CARACTERIZACIÓN

DE CULTIVOS INICIADORES EN

PRODUCTOS CÁRNICOS.

PARTE 1

Tatiana Beldarraín*, Yamira Cepero, Aster Bruselas, Ramón Santos, Magdalena Ramos, Yamilé Moya, Margarita Núñez y Norma Vergara Instituto de Investigaciones para la Industria Alimenticia Carretera al Guatao, km 3½, C.P. 19 200, La Habana, Cuba E-mail: [email protected] RESUMEN

ABSTRACT

En este trabajo se caracterizaron tecnológicamente, a escala de laboratorio, 5 cultivos iniciadores. Las propiedades tecnológicas evaluadas fueron pH en caldo glucosado, viabilidad del cultivo, tolerancia a elevada concentración de sal, inactivación a 60 ºC por 30 min, entre otras. Todos los cultivos, por sus aptitudes acidificantes y población celular se consideraron aptos para su empleo industrial y se pudieron categorizar como productores de baja y alta acidez. Palabras clave: bacteria ácido-láctica, cultivos iniciadores, caracterización, medios de cultivo, productos cárnicos.

Meat products starters characterization. Part I

INTRODUCCIÓN El uso de cultivos iniciadores para dirigir las fermentaciones industriales está ampliamente difundido. Esto ha traído como consecuencia que durante los últimos años hayan aparecido en el mercado numerosos productos (bioconservadores, cultivos protectores, iniciadores, probióticos) que proponen formas de conservación alternativas a las tradicionales o proporcionan a los alimentos la cualidad de ejercer un efecto beneficioso para la salud paralelamente a su aporte nutritivo (1).

*T atiana Beldarraín Iznaga *Tatiana Iznaga: Licenciada en Microbiología (U.H., 1996). Especialista en Carne y Productos Cárnicos (IIIA, 1999). Máster en Ciencia y Tecnología de los Alimentos (IFAL, 2006). Investigador Agregado del grupo de Ciencias de la Vicedirección de Carne. Labora en la Calidad Microbiológica de Productos Cárnicos e Higiene de Plantas Procesadoras de Alimentos.

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Five starters were technologically characterized to laboratory scale. The pH in glucose broth, viability and salt high concentration tolerance, inactivation to 60ºC by 30 min, between other properties, were evaluated. All the starters by their technological properties were considered capable for their industrial employment and they could be categorized as low and high acidity producers. Key words: lactic acid bacteria, starters, media, characterization, meat products.

Los cultivos iniciadores se definen como microorganismos que se presentan en estado puro o mixto, seleccionados de acuerdo con sus propiedades específicas y que al agregarlo a los alimentos mejoran su aspecto, aroma, sabor y facilitan la tecnología (2). El empleo de cultivos iniciadores comerciales en la industria cárnica ofrece una serie de ventajas al industrial y al consumidor, por lo que desde hace unos años es una práctica habitual en la elaboración de productos fermentados. Entre ellas se encuentran que muchas de las cepas que forman parte de los cultivos iniciadores producen diversos factores que inhiben el desarrollo de otros microorganismos, por lo que al inocular una cantidad elevada de estas, se asegura un efecto conservador, lo que incide positivamente sobre el tiempo de fabricación, ya que no hay que esperar a que se desarrollen las bacterias lácticas presentes de forma natural pues se inoculan en la cantidad deseada. Además, se consigue la homogeneidad del producto y su empleo permite controlar y dirigir el metabolismo bacteriano con lo que se mejoran las características sensoriales de los

productos. Los microorganismos que pueden producir alteraciones en el producto no se desarrollan tan fácilmente como lo harían con la biota autóctona, lo que reduce el número de piezas defectuosas y ellas son de fácil uso tecnológico (3, 4). El objetivo del presente trabajo fue identificar las especies que constituyen los cultivos iniciadores y evaluar sus propiedades tecnológicas a escala de laboratorio.

Una vez reestablecida la morfología celular en caldo de mantenimiento apropiado, se realizaron siembras en medio agar para conteo en placas (ACP) para el aislamiento de las colonias. Para ello se empleó el método de diluciones seriadas en agua peptonada a 0,1 % y siembra por inoculación profunda en placa con doble nivel. Las diluciones se realizaron hasta 109 y se escogió este medio de cultivo teniendo en cuenta el crecimiento obtenido en los diferentes caldos analizados.

MATERIALES Y MÉTODOS La Tabla 1 refleja que se utilizaron 5 cultivos que han sido empleados en la elaboración de embutidos fermentados (5, 6). Todos los cultivos se recibieron en medio Agar Leche y se reactivaron mediante siembra en los medios de cultivo caldo MRS y caldo APT con el objetivo de conocer el caldo de establecimiento celular apropiado, se incubaron a 30 ºC durante un espacio de tiempo de 16 a 24 h y se conservaron en refrigeración entre resiembras consecutivas. Además, para garantizar el control de la composición de los cultivos, se realizaron exámenes microscópicos mediante tinción simple en azul de metileno (7).

Para la identificación de las cepas que constituyen los cultivos iniciadores 1, 2 y 3, se realizaron las pruebas bioquímicas y fisiológicas empleadas en la descripción taxonómica y se utilizó la metodología que incluye las pruebas de catalasa, oxidasa, ácido de la glucosa, fermentación de carbohidratos y respuesta ante la tinción de Gram (8). La Tabla 2 muestra las pruebas que se hicieron para identificar las especies. Para cada cultivo se realizaron 4 réplicas.

Tabla 1. Composición microbiológica de los cultivos empleados No 1 2 3 4 5

Composición Desconocida Desconocida Desconocida Lactobacillus casei Lactobacillus acidophillus

Procedencia Banco de cepas del Banco de cepas del Banco de cepas del Banco de cepas del Banco de cepas del

IIIA IIIA IIIA IIIA IIIA

Tabla 2. Principales propiedades tecnológicas estudiadas Propiedad evaluada Tolerancia a la sal 5 % Tolerancia a la sal 10 % Crecimiento a 5 ºC Crecimiento a 15 ºC Crecimiento a 30 ºC Crecimiento a 45 ºC Inactivación a 60 ºC por 30 min Producción de peróxido Prueba de la oxidasa Tinción de Gram Ácido de la glucosa Licuefacción de las grasas

Medio empleado o prueba realizada Caldo ATP + 5 % de NaCl Caldo ATP + 10 % de NaCl Caldo ATP, incubación a 5 ºC Caldo ATP, incubación a 15 ºC Caldo ATP, incubación a 30 ºC Caldo ATP, incubación a 45 ºC Caldo ATP Prueba de la catalasa Producción de acetoína Caldo glucosado (Oxoid, 1980) ACP 100 g grasa a estudiar 5 mL Tween 80 1 mL

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Para la evaluación de las principales propiedades tecnológicas, los cultivos se reactivaron durante dos semanas en el caldo apropiado, resembrándose cada 72 h. Posteriormente se procedió a evaluar los cultivos según las propiedades tecnológicas de importancia (Tabla 2) como son la morfología celular y pureza, capacidad acidificante, viabilidad celular, tolerancia a 5 y 10 % de sal, catalasa, crecimiento a 5, 15, 30 y 45 ºC, licuefacción de la grasa e inactivación a 60 ºC por 30 min (9). Para cada cultivo se realizaron 4 réplicas. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

en caldo MRS todas las cepas analizadas tenían un débil crecimiento y esto podría atribuirse a la ausencia de algunas sales en este medio que sí están presentes en caldo APT (donde se obtuvo más turbidez luego de las resiembras sucesivas) y que son importantes para el desarrollo de cepas empleadas como cultivos iniciadores en productos cárnicos. En estos resultados se observa que el poco crecimiento de los iniciadores en el medio MRS corrobora el hecho de las exigencias nutricionales en cuanto a sales minerales y la idoneidad del caldo APT para las especies implicadas en la fermentación de embutidos cárnicos (10).

La Tabla 3 presenta los resultados del crecimiento de los 5 cultivos en los caldos MRS y APT. Los cultivos 4 y 5 tuvieron un crecimiento abundante en caldo MRS, no así el 1, 2 y 3 que presentaron una ligera turbidez en el medio a las 16 h de incubación, esto se atribuye a que las cepas que constituyen los cultivos 4 y 5 son lactobacilos, los cuales tienen sus requerimientos nutricionales cubiertos con el medio MRS, lo que no sucede con los otros cultivos. Luego de las resiembras

Tabla 3. Reactivación y crecimiento de los cultivos iniciadores en diferentes medios de cultivo (incubación a 30 ºC por 16 a 24 h) Cultivo

Caldo MRS

1

-

2 3

d

4

++

5

++

Caldo APT

Morfología celular Bacilos cortos y cocobacilos, agrupados en duplas ++ abundantes y cocos en racimos ++ Cocos en parejas y tétradas y cocos en racimos. ++ Mezcla de bacilos largos y cortos y cocos en racimos. Bacilos alargados, típicos de bacterias ácido lácticas ++ aislados Bacilos alargados y filamentosos, típicos de bacterias + acidolácticas. +: crecimiento positivo ++: crecimiento abundante.

d: crecimiento débil

Tabla 4. Resultados de las características evaluadas para la identificación hasta género de los cultivos 1, 2 y 3

Código 1 2 3 Leyenda:

10

Gram

Catalasa

+ + + + + + -: negativo

Oxidasa

+ + + +

+ + + +: positivo

Ácido de glucosa

Ferment. Carboh.

+ + + + + + F: Fermenta la glucosa

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Género identificado

Staphylococcus spp F Leuconostoc spp F Pediococus spp O Staphylococcus spp F Lactobacillus spp Staphylococcus spp F O: Oxida la glucosa.

La Tabla 4 muestra los resultados de las características evaluadas para la identificación de género de los cultivos 1, 2 y 3. Todas las cepas analizadas fueron grampositivas y si se toman en consideración, además, las características evaluadas, así como que son cocos agrupados en racimos, los cultivos iniciadores 1, 2 y 3 contenían estafilococos. La Tabla 5 presenta que la fermentación anaerobia de la glucosa, así como el crecimiento a 45 ºC y la tolerancia a concentraciones de sal de hasta 10 % permitió identificar la especie del género Staphylococcus sp., que se encontraban presentes en los cultivos 1, 2 y 3. De acuerdo a los resultados positivos en la fermentación de lactosa, galactosa y glucosa pero no de maltosa y sacarosa, la especie presente en los cultivos 1, 2 y 3 es St. carnosus. Este género ha adquirido gran importancia como cultivo iniciador en productos cárnicos, debido a que son catalasa y nitratoreductasa positivos, lo que posibilita su intervención en los procesos de formación y mantenimiento de la estabilidad del color típico de los productos curados ligeramente fermentados. Además, su capacidad de crecer y metabolizar distintos compuestos en condiciones de anaerobiosis, lo que lo ha convertido en el género más empleado como cultivo iniciador en productos cárnicos (2, 11, 12). El cultivo 1 contenía diplococos pequeñitos, los que podrían ser del género Leuconostoc spp. Este microorganismo se caracterizó por fermentar la glucosa en condiciones de anaerobiosis, así como los carbohidratos estudiados, creció a 5 % de sal, no licuó la grasa y se inactivó a 60 ºC. Con todas estas características, así como por la morfología microscópica, se trata de Leuconostoc pentosus, por lo cual se pudo concluir que el cultivo 1 estaba integrado por las cepas St. carnosus y L. pentosus. Al identificar el cultivo 2, se comprobó que se trataba de St. carnosus y Pediococcus spp. El hecho de que no crecieran a 5 ºC y fermentaran la maltosa y la lactosa, permitió identificar la especie como Pediococcus pentasaceus. Esta especie microbiana se ha empleado como cultivo iniciador para la elaboración de embutidos fermentados con buenos resultados y que, además, inhibían la acción de cepas patógenas como St. aureus, Salmonella spp y Escherichia coli (13).

El pH final alcanzado por la cepa P. pentasaceus (3,8) fue el más bajo logrado por todas las cepas evaluadas, por lo que se le puede considerar como de elevado valor tecnológico para la elaboración de productos cárnicos fermentados. Además, como fue capaz de crecer a temperaturas de 45 ºC podría ser importante si se deseara elaborar un producto a alta temperatura de fermentación. El cultivo 3 estuvo formado por St. carnosus y Lactobacillus spp que por su morfología microscópica son formas bacilares pequeñas, que no crecen a 45 ºC y fermentan los carbohidratos presentados y toleran hasta 10 % de sal, lo que permitió identificar al cultivo 3 como una mezcla de St. carnosus y Lactobacillus plantarum. En la Tabla 6 se presentan los resultados de las principales propiedades tecnológicas evaluadas, así como las respuestas obtenidas de cada cultivo. Todos los cultivos corresponden con las características de morfología microscópica esperada. En ninguno de ellos se observó presencia de células ajenas al cultivo. Además, todos los cultivos fueron catalasa negativos, lo cual es importante pues la habilidad de algunas cepas de producir peróxido en presencia de oxígeno del aire es una propiedad indeseable ya que cuando hay oxígeno en la masa del embutido, la grasa es susceptible a la oxidación y el peróxido puede, además, causar decoloración (10). Por su parte, todos los cultivos crecieron a temperaturas de 5, 15 y 30 ºC. El crecimiento a temperaturas superiores a 15 ºC es beneficioso en algunos tipos de tecnología donde se prefieren temperaturas bajas de fermentación por largos períodos de tiempo y cuyas temperaturas varían entre 15 y 35 ºC. Todos los cultivos crecieron en caldo APT con 5 % de sal, lo que se considera un prerrequisito importante ya que la mezcla de embutidos contiene NaCl en el rango de 5 a 8 %. Se aprecia que los cultivos 1 y 3 fueron capaces de crecer a concentraciones de sal de hasta 10 %, lo cual no sucede con los cultivos 2, 4 y 5. En la Tabla 6 se observa, también, que todas las cepas se inactivaron al someterlo a condiciones de 60 ºC durante 30 min. Esta propiedad es muy ventajosa en el caso que se deseara detener la fermentación.

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Catalasa Crecimiento 5 ºC Crecimiento 15 ºC Crecimiento 30 ºC Crecimiento 5 % NaCl Crecimiento 10 % NaCl Inactivación a 60 ºC, 30 min Leyenda: -: negativo

Morfología celular

Pruebas realizadas 1 Bacilos cortos y cocobacilos agrupados en duplas abundantes y cocos en racimos + + + + + + +: positivo. + + + + +

Cocos en parejas y tétradas y cocos en racimos.

2

+ + + + + +

Mezcla de bacilos largos y cortos y cocos en racimos.

Cultivos 3

4

+ + + d +

+ + + +

Bacilos alargados y filamentosos, típicos de bacterias acidolácticas.

5

+ + + + + 4,4 F + + + + + + + Lactobacillus plantarum 3

Bacilos alargados, típicos de bacterias ácido lácticas aislados

Respuesta + + + + + + + + 4,4 3,8 F O + + + + + + + + + + + + Leuconostoc pentosus Pediococcus pentasaceus 1 2

Tabla 6. Principales propiedades tecnológicas estudiadas

Pruebas Tinción de Gram + Catalasa + Crecimiento 5 ºC + Crecimiento 15 ºC + Crecimiento 30 ºC + Crecimiento 45 ºC + pH final en caldo glucosado 4,5 Fermentación carbohidratos F Glucosa + Sacarosa Maltosa Lactosa + Galactosa + Crecimiento 5 % NaCl + Crecimiento 10 % NaCl + Licuefacción de la grasa + Inactivación a 60 ºC, 30 min + Staphylococcus carnosus Cepas Cultivos 1, 2, 3 Leyenda: -: negativo +: positivo.

Tabla 5. Características fisiológicas y bioquímicas de las cepas que componen los cultivos 1, 2 y 3

Los cultivos que producen un decrecimiento drástico del pH entre el primero y el cuarto día de fermentación, con valores por debajo de 3,5, son beneficiosos desde el punto de vista higiénico, ya que provocan la inhibición de la flora contaminante e indeseable, incluyendo patógenos (14). Como se puede observar, a las 96 h de incubación, los cultivos alcanzaron valores de pH entre 3,5 y 4,5.

El pH y la producción de acidez alcanzados por los diferentes cultivos se aprecia en las Fig. 1 y 2, respectivamente. En las primeras 24 h, la disminución del pH en medio caldo glucosado de los 5 cultivos en estudio fue notable, estando todos los valores entre 4 y 4,5. Esta disminución del pH podría atribuirse a la producción de ácido láctico que se forma producto de la fermentación de la glucosa presente en el medio. 7,00 6,50

1

2

3

4

5

6,00 p

5,50 5,00 4,50 4,00 3,50 0

24

48 72 Tiempo (horas)

96

Fig. 1. Comportamiento del pH alcanzado por los diferentes cultivos hasta las 96 h de incubación.

Valores medios de las cantidades de ácido láctico (%)

2

1

2

3

4

5

1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

24

48 Tiempo (h)

72

96

Fig. 2. Valores medios de la acidez alcanzados por los diferentes cultivos hasta las 96 h de incubación.

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Por los valores de pH alcanzados en caldo glucosado a los 4 días, los cultivos 1 y 4 se consideran débilmente acidificantes ya que a las 96 h poseen valores de pH de 4,15 y 4, lo cual se corresponde con valores de acidez de 0,56 y 0,65 %, respectivamente. Los cultivos 3, 2 y 5 se consideran productores de alta acidez al presentar valores de pH de 3,95; 3,82 y 3,75; los que se corresponden con una acidez de 0,98; 1,73 y 1,87 % de ácido láctico, respectivamente. El hecho de que el cultivo 2 tenga un pH final de 3,82 en caldo glucosado podría deberse a la presencia de P. pentasaceus, que como cepa individual alcanzó el pH más bajo en ese mismo medio. La elección de una cepa más o menos acidificante dependerá de las características del embutido a obtener, así como de la tecnología a emplear. La obtención de valores de pH de hasta 3,5 se debe a pruebas realizadas en medio de cultivo con alta concentración de carbohidratos. En un medio cárnico la capacidad de buffer y el pH inicial influirán en la capacidad en la caída del pH y se necesitará más producción de ácido por las bacterias para bajar el pH del producto (9).

Se destaca que de los 5 cultivos, 3 son mixtos y en 1 de ellos, el cultivo 3, estaba presente L. plantarum, especie que se considera efectiva y abundante en la fermentación de embutidos tanto controlada como espontánea (9). CONCLUSIONES La caracterización de las cepas de acuerdo a su morfología microscópica y a sus propiedades fisiológicas y bioquímicas, permitió su identificación con vistas a la aplicación industrial. El cultivo 1 estuvo integrado por las cepas Staphylococcus carnosus y Leuconostoc pentosus, el cultivo 2 por Staphylococccus carnosus y Pediococcus pentasaceus, mientras que el 3 estuvo formado por una mezcla de Staphylcoccus carnosus y Lactobacillus plantarum. Todos los cultivos, por sus aptitudes acidificantes y población celular se consideraron aptos para su empleo industrial como cultivos iniciadores. La elección de una cepa más o menos acidificante dependerá de las características del embutido a obtener así como de la tecnología a emplear.

La Tabla 7 refleja que al comportamiento frente a las grasas ninguno de los cultivos en las primeras 72 h presentan actividad lipolítica, pero a las 96 h, los cultivos 1, 2, 3 y 5 son capaces de licuar la grasa, lo cual los hace atractivos para ser empleados como cultivo iniciador para los productos cárnicos. La actividad lipolítica de St. carnosus (presente en los cultivos 1, 2 y 3) podría favorecer la adquisición del color, sabor y aroma deseado en los productos crudos fermentados (12).

Tabla 7. Resultados del comportamiento frente a grasas Cultivo 1 2 3 4 5 Leyenda:

14

Tiempo (h) 0 24 48 72 96 + + + + + + + + -: negativo +: positivo.

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