CARACTERIZACIÓN PARCIAL, ESTUDIO BIOQUÍMICO Y MOLECULAR DEL GRÁNULO DE ALMIDÓN DE MAÍZ 1. RESUMEN Recientemente las variedades pigmentadas de maíz han cobrado mayor interés, Debido a que éstas presentan un alto contenido de antioxidantes naturales; por lo que la aplicación comercial de estos maíces tiene muchas posibilidades. Para explotar adecuadamente estos granos hace falta investigar las características de su principal constituyente que es el almidón. El almidón está organizado por partículas discretas conocidas como gránulos, su tamaño forma, composición, va a estar directamente relacionado con sus propiedades funcionales y por lo tanto con sus posibles usos en la industria. En este trabajo se estudió a los gránulos de maíz azul (MA), comparado con los gránulos de maíz blanco (MB). El almidón se aisló del endospermo. Ambos almidones presentaron un alto contenido de proteínas, por lo que se realizó una extracción para eliminar esas proteínas, lo cual produjo una disminución de 8.3% a 1.8% en maíz azul (MA) y de 7.5% a 2.3% en maíz blanco (MB), obteniéndose así un almidón purificado con un contenido de almidón total de 92.96 y 93.8% para MA y MB, respectivamente. El almidón dañado de las muestras fue de 12.6% para MA y 5.05% para MB. El almidón de MA presentó una mayor temperatura de inició y de pico, así como entalpía de gelatinización (70ºC, 74.7ºC y 10.5 J/g, respectivamente) que el almidón de MB (65.2ºC, 70.7ºC y 8.9 J/g, respectivamente). Los gránulos de almidón de MA fueron predominantemente redondos y presentaron poros; los de MB presentaron la tendencia a ser elípticos. En la 2D-PAGE se observó la presencia de la enzima GBSSI de 60 kDa con un pI entre 5-6. Otras enzimas de biosíntesis como la SSSI (80 kDa), SSSII (120 kDa), SBEI (88 kDa) y SBEII (90kDa) se observaron en la SDS-PAGE del proceso de extracción de proteínas, con un patrón electroforético diferente entre las muestras. El contenido de amilosa aparente entre la población de gránulos grandes y pequeños no presentó diferencia estadística (p>0.05).

2. INTRODUCCIÓN México es el cuarto productor mundial de maíz (Sea mays L.) y uno de los principales importadores del mismo. En nuestro país, el maíz es la principal fuente de calorías y proteínas para los habitantes de las zonas rurales que representan los estratos más pobres de la sociedad. Además, este grano se emplea en forma creciente en el sector pecuario (Paredes-López et al., 2006). El maíz es una fuente de calorías para los humanos y los animales debido a que presenta un alto contenido de almidón, que es el principal constituyente de su grano. Esta característica ha promovido su uso a nivel industrial. El almidón esta formado por moléculas de amilosa y amilopectina, las cuales son polímeros de D-glucosa. En la amilosa las unidades de glucosa están unidas mediante enlaces glicosídicos α 1-4 y forman largas cadenas lineales. La molécula de amilopectina se caracteriza, además, por la presencia de ramificaciones formadas por uniones α 1-6 entre unidades de glucosa. En las células vegetales el almidón se dispone en forma de gránulos, los cuales poseen una proporción variable de amilosa y amilopectina, dependiendo de la especie, su localización en la planta y su etapa de desarrollo. Estas diferencias dependen de las enzimas que catalizan los procesos de síntesis y degradación del almidón y de la compleja red de mecanismos que regulan este proceso. En años recientes, el interés por conocer más acerca de las enzimas implicadas en la biosíntesis del almidón ha aumentado, debido a que éstas definen las características morfológicas, de tamaño y de composición de sus gránulos. Estos factores determinan, a su vez las propiedades físico-químicas del almidón y por lo tanto, sus características nutricionales y funcionales (James, 2003). En México se han descrito numerosas variedades de maíces pigmentados (Ortega et al., 1991), cuyos colores negros, morados y rojos se deben a las antocianinas presentes en diferentes partes del grano (Wellhausen et al., 1951; SalinasMoreno, 2000). Estas variedades han cobrado gran importancia debido a sus propiedades nutraceuticas. Varios estudios se han enfocado a la extracción, caracterización y utilización de sus colorantes para la industria de alimentos (Fossen et al., 2001). Algunos estudios disponibles en la literatura científica

indican que los productos a base de estos maíces, como es el caso de la tortilla, presentan mejores características de sabor y textura, que los elaborados a partir de maíz blanco. Hemos planteado como hipótesis de este trabajo que las diferencias en las características organolépticas de los alimentos preparados con maíces pigmentados con respecto al blanco reflejan diferencias en el contenido y composición de su almidón. En este estudio nos proponemos conocer la composición química, distribución de tamaño y morfología del gránulo de almidón del maíz azul y en una segunda etapa, aislar y estudiar algunas de las enzimas participantes en su biosíntesis. La información generada en este proyecto permitirá una mejor caracterización de esta variedad de maíz azul, en cuanto a su morfología, distribución de tamaño y composición química de sus gránulos de almidón y de las enzimas que lo sintetizan, lo cual facilitará la evaluación de sus potencialidades nutricionales e industriales. Eventualmente, este proyecto puede aportar información útil para entender mejor los mecanismos de síntesis y crecimiento de los gránulos de almidón de maíz. 3. OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GENERAL Caracterizar química y morfológicamente a los gránulos de almidón de maíz y realizar el estudio de algunas enzimas involucradas en su síntesis desde el punto de vista bioquímico y molecular. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 9

Realizar la caracterización química parcial del almidón de maíz.

9

Purificación del almidón en estudio.

9

Caracterizar morfológicamente el almidón de dos variedades de maíz.

9

Conocer la distribución de tamaño de los gránulos de almidón.

9

Separación de éstos en base a su tamaño.

9

Determinación de sus propiedades térmicas.

9

Realizar estudios bioquímicos y moleculares de algunas enzimas involucradas en la biosíntesis de los gránulos.

Nota: los objetivos marcados en negritas son los que se realizaron en el 2007 y con lo que se concluye este proyecto.

4. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1 MATERIALES Se utilizó maíz pigmentado y maíz blanco (H511) como control, donados por el INIFAP Texcoco e Iguala, respectivamente. 4.2 MÉTODOS 4.2.1 Extracción de proteínas Se realizó una extracción de proteínas para obtener un almidón con alta pureza. El almidón se suspendió (1 g) en 5 mL de metabisulfito de sodio al 1% en baño maría a 45ºC por 48 h. Posteriormente, se dejó en reposo a 4ºC por 2 h y se centrifugó a 6 000 g a 4ºC por 10 min. El residuo se suspendió en 10 mL de Cloruro de sodio (NaCl) 0.5 M en agitación a 4ºC por 1 h y se centrifugó (6 000 x g, 4ºC, 10 min). Al residuo se le adicionó 10 mL de etanol, se dejó en agitación por 20 min a temperatura ambiente y se centrifugó (6 000 x g, 4ºC, 10 min). El sobrenadante se descartó y al residuo se lavo con 20 mL de agua destilada y se centrifugó (6000 x g, 4ºC, 10 min). Este lavado se repitió dos veces. Finalmente, el sobrenadante se descartó y el almidón se secó a 40ºC por 3 h. 4.2.2 Microscopía electrónica de barrido (MEB) La microscopía electrónica de barrido (MEB) provee una mayor perspectiva de la superficie del gránulo de almidón así como de su morfología. Se utilizó el método reportado por Paredes-López y col. (1989). La muestra de almidón se espolvorea sobre una cinta conductora de cobre de doble adhesión, la cual se fija previamente en un soporte de aluminio del microscopio electrónico de barrido JEOL (Japan Electronic Optical Limited,Modelo, JSEM 35CX, Japón). La muestra se cubrió con una capa de carbón de 30 nm. Las muestras se colocaron en el ionizador de metales JEOL y se recubrió con una capa de oro de 60 nm. Las muestras fueron

observadas al microscopio electrónico de barrido a un voltaje de 8 kV y se tomaron las fotografías. 4.2.3 Propiedades térmicas Las propiedades térmicas de los almidones se estudiaron empleando CDB (TA Instruments, modelo 2010, New Castle, E.U.A.). Los almidones tienen la capacidad de sufrir un cambio o transición cuando son calentados en medio acuoso. La calorimetría diferencial de barrido es una técnica termoanalítica que sirve para monitorear éstos cambios, como función de la temperatura, por medio de detección de cambios de calor asociados con el proceso. El principio de la medición es la comparación de la razón de flujo de calor hacia la muestra y un material inerte de referencia, los cuales son calentados a la misma velocidad. 4.2.4 Gelatinización La gelatinización de los almidones se evaluó por el método propuesto por Paredes-López y col. (1994), el cual consistió en pesar 2 mg de muestra (en base seca, mínimo tres réplicas) dentro de una charola de aluminio, se le adicionaron 7 µL de agua desionizada. Se selló la charola herméticamente y se dejó equilibrar a temperatura ambiente durante 1 h antes de realizar el análisis. Como referencia se utilizó una charola de aluminio vacía. Transcurrido el tiempo de equilibrio, la muestra se sometió a un programa de calentamiento en un intervalo de temperatura de 0 a 120 °C con una velocidad de calentamiento de 10 °C/min. La temperatura de inicio (Ti), la temperatura de gelatinización o de pico (Tp), la temperatura final (Tf) y la diferencia de entalpía (∆H) se obtuvieron directamente del análisis realizado con el software TA Instruments 2010 versión 2.1.

4.2.5 Caracterización bioquímica 4.2.5.1 Extracción de proteínas Se tomó una muestra de 1 g de almidón a la cual se le realizaron cuatro lavados con 10 mL de regulador de extracción (50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 mM EDTA; 1 mM de DTT) y dos veces con regulador de lavado (62.5mM Tris-HCl, pH 6.8;

10mM DTT; SDS al 2%), la muestra se agitó durante 15 min a 4 ºC; posteriormente se centrifugó a 13,000 x g por 10 min a 4 ºC. Al residuo, se le adicionaron 30 mL de regulador de lavado y se llevó a ebullición por 15 minutos con agitación constante. Posteriormente se congeló (-20 °C) por 1 hora, transcurrido este tiempo, la muestra se descongeló y se centrifugó a 13000 x g por 30 minutos a 4 ºC. El sobrenadante se recolectó y se le adicionó un volumen igual de una solución de ácido tricloroacético: acetona (30:70 v/v) 30% (-20 °C) para precipitar las proteínas y se dejó reposar por 2 h a -20 °C. La muestra se centrifugó a 13000 x g por 10 minutos. Se descartó el sobrenadante y el residuo se lavó dos veces con acetona, después de cada lavado se centrifugó a 13,000 x g por 5 min a 4 ºC, el residuo se dejó secar (proteína concentrada) (Peng y col., 2000). En cada etapa, de cada sobrenadante se recuperó 1 mL con el objetivo de realizar

una

SDS-PAGE

(sodium

dodecyl

sulfate-polyacrylamide

gel

electrophoresis) para separar las proteínas de acuerdo a su peso molecular y observar si se eliminaron proteínas de almacenamiento y de superficie de la muestra. La proteína concentrada se rehidrató con 1 mL de regulador (8 mM urea, 2 % CHAPS, 0.002% azul de bromofenol). Se cuantificó el contenido de proteína mediante el método de Bradford.

4.2.5.2 Separación de proteínas por primera dimensión (Punto Isoeléctrico) El isoelectroenfoque se realizó de acuerdo a Amersham Biosciences Uppsala, Sweden (Barkelman and Stenstet, 2002). Se utilizaron tiras de imobilinas de 11 cm, con un gradiente de punto isoeléctrico (pI) de 4 a 7. Las tiras de immobilina fueron equilibrados por 15 min en regulador de equilibrio (6M urea, 2 M tiourea, 50 mM tris pH 8.8, 30 % glicerol, 10 % SDS, 1 % DTT). Se dejaron en reposo por 16 h, antes de realizar el isoelctroenfoque. Para pruebas preeliminares se trabajó con tiras de 7 cm y un gradiente de pI de 3-10. 4.2.5.3 Separación en segunda dimensión (Peso Molecular) Las proteínas separadas por pI en las tiras de immobilina se colocaron en regulador de corrida por 15 min con agitación. Las tiras se cargaron en un gel para

electroforesis discontinua. Para esta electroforesis se preparon 2 geles, el gel de corrida, donde se separan las proteínas, y el gel de apilamiento o gel concentrador (“stacking”) que como su nombre lo indica, concentra la mezcla. El gel de corrida se preparó con una concentración de acrilamida del 12%, mientras que el concentrador fue de 4%. La electroforesis se corrió a 10 mA por gel durante 5 h, aproximadamente. Los geles fueron teñidos con azul de Coomasie durante 1 h. Los geles teñidos fueron digitalizados, y analizados con software para 2D (PDQuest 7.2, BIO-RAD®). Las manchas fueron caracterizadas con respecto a su peso molecular y punto isoeléctrico por interpolación bilineal entre características del gel con respecto a los estándares.

4.2.5.4 Identificación de proteínas (MALDI-TOF) Las manchas de interés fueron cortadas manualmente de los geles de electroforesis de dos dimensiones, se destiñeron y se colocaron en tubos eppendorf con agua destilada. Se realizó una digestión tríptica y los péptidos obtenidos se analizaron por espectrometría de masas MALDI-TOF. La información que se obtuvo se analizó mediante el programa MASCOT, que utiliza una base de datos para identificar proteínas. 4.2.6 Análisis estadístico Para determinar las diferencias estadísticas se aplicó un análisis t-student a un nivel de significancia del 5% (p=0.05). Para determinar diferencias en la caracterización fisicoquímica de los gránulos grandes y pequeños se realizó un análisis de varianza de una vía, cuando se encontraron diferencias estadísticas se utilizó el método de comparaciones múltiples mediante la prueba SNK (StudentNewman- Keuls), al mismo nivel de significancia.

5. Resultados y discusión 5.1 Extracción de proteínas Debido a que las muestras presentaron un alto contenido de proteína y que éstas forman una matriz proteica que recubren los gránulos de almidón, se realizó una extracción de acuerdo a sus propiedades de solubilidad y por medio de la ruptura de los puentes disulfuro de la matriz proteica. Después de la extracción el contenido de proteínas disminuyó a 1.79% en el maíz azul y a 2.31% en el maíz blanco (Cuadro 1). Este resultado puede indicar que las diferencias se deben al tipo de proteínas presente en los maíces estudiados, lo cual está relacionado con el tipo de endospermo, porque como se mencionó el maíz azul presenta endospermo vítreo y harinoso mientras que el maíz blanco únicamente endospermo vítreo. En general, el endospermo de maíz presenta cuatro tipos de proteínas de reserva, albuminas (3%), globulinas (3%), prolaminas (60%) y glutelinas (34 %). Las prolaminas (zeínas) son predominantes del endospermo y presentan cuatro subunidades (α,β,δ,γ) las cuales tienen bajo contenido de lisina y triptófano; las α-zeínas influyen de manera importante en el endospermo vítreo. El endospermo harinoso tiene menos α-zeínas, más albuminas y glutelinas (Landry y col., 2005), esto esta relacionado con el alto contenido de lisina y triptófano que presentan maíces con endospermo harinoso (mutantes “floury” y “opaque”) (Landry y col., 2005). Miguel y col. (2004) reportó que el maíz azul presenta un un alto contenido de lisina (2.3 mg/g) (Miguel y col., 2004), lo cual indica que el tipo de endospermo presente en este maíz influye sobre su patrón de proteínas de almacenamiento. Después de la extracción de proteínas, la pureza del almidón incrementó a 92.96% y 93.76 % para el maíz azul y blanco, respectivamente. Sin embargo, el almidón dañado incrementó de manera importante en el maíz azul (12.62%), en comparación con el ligero incremento que se presentó en el maíz blanco (5.06 %). Este daño pudo deberse al tratamiento con diversos disolventes para la extracción de proteínas. La gran susceptibilidad del almidón de maíz azul está relacionado

con su naturaleza, características estructurales de sus principales componentes que están relacionados con su biosíntesis. Para todos los experimentos realizados se utilizó este almidón purificado, con el objetivo de que los resultados obtenidos se puedan atribuir a las características del almidón y no a la interacción almidónproteína. Cuadro 1. Contenido de proteína, almidón total y almidón dañado después de la extracción de proteínas del almidón de maíz Contenido (%) Maíz azul Maíz blanco 1.79±0.21 a 2.31±0.01 b Proteina ¶ Almidón Total

92.96±0.73 a 93.76±0.93 a

Almidón Dañado 12.62±0.28 a

5.06±0.22 b

Media de tres repeticiones± error estándar; base seca. Valores con letras diferentes en la misma fila son estadísticamente diferente (p≤0.05). ¶ N×5.85.

5.2 Microscopía electrónica de barrido (MEB) En los análisis de microscopía electrónica de barrido (Figura 1) se puede observar que en ambas muestras se presentaron gránulos predominantemente redondos. Como se mencionó la matriz proteica fue eliminada; sin embargo, se pueden observar impurezas que podrían ser restos de proteínas. Debido a este procedimiento, fue posible observar poros en los gránulos de almidón de maíz azul. Desde 1970 se ha reportado la presencia de poros en gránulos de almidón de maíz (Hall y Sayre, 1970); Fannon y col. (1992) presentaron evidencia de que los poros son características estructurales de los gránulos de almidón, los cuales conectan la cavidad central de los gránulos con el ambiente (Huber y BeMiller, 1997) y están presentes en las primeras etapas del desarrollo del gránulo (Huber y BeMiller, 2000). Los poros y/o canales están constituidos por proteínas (Han y col., 2005) y son utilizados por las enzimas durante la biosíntesis del almidón. Se ha reportado que la proteína brittle 1 (bt1) esta localizada dentro de esos poros (Han y col., 2005). Esta proteína es la encargada de transportar ADP-glucosa, que es el precursor de síntesis de almidón, desde el citosol al plastidio (Smith, 2001).

Por otro lado, la presencia de poros y canales en los gránulos de almidón afectan las propiedades fisicoquímicas, funcionales y de digestibilidad del almidón. El almidón de maíz que presenta poros o canales es más susceptible a la digestion enzimática (Leach y Schoch, 1961; Gallant y col., 1973; Fuwa y col., 1977; Kanenaga y col., 1990), la cual inicia en el hilum (Leach y Schoch, 1961; Nikuni 1956; Hood y Liboff, 1983). Además, se ha reconocido que la enzimas pueden entrar al interior del gránulo a través de estos poros y canales (Hall y Sayre, 1970; Fannon y col., 1992). Esto puede estar relacionado con las diferencias presentadas en los valores de almidón dañado, debido a que el resultado obtenido puede no tener relación con un mayor daño ocasionado durante la extracción de proteínas, sino a la susceptibilidad del gránulo de almidón con poros al ataque enzimático. El almidón de maíz blanco presentó una superficie lisa, lo que da como resultado un bajo contenido de almidón dañado. Las características morfológicas de los almidones de maíz analizados pueden relacionarse con las propiedades funcionales (retrogradación) y digestibilidad de los productos elaborados a partir de ellos, como es el caso de las tortillas (Hernández-Uribe y col., 2007)

Figura 1. Microfotografías de microscopía electrónica de barrido (MEB) del almidón de maíz azul (a) y blanco (b).

5.3 Parámetros térmicos Gelatinización El perfil térmico del proceso de gelatinización se presenta en el Cuadro 2. No se presentaron diferencias estadísticas en la Ti, Tp y Tf entre las fracciones de gránulos grandes y pequeños de ambas muestras. Las dos fracciones de gránulos grandes y pequeños presentaron una temperatura de inicio, pico y final de 68ºC, 72ºC y 80ºC, respectivamente, mientras que para maíz blanco fueron de 62ºC, 68ºC y 76ºC, respectivamente. Tang y col. (2000), encontraron un comportamiento similar en cebada, los parámetros de gelatinización no presentaron diferencias entre las dos poblaciones de gránulos de almidón. Como se observó, estos parámetros térmicos fueron mayores y significativamente diferentes en ambas fracciones de gránulos de maíz azul en comparación con las fracciones de maíz blanco, lo cual sugiere que tanto la población de gránulos grandes como los pequeños de maíz azul tienen una mayor cristalinidad que su contraparte en maíz azul. No se presentaron diferencias en el intervalo de gelatinización entre las poblaciones de gránulos pequeños y grandes de ambas muestras (Cuadro 2); sin embargo, este parámetro fue mayor para las dos poblaciones de gránulos del maíz blanco que para los del maíz azul. Se ha reportado un mayor intervalo de gelatinización para las poblaciones de gránulos grandes en comparación con los gránulos pequeños (Peng y col., 1999; Ao y Jane, 2007). Aunque, Tang y col. (2002) reportó una mínima diferencia (1ºC) del intervalo de gelatinización entre la población de gránulos grandes y medianos (12.1ºC y 13ºC, respectivamente), pero no encontró diferencias entre la población de gránulos medianos y pequeños (13ºC y 13.3ºC, respectivamente). Esto sugiere que el intervalo de gelatinización no solo indica una mayor heterogeneidad del tamaño de gránulo de almidón, sino que los gránulos grandes necesitan un mayor intervalo de temperatura para que se lleve a cabo una completa gelatinización. Por lo tanto, un mayor intervalo de gelatinización en ambas poblaciones de gránulos de almidón de maíz blanco puede estar relacionado a que el tamaño de los gránulos es mayor tanto en la

fracción de gránulos pequeños (3-9 µm) como en la de gránulos grandes (10-21 µm) en comparación con las poblaciones del maíz azul (gránulos grandes: 1-9 µm; gránulos pequeños: 10-18 µm).

Cuadro 2. Propiedades de gelatinización de gránulos grandes y pequeños de almidón de maíz medidos por calorimetría diferencial de barrido Muestra Maíz Azul

Maíz Blanco

Ti (ºC) GG

Tp (ºC) 68.40±0.32 a

GP

68.05±0.07 a

GG

62.64±0.14b

GP

61.88±0.14 b

72.36±0.04 a

Tf (ºC)

80.61±0.33 12.21±0.04 a

72.50±0.07 a

67.99±0.34 b

8.33±0.04b 9.12±0.09c

b

76.93±0.38 15.05±0.53 b

10.07±0.01a

a

76.84±0.23 14.20±0.31 b

∆H (J/g)

a

80.23±0.40 12.19±0.33 a

68.27±0.05 b

IG (Tf-Ti, ºC)

8.86±0.06d

c

Media de tres repeticiones± error estándar; base seca. Valores con letras diferentes en la misma columna son estadísticamente diferentes (p≤0.05). Ti= Temperatura inicial; Tp= temperatura de pico; Tf= temperatura final; IG=Tf-Ti= Intervalo de gelatinización, ∆H= entalpía de gelatinización. GG=Población de gránulos grandes. GP=Población de gránulos pequeños.

Se presentaron diferencias en la entalpía de gelatinización de los gránulos grandes y pequeños de ambas muestras. Los gránulos pequeños presentaron una entalpía menor (maíz azul, 8.33 J/g y maíz blanco 8.86 J/g) que los gránulos grandes (maíz azul, 10.07 J/g y maíz blanco 9.12 J/g). Una mayor entalpía de gelatinización esta relacionada con un nivel de cristalinidad mayor (Jane y col., 1999; Patindol y col; 2002). Ao y Jane (2007) propusieron que los gránulos grandes están constituidos por moléculas de amilopectina que tienen mas cadenas B2 pero pocas cadenas cortas A y B1 en un arreglo paralelo dentro del gránulo de almidón, lo cual provoca que esta población de gránulos presente una mayor cristalinidad que los gránulos pequeños. Diversos autores han reportado una mayor entalpía para los gránulos grandes en comparación con los

gránulos pequeños (Eliasson y Karlsson, 1983; Soukala y Morrison, 1985; Vasanthan y Bhatty, 1996; Peng y col., 1999; Singh y col., 2003). 5.4 Extracción de proteínas asociadas a los gránulos de almidón Las proteínas del maíz se dividen en dos grupos, dependiendo de su grado de asociación con el gránulo de almidón. El primer grupo lo conforman las proteínas solubles en agua que no se asocian con los gránulos. El segundo grupo esta formado por las proteínas que se asocian a los gránulos, que a su vez se subdividen en: proteínas de superficie y en proteínas unidas al gránulo. Las proteínas unidas al gránulo se encuentran en la superficie y/o en su interior. El método de extracción utilizado permite eliminar proteínas no asociadas al gránulo (albumina) y proteínas asociadas al gránulo (de superficie, también conocidas como de almacenamiento: prolamina, glutelina y globulina) las cuales se adhieren a la periferia de los gránulos de almidón durante su aislamiento (Baldwin, 2001). En la Figura 2 se presenta una fotografía de la SDS-PAGE del almidón de maíz azul y blanco. Se cargo una concentración de proteína de 9.8 µg/µL. El carril 1, corresponde al marcador de pesos moleculares; los carriles del 2 al 4 corresponden a los sobrenadantes de la etapa de extracción. Los carriles 5 y 6 pertenecen a los sobrenadantes de la etapa de lavado y el carril 7 se presenta el extracto concentrado. En los geles de ambas muestras se observaron que en los carriles del 2 al 6 algunas enzimas de biosíntesis fueron eliminadas (SSSII, 90 kDa, AGPasa, 50 kDa), esto puede deberse a que como ya se había realizado anteriormente una eliminación de proteínas que corresponden a las asociadas a la superficie del gránulo, las proteínas que fueron removidas fueron las proteínas internas asociadas al gránulo. Sin embargo, se obtuvo una proteína de 60 kDa en mayor cantidad en el extracto concentrado (carril 7), la cual es identificada como la GBSSI, esto debido a que esta enzima se localiza dentro del gránulo de almidón y su extracción se lleva a cabo mediante la gelatinización del gránulo.

Figura 2. SDS-PAGE de la extracción de proteínas de los gránulos de almidón: maíz: a) azul y b) blanco. El carril 1 corresponde al estándar de peso molecular, del carril 2 al 4 corresponde al proceso de extracción, el carril de 5 a 6 corresponde a al proceso de lavado y el carril 7 al extracto concentrado. En el gel del almidón de maíz azul se presentan proteínas de peso molecular de 33, 42, 50, 90, 120 kDa, aproximadamente, (en los carriles del 2 al 4) los cuales corresponden posiblemente a los pesos moleculares de γzeina, bt1, glutelinas, AGPasa, SBEII (Nakamura y col., 1996) y SSSII (Gao y Chibbar, 1998), respectivamente. En el carril 5 y 6 se observa una proteína de 100 kDa (glutelina) (Yau y col., 1999) y en el carril 7, se presenta una de 60 kDa (GBSSI) que es la predominante. Se pueden observar en menos concentración proteínas de 80 kDa (SSSI) (Shure, 1983) y 88 kDa (SBEI) (Peng y col., 1999), aproximadamente. En

el gel de maíz blanco no se observaron las proteínas de 120 (carril 2-4), 80 y 88 kDa (carril 7) mientras que las otras proteínas (33, 42, 50, 90, 100 kDa) tienen una menor expresión. El patrón electroforético de ambos almidones de maíces sugiere que su biosíntesis es diferente, lo que se reflejará en sus características estructurales así como en sus propiedades funcionales. La ausencia de algunas isoformas SSS (I y II), y SBEI en el almidón de maíz blanco, sugiere que el almidón presenta una distribución de longitud de cadenas y patrón de ramificación de amilopectina diferente con respecto al maíz azul. 5.5 Electroforesis en dos dimensiones En la Figura 3 se observa la electroforesis en dos dimensiones (2D-PAGE) del extracto crudo de las proteínas asociadas al gránulo de almidón. En ambas muestras se tuvo la presencia de una proteína de 60 kDa con un intervalo de punto isoeléctrico (pI) entre 5 y 6, de la cual se observan alrededor de 5 manchas, que se identificó por espectrometría de masas (MALDI-TOF) como GBSSI (Figura 4). Esto sugiere que la GBSSI es un complejo multienzimático que depende del número de isoformas de GBSSI presentes para que influyan en la biosíntesis de amilosa (Shure y col., 1983; Miura y Sugawara, 1996). En almidón de maíz la GBSSI ha sido reportada en un peso molecular entre 58 y 60 kDa y un pI entre 6 y 6.5 (Nakamura y col., 1993; Taira y col., 1995; Nakamura y col., 1995). Nakamura y col. (1996) encontraron que la GBSSI se observa en una SDS-PAGE, como una simple banda de 60 kDa, pero en 2D-PAGE se observaron de 3 a 5 manchas de diferente pI. Esto indica que la GBSSI de las diferentes fuentes botánicas estudiadas, presenta algunas isoformas que tienen igual peso molecular pero diferente punto isoeléctrico. Una explicación para GBSSI la cual presenta varias isoformas ha sido dada por Nakamura y col., (1995) quiénes atribuyeron las diversas proteínas a genes situados en los cromosomas 7A, 4A y 7D (Chao y col., 1989; Miura y Sugawara,1996). Sin embargo, la relevancia funcional de estas isoformas tiene que ser elucidada. En este sentido, aún no es posible relacionar la diferencia del contenido de amilosa y el nivel de expresión de las muestras,

porque en maíz, Tsai (1974) reportó que la actividad de GBSSI es directamente proporcional al numero de alelos “waxy” presentes en el endospermo, por lo que el contenido de amilosa no tiene una relación proporcional con la expresión de GBSSI. Por otro lado, la SSSI y SSSII no se observaron en la 2D-PAGE de maíz azul, esto pudo deberse a que la concentración de estas proteínas es muy baja y no logran resolverse en 2D-PAGE como en SDS-PAGE. Además, se ha reportado que la GBSS en el endospermo de maíz es la proteína predominante asociada al gránulo de almidón (Mu-Foster y col., 1996).

Figura 3. Separación por 2D-PAGE del extracto de proteínas unidas al gránulo de almidón de maíz azul (a) y blanco (b).

Granule-bound starch synthase 1, chloroplast precursor (EC 2.4.1.242) (Granule-bound starch synthase I) (GBSS-I) - Zea mays (Maize) Matched peptides shown in Bold Red

1 MAALATSQLV ATRAGLGVPD ASTFRRGAAQ GLRGARASAA ADTLSMRTSA 51 RAAPRHQQQA RRGGRFPSLV VCASAGMNVV FVGAEMAPWS KTGGLGDVLG 101 GLPPAMAANG HRVMVVSPRY DQYKDAWDTS VVSEIKMGDG YETVRFFHCY 151 KRGVDRVFVD HPLFLERVWG KTEEKIYGPV AGTDYRDNQL RFSLLCQAAL 201 EAPRILSLNN NPYFSGPYGE DVVFVCNDWH TGPLSCYLKS NYQSHGIYRD 251 AKTAFCIHNI SYQGRFAFSD YPELNLPERF KSSFDFIDGY EKPVEGRKIN 301 WMKAGILEAD RVLTVSPYYA EELISGIARG CELDNIMRLT GITGIVNGMD 351 VSEWDPSRDK YIAVKYDVST AVEAKALNKE ALQAEVGLPV DRNIPLVAFI 401 GRLEEQKGPD VMAAAIPQLM EMVEDVQIVL LGTGKKKFER MLMSAEEKFP 451 GKVRAVVKFN AALAHHIMAG ADVLAVTSRF EPCGLIQLQG MRYGTPCACA 501 STGGLVDTII EGKTGFHMGR LSVDCNVVEP ADVKKVATTL QRAIKVVGTP 551 AYEEMVRNCM IQDLSWKGPA KNWENVLLSL GVAGGEPGVE GEEIAPLAKE 601 NVAAP

Figura 4. Programa Mascot a partir de datos de espectrometría de masas de la mancha de 60 kDa de la figura 3. Las secuencias de los péptidos similares se encuentran resaltadas en rojo.

6. CONCLUSIÓNES: La presencia de poros en los gránulos de almidón de maíz azul refleja un mecanismo biosintético diferente con respecto al almidón de maíz blanco. La entalpía de gelatinización de los gránulos grandes y pequeños sugiere que la amilopectina tiene una conformación diferente, y que esta relacionada con una diferente distribución de la longitud de las cadenas de la amilopectina. El nivel de expresión y la presencia/ausencia de las enzimas involucradas en la biosíntesis de la amilopectina, puede explicar las diferencias en las características morfológicas y fisicoquímicas entre ambos almidones.

IMPACTO: Los resultados de este trabajo ayudaran a conocer las potencialidades nutricionales e industriales del almidón de maíz azul. Eventualmente, este proyecto puede aportar información útil para entender mejor los mecanismos de síntesis y crecimiento de los gránulos de almidón de maíz, este conocimiento es básico, para en un futuro poder producir almidones modificados genéticamente.