos oportunistas. Aunque la zona de estudio cuenta con las condiciones climáticas ideales para la práctica de la solarización del suelo; es importante tener en cuenta los efectos colaterales, mencionados anteriormente. Tabla 5. Temperaturas en las parcelas con y sin solarización Parcela Temperatura (°C) ds* Temperatura (ºC) Temperatura (ºC) Principal promedio mínima máxima Con solarización 45.572 11.37 22 70.4 Sin solarización 29.293 4.38 17.4 40.9 *

Desviación estándar

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Figura 23. Promedio de temperaturas máximas registradas en las parcelas con y sin solarización

7.4.1.1. Efecto de la solarización del suelo en la población de malezas La maleza más abundante fue la ortiga negra (U. urens L.). La cual, se logro reducir significativamente (gl = 13.2, |t| = 4.08 y P < 0.0013, y Anexo 13) después de la solarización del suelo (Figura 24). El promedio de malezas en las parcelas solarizadas fue de 32 plantas/m2, mientras en las parcelas sin solarizar eran 1044 plantas/m2; razón por la cual, se obtuvo una reducción del 96.93% en la ortiga negra. Bond & Turner (2005) reportan similares resultados mediante la aplicación de flameo de llama al suelo. Jiménez & Zuluaga (2006) reportan a la ortiga como la maleza dominante en Cota, con una frecuencia del 82%. Varios autores (Bond & Turner, 2005; Elmore, 1995; Sahile et al., 2005 y Tamietti & Valentino, 2001) indican que el efecto supresor de la solarización del suelo sobre las malezas, es debido a las altas temperaturas alcanzadas. Las altas temperaturas originan daños en la actividad enzimática, el metabolismo de proteínas y la estructura de la membrana. Adicionalmente, una alta concentración de CO2 en la atmósfera del suelo, durante la solarización, puede inducir la dormancia en las semillas. Como resultado, la

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solarización reduce las semillas y malezas (Patrício et al., 2006 y Stevens et al., 2003). Aunque el efecto de la solarización se presenta principalmente en la superficie del suelo, disminuyendo con la profundidad a través del perfil de suelo (Benlioglu et al., 2005; Katan, 1996; Patrício et al., 2006 y Tamietti & Valentino, 2001); podría ser posible la inhibición parcial de las semillas de ortiga y otras malezas en las capas profundas del suelo.

Figura 24. Efecto de la solarización del suelo en las malezas

7.4.1.2. Efecto de la solarización del suelo en la población de esclerocios Las altas temperaturas redujeron el número de esclerocios. Hubo una reducción altamente significativa (gl = 8, |t| = - 3.73 y P < 0.0058, y Anexo 14) teniendo en cuenta los datos en las subparcelas correspondientes a los testigos absolutos. A 2 cm de profundidad (en todas las subparcelas), solamente se hallaron esclerocios de S. minor (Tabla 6). Similares resultados han sido reportados para ambas especies de Sclerotinia spp. (Barros et al., 2004; Ferraz et al., 2003; Phillips, 1990; Porter & Merriman, 1985 y Vannacci et al., 1988). De acuerdo a varios autores (Ferraz et al., 2003; Patrício et al., 2006; Porter & Merriman, 1985 y Stevens et al., 2003) el mayor efecto de la solarización del suelo se da en los primeros diez cm del perfil del suelo. Sin embargo, Phillips (1990) reporta mayores efectos a 5 cm de profundidad en S. sclerotiorum, y Vannacci y colaboradores (1988) reportan efectos a 2 cm de profundidad en S. minor. No obstante, el efecto de las altas temperaturas decrece con la profundidad, a través del perfil del suelo (Barros et al., 2004; Elmore, 1995; Katan, 2000 y 1996; Lopez et al., 1997; Marque et al., 2002 y Porras et al., 2006). Por lo tanto el efecto de la solarización del suelo logró ser mayor sobre los

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esclerocios hallados a 2 cm de profundidad. Aunque también debido a la escasa profundidad de muestreo, pudo haber esclerocios de S. sclerotiorum en las capas profundas del suelo. La inactivación térmica de esclerocios de S. minor se da a 40 ºC durante 39 h, a 45 ºC por 6 h y a 50 ºC por 2 h, y en S. sclerotiorum a temperaturas superiores a 35 ºC (Ben-Yephet et al., 1993 y Ferraz et al., 2003). Similarmente, la germinación de apotecios y por lo tanto la cantidad de ascosporas dispersadas se reduce principalmente en los 5 cm en el perfil del suelo (Phillips, 1990). Adicionalmente, la microflora y otros patógenos son eliminados (Katan, 1996 y Ristaino et al., 1991). Sin embargo, los microorganismos biocontroladores son termotolerantes y se reactivan al final del proceso (Ferraz et al., 2003; Otieno et al., 2003; Porras et al., 2006; Ristaino et al., 1991; Stevens et al., 2003 y Tjamos & Paplomatas, 1988). Razón por la cual, se asume que las altas temperaturas registradas, contribuyeron a la muerte o inactivación de la mayoría de esclerocios hallados y demás inoculo presente. Tabla 6. Abundancia de esclerocios de S. minor en las parcelas con y sin solarización Número de esclerocios/100 g de suelo Subparcela Con solarización Sin solarización T. koningii Th003 9 27 Ajo 1 g/l 1 20 Ajo 25 g/l 4 19 Manzanilla 1 g/l 3 18 Manzanilla 25 g/l 2 14 Procimidona 9 14 Testigo absoluto 0 25 Total 28 137

El principal efecto de las altas temperaturas (durante la solarización del suelo), es debido al debilitamiento de los esclerocios (Phillips, 1990 y Tamietti & Valentino, 2001). Originándose daños físicos como fisuras y desintegración (Ferraz et al., 2003; Phillips, 1990 y Porter & Merriman, 1985). Junto con la colonización de microorganismos, probablemente por los exudados liberados (Ferraz et al., 2003; Phillips, 1990 y Vannacci et al., 1988). De este modo el inóculo es degradado por microorganismos biocontroladores y saprofitos (Ferraz et al., 2003; Melero et al.,

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2000 y Ristaino et al., 1991), los cuales son termotolerantes (Otieno et al., 2003; Phillips, 1990; Porras et al., 2006; Stevens et al., 2003 y Vannacci et al., 1988). Por este proceso, hay un aumento de la eficacia de la solarización del suelo y se disminuye el inoculo para el siguiente ciclo de cultivo. La solarización del suelo altera las propiedades biológicas y físico-químicas del suelo (Gelsomino et al., 2006 y Katan, 1996). Así, Patrício y colaboradores (2006) reportan una alta solubilización del Mn, y Stevens y colaboradores (2003) un aumento en los iones NH+, lo cual está asociado a la disminución del inoculo de patógenos radiculares (Patrício et al., 2006 y Stevens et al., 2003). Por lo cual, las altas temperaturas registradas, pudieron originar un suelo supresivo. No obstante, el efecto a largo plazo (para los siguientes cultivos) de las altas temperaturas no fue determinado, y dependería de factores como el volteo del suelo, y la viabilidad y densidad de inoculo en las capas profundas de este.

7.4.2. Efecto de diferentes productos en el control del moho blanco 7.4.2.1. Valor del ABCPE El valor del ABCPE para los tratamientos en conjunto con las parcelas con y sin solarización (Figura 25) no mostró diferencias significativas (gl = 1, F-Valor = 6.09 y P = 0.0691, y anexo 15), por ese motivo en el análisis de contrastes ortogonales (Tabla 7) sólo se muestra las diferencias entre los tratamientos. Sin embargo, la solarización del suelo en conjunto con cualquiera de los tratamientos, con excepción de T. koningii Th003; redujo levemente la incidencia del moho blanco. El valor de ABCPE para el testigo absoluto presentó diferencias significativas frente a todos los tratamientos (Tabla 7), pero no mostró diferencias significativas al compararlo con los extractos vegetales, indicando que las diferencias encontradas se debieron al efecto de la Procimidona y T. koningii Th003 sobre Sclerotinia spp. El ABCPE para el tratamiento con Procimidona, mostró diferencias altamente significativas con respecto a T. koningii Th003 y los extractos vegetales. Así mismo, el ABCPE de T. koningii Th003 reveló diferencias significativas con el de los extractos vegetales.

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Figura 25. Valor del ABCPE en cada uno de los tratamientos en las parcelas con y sin solarización Tabla 7. Análisis de contrastes ortogonales para el valor del ABCPE en cada uno de los tratamientos Contraste ortogonal gl F-Valor Pr > F Testigo absoluto Vs Tratamientos restantes 1 6.18 0.0164** Ajo 1 g/l Vs Ajo 25 g/l 1 0 0.9933 T. koningii Th003 Vs Extractos vegetales 1 5.45 0.0238** Manzanilla 1 g/l Vs Manzanilla 25 g/l 1 1.6 0.2116 Procimidona Vs T. koningii Th003 1 28.12 F

244.894512 244.894512 6.92 0.0114 1.045819 1.045819 0.03 0.8642 182.052594 182.052594 5.15 0.0278 182.052594 182.052594 5.15 0.0278 53.777515 53.777515 1.52 0.2236 1220.081088 1220.081088 34.49