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CeTeCáncer Centro de Tecnologías para el Cáncer

Curso Internacional sobre Tecnologías Complementarias Avanzadas para Detección de Cáncer.

CURSO SATÉLITE

Tecnologías Complementarias Avanzadas en detección temprana de cáncer Lugar

: Laboratorio CeTeCáncer ICBM, Sector E, Subterraneo.

Profesores

: MSc. José Díaz Garrote, Dra. Marta Adonis, Dr. Ulises Urzúa, Dr. Leonardo Meza.

Ayudantes

: Lorena Lorca, Carolina Tamayo, Soledad Leyton.

Jueves 21 Noviembre  

Citometría semiautomática de esputo y tinción de DNA Determinación de SNPs por PCR en tiempo real

Viernes 22 Noviembre   

Hibridación Genómica Comparativa, Microarray en muestras de esputo Secuenciación de alto rendimiento, tecnología y aplicaciones para estudiar genomas en cáncer. Análisis bioinformático de genomas en sarcomas y cáncer de pulmón.

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CITOMETRÍA AUTOMÁTICA CUANTITATIVA EN ESPUTO INDUCIDO. La citometría automática cuantitativa (CAC) en esputo inducido, como biomarcador para la detección de CP, ha demostrado una mayor especificidad (91%) y una mayor sensibilidad (40%), que la citología convencional en esputo, cuando se la compara según el tipo histológico, localización del tumor y estadio del CP (Kemp et al., 2007). La CAC, puede ser definida como una citometría estática, basada en la transmitancia de la luz, cuando ésta atraviesa los núcleos celulares, dispuestos en monocapa, mediante cito-centrifugación y posterior tinción de Fuelgen para DNA (Johnson et al., 2004).

Reacción de Fuelgen

El software integrado al sistema de microscopía robótica, automáticamente, captura y analiza al menos 400 núcleos celulares. El análisis integra mediante un algoritmo, características de la célula y el núcleo, tales como: tamaño, forma celular, tamaño y forma nuclear, estructura de la cromatina e índice de DNA, además indica el número y proporción de las células analizadas. El resultado de CAC se expresa en puntajes de probabilidades de riesgo de CP: riesgo bajo (puntaje < 3,9 o ensayo negativo), riesgo indeterminado (puntaje 3,9-4,6) y riesgo alto (puntaje >4,6 o ensayo positivo). La CAC, permite demostrar cambios asociados a malignidad (CAM) presentes en las células del esputo, que en estadios muy tempranos de transformación maligna no son detectados por la citología convencional, la cual no ha mostrado ser eficaz para la detección temprana de CP.

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CITOCENTRIFUGACIÓN 1) La muestra de esputo, traspasar a un tubo falcon de 50 ml 2) Agregar DTT al 10%, mezclar en vortex, 3) Agitar por 18 horas 4) Centrifugar a 1800 rpm por 10 minutos. 5) Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 30 ml etanol al 50% 6) Centrifugar a 1800 rpm por 10 minutos. 7) Eliminar el sobrenadante y resuspender en 1 ml de etanol al 50% 8) Centrifugar a 3000 rpm para obtener pellet y eliminar el sobrenadante. 9) Preparar un set de tubos eppendorf con 1 ml de ETOH 50% y agregar 3,7uL de pellet. 10) Mezclar mediante vortex. 11) Montar el sistema de citocentrifugación.

12) Citocentrifugar por 5 minutos.

4 13) Retirar las preparaciones y dejar secar al aire y analizar.

14) Con el pellet remanente, realizar separación inmunomagnética y extraer DNA.

REFERENCIAS Kemp RA, Reinders DM, Turic B. Detection of lung cancer by automated sputum cytometry. J Thorac Oncol. 2007;2:993-1000 Johnson FL, Turic B, Kemp R, Palcic B, Sussman R, Voelker KG, Robinette E. Improved diagnostic sensitivity for lung cancer using an automated quantitative cytology system and uridine 5'-triphosphateinduced sputum specimens. Chest. 2004;125:157S-158S

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PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ADN Método: QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN El método es útil para sangre total fresca o congelada y para sangre anticoagulada con citrato, heparina o EDTA. No requiere una separación inicial de leucocitos, ni de extracción con fenol/cloroformo o precipitación con alcohol e implica muy poca manipulación de la muestra. El método es eficiente para muestras de ADN 50 kb de tamaño hasta fragmentos de aproximadamente 20–30 kb. El método utilizado en esta práctica para extraer ADN desde sangre periférica ó esputo, se basa en la interrupción de la estructura celular utilizando Proteinasa K y un tensoactivo iónico. Luego, para purificarlo se utilizan columnas de sílica, basándose en la adsorción y desorción del ADN, en presencia de sales caotrópicas (sustancia que desorganiza la estructura tridimensional en macromoléculas). Bajo condiciones nativas, el ADN está recubierto de una capa hidratante de moléculas de agua que mantienen su solubilidad en soluciones acuosas. Al adicionar iones caotrópicos, se destruye la estructura ordenada de moléculas de agua de la capa hidratante, por lo que las sales caotrópicas crean un entorno hidrofóbico alrededor del DNA. Bajo estas condiciones, el ADN se une perfectamente a la membrana de sílica de las columnas, mientras que las proteínas, los metabolitos y otros contaminantes no se unen y, por lo tanto, son eliminados de la muestra durante los pasos de lavado. Finalmente, el ADN se eluye de la membrana de sílica mediante tampones de elución con baja concentración de sales (ligeramente alcalinos) o simplemente agua, ya que permiten recuperar la capa hidratante de los ADN, liberándolos así de la membrana. Este método de extracción y purificación de ADN utilizando membranas de sílica, es rápido y eficiente, y que además permite obtener ADN altamente purificados y listos para usar en procesos posteriores como PCR, RT-PCR, qPCR, secuenciación, blotting, clonaje, etc.

REACTIVOS Y EQUIPOS:      

Kit QIAamp DNA Mini and Blood que incluye proteinasa QIAGEN, Buffer AL (SDS/sal de guanidinio), AW1 (buffer comercial de sal guanidinio diluido con etanol 100%), AW2 (buffer comercial diluido con etanol 100%), AE, columnas QIAamp Mini spin y tubos colectores de 2 mL. Etanol (96-100%) Tubos de microcentrifuga de 1,5 mL Incubador a 56°C Centrífuga Vortex

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PROCEDIMIENTO: 1) Agregar 20 μL de proteasa QIAGEN dentro de un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL que contiene 200 µL de muestra (sangre periférica ó esputo). 2) Agregar 200 µL de Buffer AL a la muestra, y mezclar utilizando vortex por 15 segundos. 3) Incubar la muestra a 56°C por 10 minutos y luego centrifugar brevemente para remover las gotas de la tapa del tubo. 4)

Luego agregar 200 µL de etanol 100% y mezclar por vortex durante 15 segundos, y luego centrifugar brevemente para remover las gotas de la tapa del tubo.

5) Transferir cuidadosamente la mezcla dentro de una columna QIAamp Mini spin sin mojar los bordes del tubo, cerrar la tapa y centrifugar a 8000 rpm por 1 min. 6) Colocar la Columna en un nuevo tubo colector de 2 mL, y eliminar el tubo anterior con el filtrado. Nota: - Sí el lisado no pasa completamente por la membrana después de la centrifugación, realizar una nueva centrifugación a una velocidad mayor hasta que la columna quede completamente vacía.

7) Cuidadosamente abrir la columna y agregar 500 µL de Buffer AW1 sin mojar los bordes del tubo. Cerrar la tapa y centrifugar a 8000 rpm por 1 min. Colocar la columna en un nuevo tubo colector de 2 mL y desechar el tubo colector con el filtrado anterior. 8) Cuidadosamente abrir la columna y agregar 500 µL de Buffer AW2 sin mojar las paredes del tubo. Cerrar la tapa y centrifugar a 14000 rpm por 3 minutos. Colocar la columna en un nuevo tubo colector de 2mL y desechar el tubo colector con el filtrado anterior. 9) Repetir el paso 8, realizando la centrifugación durante 6 minutos,

para secar la membrana

completamente. 10) Colocar la columna en un tubo limpio de 1,5 mL, y desechar el tubo colector que contiene el filtrado. Cuidadosamente abrir la tapa de la columna y agregar 50 µL de Buffer AE directamente al centro de la membrana. Incubar a temperatura ambiente (15-25°C) por cinco minutos y centrifugar a 14000 rpm por 1 minuto. 11) Repetir paso 10. 12) Medir concentración y pureza utilizando Nanodrop y luego almacenar muestras de ADN a -20 °C.

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RESULTADOS:

Muestra de ADN Sangre Periférica Esputo

Concentración ng/µL

260/280

260/230

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HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARATIVA EN MICROARREGLOS DE DNA -ARRAY-CGHFUNDAMENTOS Una célula somática humana normal posee un genoma diploide constituido por 22 pares de cromosomas autosómicos homólogos y un par sexual. No obstante, al comparar los genomas de individuos fenotípica y clínicamente normales, se observan desviaciones del estado diploide en regiones discretas de todos los cromosomas. Estas regiones, denominadas variaciones de número de copia (CNVs), fluctúan en tamaño entre 1 kb a 5 Mb y se consideran variantes estructurales del genoma. Las CNVs constituyen un tipo de polimorfismo genético heredable que segrega en forma Mendeliana y que, igualmente que los SNPs, microsatélites y STRs, dan cuenta de la variabilidad fenotípica observada entre individuos (Feuk et al., 2006). El genoma de la mayoría de los tumores sólidos presenta cambios de número de copia de DNA, definidos citogenéticamente como aneuploidías. Aunque algunas de éstas pueden ser heredadas, la mayoría aparecen como consecuencia de un fenómeno de inestabilidad genómica característico de la progresión tumoral. Para distinguirlas de las CNVs, estas anomalías del genoma han sido denominadas alteraciones de número de copia (CNAs). En el caso de tumores avanzados, éstas pueden abarcar porciones extensas de un brazo cromosomal, o cromosomas completos. El rol de las CNAs en cáncer no ha sido determinado con certeza absoluta, pero la noción más simple –para la que existe evidencia experimental- sugiere que las ganancias de DNA favorecen la persistencia de genes implicados en la proliferación y sobrevida tumoral, en tanto que las pérdidas de DNA promueven la eliminación de genes supresores de tumores e inductores de muerte celular (Holland and Cleveland, 2009). La hibridación genómica comparativa (CGH) permite comparar el genoma de una muestra de referencia (ej: un DNA normal) frente al genoma de una muestra problema (ej: un DNA tumoral). Ambos DNAs genómicos se marcan separadamente con distintos nucleótidos fluorescentes y luego se co-hibridan sobre un portaobjeto que contiene cromosomas metafásicos de al menos 20 células con genoma normal. La emisión diferencial de fluorescencia desde una u otra muestra hibridada, nos da información sobre la abundancia relativa (ganancias y pérdidas) del DNA problema frente al DNA de referencia (Kallionemi et al, 1994). El límite de resolución de esta técnica es de 5 Mb y se corresponde con límite de resolución del microscopio óptico (0,2 m).

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El fundamento del array-CGH es el mismo que el del CGH en cromosomas metafásicos. La diferencia es que la cohibridación de ambas muestras (referencia e interés) se realiza sobre un microarreglo de ADN. Estos dispositivos contienen una representación completa del genoma, inmovilizada sobre una superficie inerte en forma de una colección de sondas oligonucleotidicas, clones BAC o clones de cDNAs. El tipo de sonda del microarreglo y su posición física dentro del genoma determina la resolución de la técnica. A modo de ejemplo, un microarreglo de genoma humano completo que contiene una sonda por gen tendrá una resolución de 3000 Mb/21000, lo que equivale a 0,14 Mb, es decir una resolución mayor a 30 veces respecto a la obtenida con el CGH en cromosomas metafásicos (Feuk et al, 2006).

FIGURA 1: A) Las muestras hibridadas al microarreglo se visualizan mediante un escáner de fluorescencia que genera una imagen pseudocoloreada. (B)Conociendo la posición genómica de las sondas se genera un perfil de ganancias y pérdidas entre las muestras. Ver más explicación en el texto.

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2. PROTOCOLOS 2.1 MARCAJE FLUORESCENTE DE DNAS DE INTERÉS Y DE REFERENCIA El procedimiento realizado en nuestro laboratorio se basa en el protocolo original descrito por el fabricante del kit BioPrime® Plus Array CGH Genomic Labeling System (Invitrogen-Life Technologies) con algunas modificaciones (Kim y Pollack, 2009; Urzúa et al, 2005). Los DNAs genómicos deben ser previamente digeridos con DpnII, una enzima de restricción de corte frecuente. Dada la susceptibilidad de los fluoróforos Cyanine al fotoblanqueamiento, es recomendable realizar el marcaje evitando exposición a la luz ambiental directa. 1) Para cada reacción, combine los siguientes componentes en un tubo eppendorf de color ámbar de 1,5 mL: Componente DNA de referencia (Cyanine-3) DNA de interés (Cyanine-5) 20 μL

20 μL

X μL (400 ng)

X μL (400 ng)

completar hasta 42 μL

completar hasta 42 μL

Random primers octámeros DNA genómico Agua libre de nucleasas

2) Denature por 10 min a 95°C. Enfríe inmediatamente en hielo por 5 min. Luego agregue: Componente

DNA de referencia (Cyanine-3)

DNA de interés (Cyanine-5)

dNTPs “low dC”

5 μL

5 μL

Cyanine 3-dCTP

2 μL

---

Cyanine 5-dCTP

----

2 μL

Enzima Klenow

1 μL

1 μL

Volumen final

50 μL

50 μL

3) La solución “low dC” se prepara previamente de acuerdo al Protocolo Anexo 2.4.1. 4) Mezcle suavemente por pipeteo y haga un spin-down de los tubos. 5) Incube a 37°C por 16 horas, protegido de la luz. 6) Agregue 5 μL de buffer stop y transfiera a hielo. 7) Purifique de acuerdo al Protocolo Anexo 2.4.2. 8) Obtenga lecturas de DO a 260, 320, 555, 650 y 750 nm para determinar el rendimiento y la incorporación de fluorescencia en el DNA marcado. Utilice la fórmula sugerida por el fabricante.

http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/bioprime_plus_arraycgh.pdf

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2.2 HIBRIDACIÓN DE DNAS MARCADOS SOBRE MICROARREGLO DE DNA OLIGONUCLEOTIDICO. Para este paso es necesario disponer de las muestras previamente marcadas en un volumen aproximado de 20 µL. Se necesita además de una solución de DNA-Cot1 concentrado (ver Protocolo Anexo 2.4.3) y de una solución de formamida 2X (ver Protocolo Anexo 2.4.4). 1) En un tubo eppendorf de color ámbar de 1,5 mL combine: Componente

DNAs de referencia e interés

Muestras marcadas purificadas

20 μL

DNA Cot-1 concentrado

10 μL

Solución de Formamida 2X

50 µL

Agua libre de nucleasas

10 uL

2) Denature esta solución a 95°C por 3 minutos. 3) Pre-hibride por 30 minutos a 42°C. 4) Haga un spin-down del tubo. Mantenga a temperatura ambiente y protegido de la luz, pero no devuelva al hielo. 5) Añada 10 μL de agua en los pocillos superior e inferior del cassette de hibridación. 6) Coloque el microarreglo dentro del cassette de hibridación. 7) Deposite los 90 μL de la solución que contiene los DNAs marcados sobre la superficie del microarreglo. 8) Suavemente deposite un cubreobjeto LifterSlip de 22 x 60 mm (Thermo) sobre la solución recientemente agregada, evitando la formación de burbujas. 9) Cierre rápida y firmemente el cassette de hibridación y transfiéralo a un baño de agua a 42°C para continuar una incubación durante 40 horas.

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2.3 LAVADO DEL MICROARREGLO DESPUÉS DE LA HIBRIDACIÓN. 1) Previamente se debe encender el escáner de fluorescencia y precalentar los láser. 2) Retire el cassette de hibridación desde el baño de agua y extraiga el microarreglo. 3) El cubreobjeto se desprenderá de la superficie del microarreglo cuando éste se introduzca en la primera solución de lavado. 4)

Coloque el microarreglo dentro de un canastillo de vidrio e realice los lavados de acuerdo a la siguiente secuencia: Solución

Cantidad de lavados

Temperatura

Tiempo

SSC 2X, SDS 0,1%

1

30 °C

5 min

SSC 1X

1

ambiente

5 min

SSC 0,1X

4

ambiente

3 min

5) Agite manualmente o mediante un agitador horizontal. 6) Después del último lavado seque el microarreglo introduciéndolo en un tubo falcon de 50 ml y centrifugándolo a 800xg durante 5 min a temperatura ambiente. 7) Capture la imagen de la hibridación en el scanner de fluorescencia ScanArray HT (Perkin-Elmer) y guarde la imagen para su posterior análisis.

2.4 PROTOCOLOS ANEXOS 2.4.1 Preparación de la solución de dNTPs “low dC”. En un tubo eppendorf de 1,5 ml añada los siguientes volúmenes de dNTPs Componente Volumen Concentracion final (mM) dATP 100 mM

10 μL

10

dGTP 100mM

10 μL

10

dTTP 100 mM

10 μL

10

dCTP 100 mM

4 μL

4

completar hasta 100 μL

----

Agua libre de nucleasas

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2.4.2 Purificación de las muestras marcadas. Se utiliza el kit MinElute PCR purification (Qiagen) con modificaciones menores: 1) Añada 5 volúmenes (275 μL) de buffer PB a 1 volumen (55 μL) de la reacción de marcaje. Mezclar suavemente con micropipeta y hacer un spin-down. 2) Coloque una columna minElute en un tubo colector de 2 ml. 3) Agregue la muestra dentro de la columna minElute y centrifugue por 1 minuto a 17900 xg (13000 rpm) a temperatura ambiente. 4) Coloque la columna en un nuevo tubo colector de 2 mL, y deseche el tubo anterior con el filtrado. 5) Agregue 750 µL de Buffer PE. Tape la columna y centrifugue por 1 minuto a 17900 xg (13000 rpm) a temperatura ambiente. 6) Ponga la columna en un nuevo tubo colector de 2mL y deseche el tubo colector con el filtrado anterior. 7) Centrifuge por 1 minuto a máxima velocidad a temperatura ambiente. 8) Deseche la columna en un tubo eppendorf ambar limpio de 1,5 mL, y deseche el tubo colector que contiene el filtrado. 9) Para eluir, cuidadosamente abra la tapa de la columna y agregue 13 µL de agua libre de nucleasas. Cierre la tapa e incube a temperatura ambiente (15-25°C) por 3 minutos. Centrifugue a 17900 xg (13000 rpm) a temperatura ambiente por 2 minutos.

2.4.3 Preparación del DNA Cot-1. 1) Precipite 50 μL de Human DNA Cot-1 (1 μg/μL) con 5 μL de acetato de sodio 3 M y 125 μL de etanol 100%. Incube a -20°C toda la noche. 2) Centrifugue a máxima velocidad por 10 minutos a 4°C. Elimine con cuidado el sobrenadante y lave el pellet con etanol 80%. Centrifugar como en el paso anterior. Repetir este lavado una vez más. 3) Retire el sobrenadante y seque el pellet al aire invirtiendo el tubo abierto sobre papel absorbente por unos minutos hasta que el etanol remanente se evapore. 4) Resuspender el pellet en 10 μL de agua libre de nucleasas.

2.4.4 Preparación de la solución de hibridación. La solución de hibridación 2X contiene 50% de formamida, 10x SSC, 0,2% de SDS, 0,02% de DNA de espermio de salmón. Se prepara de la siguiente forma: Componente Formamida desionizada 100% SSC 20 X SDS 10 % DNA de espermio de salmón (10 μg/μL)

Solución formamida 2X 25 μL 25 μL 1 μL 1 μL

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3. REFERENCIAS Feuk L, Carson AR, Scherer SW. Structural variation in the human genome. Nature Rev Genetics 2006, 7, 85-97. Holland AJ, Cleveland DW. Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009 Jul;10(7):478-87. Kallioniemi OP, Kallioniemi A, Piper J, Isola J, Waldman FM, Gray JW, Pinkel D. Optimizing comparative genomic hybridization for analysis of DNA sequence copy number changes in solid tumors. Genes Chromosomes Cancer. 1994 Aug;10(4):231-43. Kim YH, Pollack JR. Comparative genomic hybridization on spotted oligonucleotide microarrays. Methods Mol Biol. 2009;556:21-32. Urzua U, Frankenberger C, Gangi L, Mayer S, Burkett S, Munroe DJ. Microarray comparative genomic hybridization profile of a murine model for epithelial ovarian cancer reveals genomic imbalances resembling human ovarian carcinomas. Tumour Biol. 2005 Sep-Oct;26(5):236-44.

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ENSAYO DE GENOTIPIFICACIÓN SNP CYP1B1 SUSTITUCIÓN DE C/G El gen CYP1B1, pertenece a la superfamilia de la enzima citocromo P450, principalmente expresada en pulmón. El producto de este gen, juega un rol significativo en la oxidación de una variedad de tóxicos ambientale, tales como los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs). Polimorfismos de este gen, se han asociado a una mayor susceptibilidad a Cáncer Pulmonar (CP). El método utilizado en esta práctica para la genotipificación del SNP del gen CYP1B1 es PCR en tiempo real cuantitativo (qPCR). El qPCR es una reacción enzimática, que amplifica y cuantifica, una determinada secuencia genómica de interés y la sigue en el tiempo. El ensayo de qPCR utilizado será de tipo TaqMan. El sistema TaqMan se basa en la amplificación de la región génica de interés, utilizando sondas específicas para cada alelo estudiado. El sistema incluye una sonda con dos fluoroforos: - un reportero que emite fluorescencia al ser excitado a una determinada longitud de onda y - un apagador que captura la fluorescencia emitida por el reportero. Este método de genotipificación permitirá detectar productos de amplificación específicos para un SNP del gen CYP1B1.

PROCEDIMIENTO: -

Preparar el Mix de reacción solamente en el mesón libre de DNA, utilizar solo las micropipetas, tubos y puntas libres de DNA marcadas. Evitar que el ensayo de SNP esté expuesto a la luz directa. Mezclar por vortex y hacer un spin a todos los reactivos antes de utilizar Una vez utilizados los reactivos guardar refrigerado o congelado, según como se le indique.

Mezcla de reacción:

-

Reactivo

Volumen (µL) por tubo

Concentración de trabajo final

TaqMan® Genotyping Master Mix (2X)

5,0

1X

TaqMan ®Genotyping Assay mix (40X)

0,25

1X

H2O

2,75

-

X

Mezclar con vortex, el tubo con la mezcla y hacer un spin. Colocar 8 µL de la mezcla en cada uno de los pocillos de la placa o los tubos.

Llevar la placa al sector de carga de DNA y cargar 2 µl de DNA por duplicado. Evitar dar el segundo tope con la micropipeta al cargar la muestra, evitar la formación de burbujas en el fondo del tubo placa. Colocar la placa en el equipo y esperar lectura de la placa