CLONACIÓN DEL GEN rv1411 DE Mycobacterium tuberculosis H37Rv EN Escherichia coli Y SU INTEGRACIÓN EN EL GENOMA DE Pichia methanolica

JHAZAIRA MANTILLA PÉREZ

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BIOLOGÍA Bogotá D. C. Noviembre de 2010

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CLONACIÓN DEL GEN rv1411 DE Mycobacterium tuberculosis H37Rv EN Escherichia coli Y SU INTEGRACIÓN EN EL GENOMA DE Pichia methanolica

JHAZAIRA MANTILLA PÉREZ

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Ingrid Schuler García, Ph. D

Andrea Forero Ruíz, Bsc

Decana Académico 

Directora de Carrera  

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CLONACIÓN DEL GEN rv1411 DE Mycobacterium tuberculosis H37Rv EN Escherichia coli Y SU INTEGRACIÓN EN EL GENOMA DE Pichia methanolica

JHAZAIRA MANTILLA PÉREZ

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Claudia Marina Muñoz, Bsc

Raul Poutou BQ, M.Sc., Ph.D.

Directora 

Jurado 

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NOTA DE ADVERTENCIA "La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia". Artículo 23 de la Resolución No13 de julio de 1946.

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TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN 8

1. INTRODUCCIÓN 2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

10

3. OBJETIVOS

12

3.1

OBJETIVO GENERAL

12

3.2

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

12 13

4. MARCO TEÓRICO 4.1

TUBERCULOSIS

13

4.2

ETAPAS DE LA INFECCIÓN

13

4.3

Mycobacterium tuberculosis (Mtb)

15

4.4

ENVOLTURA CELULAR DE Mtb

16

4.5

GENÓMICA Y PROTEÓMICA DE Mtb

18

4.6

LIPOPROTEÍNAS Y VÍAS DE SECRECIÓN

19

4.7

ANTÍGENO DE 27kDa (Rv1411)

20

4.8

CLONACIÓN EN BACTERIA

21

Escherichia coli (E. coli)

22

4.8.1 4.9

22

SISTEMAS DE EXPRESIÓN EN LEVADURAS

4.9.1

Sistema de Expresión en Pichia methanolica

23

4.9.2

Descripción del Sistema Pichia methanolica

25 27

5. METODOLOGÍA 5.1

DISEÑO DE CEBADORES

27

5.2

AMPLIFICACIÓN DEL GEN rv1411 POR PCR

27

5.3

PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO DE PCR CORRESPONDIENTE AL 28

GEN rv1411 Y LIGACIÓN AL VECTOR pMETα B 5.4

CLONACIÓN DEL CONSTRUCTO EN E. coli Y SEPARACIÓN DEL 29

CASSETTE DE EXPRESIÓN 5.5

PREPARACIÓN

DE

CÉLULAS

ELECTROCOMPETENTES

TRANSFORMACIÓN POR ELECTROPORACIÓN 5  

Y 30

6. RESULTADOS

31

6.1

DISEÑO DE CEBADORES

31

6.2

AMPLIFICACIÓN DEL GEN rv1411 POR PCR

32

6.3

CLONACIÓN DEL AMPLÍMERO EN E. coli

32

6.4

SEPARACIÓN DEL CASSETTE DE EXPRESIÓN

34

6.5

PURIFICACIÓN DE DEL CASSETTE DE EXPRESIÓN

34

6.6

TRANSFORMACIÓN DE CEPAS PMAD11 DE P. methanolica POR ELECTROPORACIÓN

35

7. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

37

8. BIBLIOGRAFÍA.

41

6  

RESUMEN La tuberculosis es una enfermedad producida por el bacilo Mycobacterium tuberculosis (Mtb) y se considera como uno de los mayores problemas de salud pública a nivel mundial, esta micobacteria posee características particulares de membrana como la secreción de ciertas proteínas implicadas en la virulencia del bacilo; por esta razón es importante implementar nuevos métodos de expresión de dichas proteínas para su posterior utilización como posibles candidatos a vacuna contra la tuberculosis. Recientemente ha surgido la necesidad de utilizar sistemas de expresión no convencionales como el de la levadura metilotrófica Pichia methanolica, debido a que los sistemas bacterianos convencionales aunque pueden expresar proteínas recombinantes, lo hacen en bajos niveles, implican mayor trabajo en cuanto a la purificación de la proteína y no realizan las modificaciones post-traduccionales. Por esta razón se ha implementado el sistema de P. methanolica, caracterizado por su capacidad de producir altos niveles de proteína, realizar y conservar modificaciones post-traduccionales que incluyen la expresión de proteínas no glicosiladas, y mayor capacidad de metabolizar el metanol, facilitando la inducción de la expresión de la proteína. Para la clonación del gen rv1411 que codifica para la lipoproteína de pared Rv1411, se realizó extracción de DNA genómico de Mtb H37Rv a partir de la cepa cultivada “in vitro”, luego se amplificó el gen rv1411 a través de PCR; el fragmento amplificado y purificado se utilizó para la ligación con el vector pMETα B de P. methanolica. En células termocompetentes E. coli TOP10 se confirmaron los clonos recombinantes realizando PCR de colonia y secuenciación; posteriormente se realizó digestión enzimática con el fin de separar el cassette de expresión. La transformación en P. methanolica se llevó a cabo cultivando cepas PMAD11, que previamente fueron convertidas en células electrocompetentes para permitir la entrada del cassette, luego se realizó electroporación para integrar el cassette de expresión al genoma de la levadura; esta integración se confirmó por PCR de colonia.

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1.

INTRODUCCIÓN

La expresión de lipoproteínas de Mtb constituye una herramienta fundamental para la postulación de posibles candidatos para el desarrollo de una vacuna más efectiva contra la tuberculosis. En general, las proteínas recombinantes producidas en diferentes sistemas de expresión no han sido compatibles con los sistemas de mamíferos en cuanto al requerimiento de glicosilación para lograr su actividad biológica. Debido a diferencias en los patrones de glicosilación, dichas proteínas probablemente no son adecuadas para su utilización como terapias inyectables en mamíferos (Raymond et. al., 1999). Escherichia coli es un bacteria altamente utilizada como modelo biológico para un gran número de investigaciones en biología molecular, este bacilo Gram negativo se caracteriza por su crecimiento rápido y su fácil manipulación genética. Como primer paso para la expresión de proteínas, la clonación en E. coli permite la replicación de un alto número de copias de plásmido, que posteriormente puede ser transformado en P. methanolica, que al ser un sistema eficiente de expresión de proteínas recombinantes y al tener la capacidad de expresar proteínas glicosiladas o remover potenciales sitios de glicosilación, se convierte en uno de los sistemas más eficaces y económicos para la expresión de proteínas posiblemente implicadas en virulencia, y asociadas a la invasión e infección de los macrófagos alveolares. Es de resaltar que la capacidad de Mtb para sobrevivir y causar la enfermedad está estrechamente con las proteínas de pared, las cuales son determinantes en cuanto a la patogenicidad de la bacteria, confiriéndole habilidad para escapar a los mecanismos de defensa inmunológica (Pieters, 2008). Existe un conjunto de proteínas de pared entre las cuales se destaca la lipoproteína de 27kDa “Rv1411” codificada por el gen rv1411; dicha proteína está directamente relacionada con la activación de la respuesta inmune y la señalización intracelular para la producción de interleucina (IL12) la cual reactiva y polariza las células T, siendo de vital importancia para el control temprano de la infección (Wang, 2007). P. methanolica ha sido utilizada como sistema de expresión de proteínas recombinantes, debido a su habilidad para crecer rápidamente en metanol empleándolo como fuente de carbono y energía (Raymond, 1999). El estudio de la expresión de proteínas recombinantes en levaduras 8  

metilotróficas como P. methanolica y P. pastoris, así como sus diferentes estrategias de utilización de la fuente de carbono, puede contribuir a incrementar el rendimiento de los productos obtenidos (Poutou et. al., 2010). Siendo Rv1411 una proteína importante en la generación de respuesta inmune, es fundamental implementar el sistema de P. methanolica para su expresión, ya que las características de este sistema le podrían conferir mayor compatibilidad con sistemas de mamíferos, y por tanto facilitar una respuesta inmune óptima en caso de inoculación como candidata a vacuna. Adicionalmente posee ventajas metodológicas en cuanto su fácil manejo en los diferentes procesos como: ligación del gen al vector pMETα B, transformación por electroporación en la cepa PMAD11 para la expresión y purificación de la proteína para posteriores investigaciones.

9  

2.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

Mtb es el responsable de la mayor cantidad de casos de tuberculosis en el mundo afectando alrededor de un tercio de la población mundial. Según la OMS se estima que en los últimos años (2008-2009) se han presentado 9,27 millones de casos incidentes de tuberculosis en todo el mundo, es decir más que los 9,24, 8,3 y 6,6 millones registrados en 2006, 2000 y 1990, respectivamente. (WHO, 2009). Debido a la gran incidencia de dicha enfermedad y a las fallas terapéuticas recurrentes se hace necesario buscar alternativas novedosas y más eficaces que las políticas de prevención y el tratamiento convencional que se utiliza actualmente. Diferentes estudios de la envoltura micobacteriana han demostrado que las bacterias del género mycobacterium presentan en su pared una gran variedad de lipoproteínas, que son un subgrupo de proteínas secretadas cuyo metabolismo además de definir su rol en el proceso de patogénesis, es uno de los factores determinantes en la virulencia de la tuberculosis (Sander et. al. 2004). La lipoproteína de pared Rv1411 de Mtb, ha sido expresada intracelularmente utilizando como sistema de expresión Mycobacterium smegmatis, debido a que puede preservar los sitios correctos de glicosilación lo que permite unirse a los receptores de las células de defensa, mantenerse en ellas y de esta forma iniciar el ciclo de infección (Wang, 2007). Aunque este organismo puede expresar la proteína, no la produce en niveles altos y presenta un crecimiento lento en comparación con otros organismos. Con el fin de integrar en el genoma de P. methanolica el constructo correspondiente al gen rv1411 y el vector pMETα B para su posterior expresión, conservando las modificaciones post-traduccionales de su forma nativa; el uso de la levadura P. methanolica podría constituir una gran ventaja ya que posee características especiales inherentes a su naturaleza eucariota, lo cual le confiere mayor compatibilidad con organismos superiores, produciendo altos niveles de expresión sin necesidad de proteínas de fusión como en el caso de otras especies de bacterias y levaduras ya estudiadas. El sistema de expresión de P. methanolica incluye dos vectores de expresión cada uno con tres versiones diferentes para facilitar el marco de clonación; dichos vectores son pMET A, B, C y pMETα A, B, C para expresión intracelular o secretada, respectivamente (P. methanolica 10  

Expression kit, 2009); en este caso con la utilización de pMETα B hay bajas probabilidades de que se concentre en el espacio periplásmico, lo que conduce a la expresión de altos niveles de proteína; por lo que la utilización de este vector representa la mejor opción para la obtención de Rv1411. Así como se han expresado intracelularmente en P. methanolica proteínas como la Glutamato Descarboxilasa, y proteínas secretadas como la citoquina humana, hirudina y leptina para el tratamiento de diferentes enfermedades (Raymond et. al., 1999) entre muchas otras; también se hace necesaria la expresión de proteínas de Mtb como Rv1411, debido a su importancia en la señalización intracelular para la generación de interleuquina IL-12. Adicionalmente Rv1411 participa en la reactivación de los linfocitos T de la línea de defensa a través del reconocimiento por parte de los receptores TLR2 de los macrófagos (Drage et. al., 2009), y en la inhibición de los macrófagos del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase II (Hovav et. al., 2006). Teniendo en cuenta cada etapa de los procedimientos para la obtención de colonias transformantes estables, cuyo ADN contiene el constructo de interés, es importante generar transformantes adecuados para su futura expresión de manera óptima. Adicionalmente se hace necesario continuar la expresión de otras proteínas de Mtb en sistemas eficientes como P. methanolica para la optimización de su expresión y producción, pues de esta manera se podría obtener un producto con mejores patrones estructurales en cuanto al plegamiento de la proteína y su relación con las funciones biológicas; a su vez dichos patrones estructurales podrían determinar el uso potencial de las proteínas resultando ser más adecuadas para utilizarlas como posibles terapias inyectables.

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3. OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GENERAL Clonar en E. coli e integrar en el genoma de P. methanolica el gen rv1411 que codifica para la lipoproteína Rv1411 de Mycobacterium tuberculosis H37Rv. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS •

Obtener clonos recombinantes con el gen rv1411 unido al vector pMETα B en

Escherichia coli TOP10. •

Obtener cepas transformantes PMAD11 de P. methanolica, con el cassette de expresión

correspondiente al gen rv1411 unido al vector pMETα B.

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4. MARCO TEÓRICO 4.1

TUBERCULOSIS

La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa causada por el bacilo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), esta enfermedad ha presentado dificultades en cuanto a la eficiencia de los sistemas de prevención y control, debido a las características del patógeno y a la aparición de cepas multirresistentes (MDR) y extremadamente resistentes (XDR). El continente Africano es un ejemplo de ello, pues en los últimos años se ha presentado un incremento en los casos de TB multirresistente a los medicamentos de primera y segunda línea, lo que podría estar relacionado con que allí se presentan los índices más altos de VIH en el mundo (Schaaf, et. al 2009). La Organización Panamericana de la Salud (OPS) ha estimado que en Colombia se registraron 11.671 casos en el año 2009, siendo las poblaciones más vulnerables las que presentan VIH (SIDA) y de las que aproximadamente un 10% del total de casos presentan coinfección TB-VIH (OPS, 2009). A nivel mundial se estima que en 2008 se presentaron 9,4 millones de casos lo que indica que aunque ha habido un leve aumento en el número de casos con respecto a 2007 donde se registraron 9,3 millones, la tasa de incidencia se mantiene constante debido al simultáneo aumento de la población (WHO, 2009).

4.2

ETAPAS DE LA INFECCIÓN

La infección inicia por la inhalación de aerosoles provenientes de una persona que presenta tuberculosis pulmonar, que al toser o estornudar libera un pequeño número de bacilos; una vez en los pulmones, los bacilos son internalizados por fagocitosis a través de los macrófagos alveolares presentes en el pulmón (Kaufmann, 2001 en Pieters, 2008). Los macrófagos infectados reclutan otros macrófagos y otras células del sistema inmune para formar unas estructuras llamadas granulomas (Cosma et. al., 2003 en Muse et. al. 2008); se cree que el granuloma es benéfico para el hospedero porque logra contener y limitar la actividad de la bacteria (Kaufmann, 2006 en 13  

Muse et. al. 2008). Una vez adentro del macrófago, Mtb modula la actividad de su fagosoma previniendo su fusión con los lisosomas hidrolíticos del macrófago. (Rohde et. al., 2007 en Russell et. al., 2009) (Figura 1).

Figura 1. Progresión del granuloma de la tuberculosis humana (Russell et. al., 2009). Las etapas iniciales de la formación del granuloma dependen de la producción del factor de necrosis tumoral (TNF) por parte de los macrófagos infectados y células T; esta señal es necesaria para mantener la concentración de quimioquinas y lograr tanto el reclutamiento como la retención de la infección (Algood et. al., 2005 y Saunders et. al., 2007 en Russell et. al., 2009).

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En la etapa temprana, el granuloma tiene un núcleo con macrófagos infectados que se encuentran encerrados en una mezcla de macrófagos esponjosos y otros fagocitos mononucleares, que a su vez están rodeados por linfocitos; este tejido de respuesta inmune retiene la infección y marca el fin del período de replicación rápida de Mtb. Cuando el granuloma madura desarrolla una cápsula fibrosa que encierra el núcleo y excluye la mayoría de los linfocitos del centro de la estructura; en esta etapa hay un gran incremento en el número de macrófagos esponjosos en la cápsula, lo cual indica la progresión de la enfermedad. Cuando se presenta una infección avanzada el centro del granuloma se abre y libera millones de bacilos a las vías aéreas, en este punto el daño a los pulmones produce tos la cual facilita el inicio de un nuevo ciclo de vida del bacilo (Russell et. al., 2009).

4.3

Mycobacterium tuberculosis (Mtb)

M. tuberculosis (Mtb) es un bacilo ácido alcohol resistente, que pertenece al orden Actinomycetales (bacterias con forma de hongos), familia mycobacteriaceae e incluido dentro del género Mycobacterium. Este bacilo es un patógeno obligado que parasita los macrófagos, aunque induce una fuerte respuesta inmunológica, éste persiste en el interior de los macrófagos evadiendo el sistema inmune de la célula hospedera (Prahlad et. al., 2009). Mtb posee lípidos de pared muy elaborados considerados como los efectores principales de la patogénesis; estos lípidos pueden ser liberados al citoplasma de la célula hospedera, aquí se acumulan en los lisosomas interviniendo en la inhibición de la producción de citoquinas, en la activación de los macrófagos, en la regulación de la apoptosis celular y en la maduración de los macrófagos impidiendo su desarrollo normal (Shui et. al., 2009). Mtb ha desarrollado estrategias adaptativas para la manipulación de la respuesta de la célula hospedera durante y después de su entrada al macrófago; los lípidos de pared celular los cuales hacen el primer contacto con la célula hospedera, desempeñan un papel fundamental para el reconocimiento y modulación de la respuesta inmune (Torrelles et. al., 2010). La pared de las micobacterias es una mezcla compleja de gran cantidad de lípidos como ácidos grasos de cadena 15  

larga, ácidos micólicos, que están unidos covalentemente a polímeros de arabidogalactanos y a peptidoglucanos, éstos se encuentran organizados para formar la capa interior de la membrana externa y otros lípidos que forman la capa externa de dicha membrana (Song et. al., 2008). Por las características de su pared, Mtb tiene la capacidad de ser viable por largos períodos de tiempo dentro del hospedero infectado; los componentes principales de la superficie de la pared celular son lípidos y carbohidratos. El proceso de glicosilación produce una gran variedad de glicanos o azúcares combinados, los cuales juegan un rol importante en procesos de adhesión celular, tráfico de moléculas, activación de receptores, endocitosis y transducción de señales (Varki, 2006 en Torrelles et. al., 2010).

4.4

ENVOLTURA CELULAR DE Mtb

La envoltura celular es la estructura que le confiere protección y resistencia a la micobacteria contra las defensas del hospedero, además le permite adaptarse a las condiciones del entorno; los componentes de la superficie celular, particularmente los que contienen manosa, son de vital importancia debido a que están implicados en la supervivencia de Mtb dentro del macrófago (Torrelles et. al., 2010). La envoltura de las micobacterias patógenas posee dos clases de lípidos que forman el complejo de lipoglicanos, estos son el lipoarabidomanano (LAM) y el lipomanano (LM) los cuales están multiglicosilados. Dicha envoltura puede ser dividida en tres estructuras (Figura 2): la membrana plasmática, la pared celular y la cápsula. La membrana plasmática es una bicapa asimétrica compuesta principalmente por fosfolípidos y proteínas, los ácidos más importantes son palmítico, esteárico, oléico y tuberculoesteárico (Guenin-Macé et. al., 2009). El componente principal de la membrana es el (LAM), al ser un glicolípido abundante, se une a esta a través del glicosil-fosfatidil-inositol (GPI) y se extiende a lo largo de toda la pared celular; (Briken et. al., 2004 en Welin et. al., 2008). La pared está compuesta de un peptidoglicano, unido a arabidogalactano (AG) esterificado con ácidos micólicos; estos tres componentes están presentes en todas las especies de micobacterias; 16  

el peptidoglicano es característico de la pared de las eubacterias y está compuesto por repeticiones de N-acetilglucosamina y unidades de ácido murámico N-glicosilado; y es el responsable de la rigidez de la envoltura micobacteriana (Guenin-Macé et al., 2009). La cápsula o capa exterior de Mtb es particularmente rica en manosa, incluye una capa de lipoarabidomanano (ManLAM), siendo la macromolécula con mayores niveles de expresión en la superficie del bacilo; a su vez el Fosfatildil inositol manósido (PIM), el LM y el Man LAM son incorporados dentro de la membrana plasmática, al mismo tiempo que son expuestos en la superficie celular. Todos estos componentes actúan como ligandos para la adhesión a los receptores de la célula hospedera y contribuyen en la patogenicidad de Mtb (Strohmeier et. al., 1999. Nigou et. al., 2003.Geijtenbeek et. al., 2003 en Torrelles et. al., 2010).

Figura 2. Representación esquemática de la envoltura celular de micobacterias patógenas. Modificado de: Lipids of Pathogenic Mycobacteria: Contributions to Virulence and Host Immune Suppression (Guenin-Mace et. al., 2009). 17  

4.5

GENÓMICA Y PROTEÓMICA DE Mtb

Con la publicación del genoma completo de Mtb H37Rv por Stewart Cole y colaboradores en 1998, fueron identificadas varias familias de proteínas relacionadas con ácidos grasos, familias de proteínas ricas en prolina-ácido glutámico (PE) y ricas en prolina-prolina-ácido glutámico (PPE) que son únicas en el grupo de Mtb. Esta información ha sido importante para monitorear la expresión de genes, modular su persistencia y de esta manera identificar posibles proteínas blanco para el desarrollo de medicamentos (Ioerger et. al., 2010). El genoma de Mtb está compuesto de aproximadamente 4000 genes que codifican para proteínas, es altamente conservado y aunque tiene variación genética limitada, posee un alto grado de variabilidad fenotípica entre bacterias aisladas de diferentes ambientes (Gagneux et. al., 2007 en Cubillos et. al., 2008). Se sabe que sólo cerca de la mitad de los genes constituyentes del genoma se les ha determinado su función, esto es, 1.756 de 4066 genes, el resto corresponden a proteínas hipotéticas (Camus, et. al., 2002 en Ioerger et. al., 2010). El estudio del proteoma de Mtb es fundamental para entender las bases moleculares de su virulencia y patogenicidad (Gu et. al., 2003), y se ha dirigido a la descripción de la función de las proteínas de su envoltura, a su vez está enfocado en determinar la relevancia de las especies micobacterianas que expresan dichas proteínas, pues podrían ser usadas como posibles blancos para el desarrollo de medicamentos contra la tuberculosis. La mayoría de los estudios de proteómica están concentrados en determinar la abundancia de varias proteínas a lo largo del desarrollo del patógeno; algunos patógenos como Mtb al no tener estadíos definidos cuando se encuentra dentro del hospedero, crea una interacción dinámica entre los dos, es decir, está en constante evasión del sistema inmune a través de diferentes proteínas de superficie con el fin de sobrevivir y continuar la infección (Prahlad et. al., 2009). Según estudios de la secreción de diferentes proteínas a través de la membrana en micobacterias, se ha encontrado que dichos cambios son parámetros importantes en la adaptación del organismo al ambiente, en este caso en la persistencia de Mtb dentro de macrófago; adicionalmente se ha descrito que la dinámica del proteoma de un estado a otro involucra procesos continuos de degradación y síntesis de nuevas proteínas (Prahlad et. al., 2009). La proteómica cuantitativa 18  

emplea el método de espectrometría de masas de alta resolución para descifrar los diversos procesos biológicos, debido a su alta cobertura del proteoma y a la precisión en la cuantificación (Mann, 2006 en Shui et. al., 2009).

4.6

LIPOPROTEÍNAS Y VÍAS DE SECRECIÓN

Las lipoproteínas son un subgrupo de proteínas secretadas presentes en las bacterias caracterizadas por la presencia de una secuencia consenso llamada lipobox, la cual consiste en cuatro aminoácidos [LVI/ASTVI/GAS/C] que se encuentra en la región C-terminal (Babu et. al., 2006 en Rezwan et. al., 2007). El precursor de las lipoproteínas es generalmente trasladado por vía Sec dependiente, a través de la membrana plasmática con posterior modificación, sin embargo recientes investigaciones han demostrado que las lipoproteínas también pueden ser traslocadas por vía de arginina doble o sistema (Tat) (McDonough et. al., 2005 en Rezwan et. al., 2007). La modificación del precursor de las lipoproteínas es mediado por la actividad de tres enzimas: fosfatidilglicerol prelipoproteína diacilgliceroltransferasa (Lgt), prolipoproteína señal peptidasa II (LspA) y fosfolipido-apolipoproteína N-aciltransferasa (Lnt); la Lgt y LspA están presentes en todas las bacterias, mientras que Lnt ha sido reportada como única en bacterias Gram negativas (Wu, 1996 en Rezwan et. al., 2007). Los residuos de lípidos unidos covalentemente a la cisteína conservada permite el anclaje de las proteínas en la membrana a través de interacciones hidrofóficas; en bacterias Gram positivas las lipoproteínas asociadas a la célula se encuentran en la membrana plasmática. En bacterias Gram negativas la mayoría de las lipoproteínas asociadas a la célula se encuentran en la membrana externa, y sólo un 10% está anclada a la membrana plasmática (Rezwan et. al., 2007). En bacterias la exportación de proteínas a través de la membrana plasmática constituye el primer paso en la liberación de las proteínas a la superficie bacteriana. Existen dos sistemas responsables de esta liberación: la vía de secreción general (Sec) y la translocación de arginina doble (Tat), en ambos sistemas de exportación de proteínas, éstas son sintetizadas como precursores con secuencias amino-terminales y las secuencias señales están compuestas por tres estructuras: una 19  

región amino-terminal cargada, una región hidrofóbica y una región carboxi-terminal, que contiene el sitio de clivaje de la señal peptidasa (Lee, 2006 en McDonough et. al., 2008). La característica que distingue la secuencia señal Tat de la Sec, es la presencia de la secuencia consenso de arginina doble (S/R-RR-x-F-L-K), adicionalmente los sustratos de la vía Tat son translocados a través de la membrana en un estado plegado siendo este plegamiento un prerrequisito para la exportación; algunos sustratos de Tat requieren chaperonas citoplasmáticas que pueden ser específicas para un determinado sustrato ( Graubner, Perez, 2007; Delisa et. al., 2003 en McDonough et. al., 2008).

4.7

ANTÍGENO DE 27 KDa (rv1411)

La lipoproteína de membrana de 27 KDa, codificada por el gen rv1411 constituye un antígeno exclusivo de las especies del complejo de Mtb y hace parte de un operón en el cual los genes codifican para tres proteínas putativas de membrana LpgrA, LpgrX y LpgrF que comparten una alta homología con la proteína Rv1411 (Bigi et. al., 2000). Diferentes análisis por espectrometría de masas de la lipoproteína de 27kDa, revelaron que dos lipoproteínas putativas de M. bovis: Rv1270c y Rv1411c codificadas por los genes lprA y lprG respectivamente, comparten una homología de aminoácidos del 99% y 100% para las mismas proteínas en Mtb H37Rv (Gehring et. al., 2004). Se ha demostrado que esta proteína es crucial para la generación de la respuesta inmune Th1, y por lo tanto demostró ser fundamental para la inhibición de los macrófagos MHC tipo II procesados por la vía de señalización TLR2. A su vez en estudios de inmunización de ratones, esta lipoproteína induce la producción de altos niveles de IFN-γ, el cual es muy importante para el control temprano de la infección; la producción de IFN-γ es mediado por el sistema inmune innato, que al ser un agente inmunomodulador tiene gran influencia en el curso de la infección (Hovav et. al., 2006). Se ha identificado que Rv1411 puede inhibir el proceso de activación de los macrófagos primarios MHC tipo II, con ésta inhibición se hace evidente que a través de las lipoproteínas Mtb 20  

disminuye el reconocimiento de los macrófagos infectados por parte de las células T CD4; y con este mecanismo Mtb logra la evasión del sistema inmune durante el proceso de infección (Gehring et. al., 2004). Esta lipoproteína además de los otros componentes de la pared, está ligada a los receptores TLR2 de la superficie de los macrófagos, esta señalización inicia la producción de óxido nítrico (NO) y la secreción de citoquinas proinflamatorias como TNF y IL 12, las cuales activan la inmunidad innata y promueven la activación se las células T CD4 (Underhill et. al., 1999 y Brightbill et. al., 1999 en Gehring et. al., 2004). Para confirmar dicha señalización intracelular, se produjo una proteína recombinante (de fusión) CSU-F36, junto con Rv1411 en su N-terminal; ésta fue expresada en Mycobacterium smegmatis para preservar los sitios correctos de glicosilación, dando como resultado un incremento en el porcentaje de células T CD4 que entran en los pulmones de ratones infectados, con lo cual se obtuvo un grado de protección similar a obtenido en la vacuna con M. bovis (Wang et. al., 2007).

4.8

CLONACIÓN EN BACTERIA

Desde el descubrimiento de E. coli como el hospedero más práctico para la introducción de DNA foráneo, se ha implementado como el sistema más común en el campo de la genética y de la biología molecular (Yoshida et. al., 2009). En algunos estudios otras especies bacterianas como Haemophilus influenzae y Streptococcus pneumoniae (Wagoner e.t al., 2004 y Bättig et. al., 2008, en Yoshida et. al., 2009), han sido consideradas blanco de uso para clonación y expresión de recombinantes, no obstante se determinó que no poseen la misma habilidad de E. coli para introducir y clonar DNA foráneo. Para la clonación en bacteria es necesario realizar el proceso de trasformación, el cual puede realizarse mediante varios métodos como transformación química, térmica, electrotransformación y transformación biolística (Yoshida et. al., 2009). Generalmente el proceso de transformación en bacteria se lleva a cabo por choque térmico y electroporación donde las células son sometidas a choques eléctricos con voltajes que varían según el tipo celular; este método es ampliamente utilizado debido a que requiere pocos pasos y ofrece más facilidades frente a otras técnicas (Current Protocols In Molecular Biology, 2003). 21  

4.8.1 Escherichia coli (E. coli) E. coli es un bacilo gram negativo que posee un cromosoma circular compuesto por 3 millones de pares de bases, esta bacteria está caracterizada por crecer rápidamente en medios mínimos que contienen carbono como la glucosa, la cual es utilizada por la bacteria para obtener energía y como fuente de carbono. A su vez, utiliza las sales del medio para obtener nitrógeno y fósforo; cuando crece en un medio enriquecido éste provee a las células los elementos necesarios como aminoácidos, precursores de nucleótidos, vitaminas y otros metabolitos que la bacteria tendría que sintetizar (Current Protocols In Molecular Biology, 2003). Existen gran variedad de cepas utilizadas para la clonación como M15, XL1, SG113009, TOP 10 entre otras, siendo las TOP 10 una de las más utilizadas debido a que presentan gran eficiencia en la trasformación, permiten una replicación estable y son ideales para la clonación y propagación del vector (TOP10 Chemically Competent E. coli, Invitrogen, 2006).

4.9

SISTEMAS DE EXPRESIÓN EN LEVADURAS

Las levaduras poseen una gran facilidad para manipularlas genéticamente, y la capacidad de secretar y modificar proteínas foráneas acorde con la química general de eucariotas; su rápido crecimiento y su alta capacidad de fermentación en medios simples, tienen un alto impacto en la producción industrial de proteínas recombinantes a gran escala (Idiris et. al., 2010). Aunque las bacterias son productores eficientes de proteínas heterólogas, no son aptas para realizar algunos procesos post-traduccionales como plegamiento, glicosilación, fosforilación o remover parte de la secuencia inicial de proteínas eucariotas. Contrario a lo ocurrido con las levaduras que son organismos eucariotas, tienen la capacidad de realizar modificaciones post-traduccionales y secretar proteínas eucariotas heterólogas biológicamente funcionales lo más parecidas a su forma nativa. Existen factores que pueden afectar la concentración de la proteína secretada como: el hospedero, las condiciones de cultivo,

22  

el vector, el promotor, la secuencia de codones, señales traduccionales, plegamiento y secreción (Niebaur y Robinson, 2005 en Idiris et. al., 2010). Los sistemas de expresión de levaduras son considerados de gran ventaja sobre sistemas procariotas y otros eucariotas, debido a que además de generar bajo costo puede realizar modificaciones a los componentes de las proteínas expresadas. Adicionalmente las levaduras metilotróficas son capaces de secretar proteínas a las que se les han realizado procesos que implican modificaciones que incluyen el proceso de glicosilación. Al ser un sistema de producción, combina características como fácil manipulación genética y rápido crecimiento en medios económicos, obteniendo altas densidades de células en poco tiempo (Gellinsen, 2000). Existe un gran número de especies de levaduras entre las cuales las pertenecientes a los géneros Hansenula, Candida, Torulopsis y Pichia, son denominadas metilotróficas debido a que son capaces de crecer en metanol tomándolo como fuente de carbono (Barnett et. al., 1990 en Gellinsen, 2000); a su vez los vectores usados para la transformación en estas levaduras, son integrados a su genoma constituyendo un proceso de producción estable y consistente (Gellinsen, 2000).

4.9.1 Sistema de expresión Pichia methanolica Las levaduras del género Pichia pertenecen al reino fungi, filo Ascomycota, clase Saccharomycetes,

órden

Saccharomycetales

y

familia

Saccharomycetaceae;

presenta

reproducción sexual, forma colonias no filamentosas de color blanco o crema y se pueden encontrar en diferentes ambientes (Poutou et. al., 2005). Pichia methanolica es una levadura metilotrófica, considerada como un sistema de expresión no convencional y debido sus características particulares, se ha convertido en un microorganismo muy atractivo para la expresión y producción de diferentes proteínas. P methanolica es una levadura de rápido crecimiento, fácil manipulación genética y económica frente a otros sistemas, y generalmente genera altos niveles de expresión; por sus características moleculares, posee la mayor ventaja en cuanto al plegamiento de proteínas heterólogas (de 10 a 100 plegaminetos) (Wang et. al., 2007). A diferencia de otros sistemas de expresión del mismo género como Pichia pastoris, la levadura 23  

P. methanolica posee características diferentes en cuanto a los sustratos de carbono que utilizan; en P. pastoris la D-glucosa y la mezcla de etanol-glicerol genera una inhibición del genes (Alcohol Oxidasa) AOX1 y AOX2, en el caso de P. methanolica los genes (Genes Utilizadores de Alcohol) AUG1 y AUG2 son inhibidos por la D-glucosa y por etanol, pero son inducidos con la mezcla glicerol-metanol (Hartner y Glieder, 2006 en Poutou et. al., 2010). P. pastoris realiza recombinación homóloga, mientras que P. methanolica cuando es transformada realiza recombinación no homóloga; por esta razón el cassette de expresión puede ser integrado en varios lugares dando como resultado el fenotipo Mut+ (Hiep et. al., 1993; Raymond et. al., 1998 en Poutou et. al., 2010). P. methanolica tiene dos clases de fenotipos transformantes Ade+ (Mut + y Muts), Mut + aparece cuando el gen AUG2 está ausente; y el fenotipo Muts se obtiene cuando el gen AUG1 está ausente. En cuanto a patrones de glicosilación P. pastoris no presenta la tendencia a hiperglicosilar;

para el caso de P. methanolica las

modificaciones postraduccionales todavía no están bien caracterizadas (Invitrogen, 2009 en Poutou et. al., 2010). En diferentes estudios se ha reportado el uso de P. methanolica para la expresión de varias proteínas como lignina peroxidasa, que fue expresada en organismos como baculovirus en el cual se obtuvo una baja actividad de la enzima en el medio, y en Aspergillus niger donde se tornó mucho más débil dicha actividad (Aifa et. al., 1999 en Wang et. al., 2004); contrario a esto al ser expresada en P. methanolica se obtuvo un nivel de 100 mg de proteína secretada (Wang et. al., 2004). Según experimentos realizados con el vector pMETα para la expresión de la proteína Lactoferricina bovina en P. methanolica, se obtuvo un nivel de 120 mg por litro; el éxito de la expresión podría contribuir a la producción de gran cantidad de esta proteína de gran importancia en la actividad antimicrobiana (Wang et. al., 2007). La expresión del gen de xylanasa del hongo del rumen N. frontalis, fue realizada en P. pastoris y en P. methanolica, concluyendo que ambos sistemas son óptimos para la expresión de dicha proteína; el resultado obtenido fue de 5400 U/mL y 6200 U/mL respectivamente (Tsai et. al., 2008).

24  

4.9.2 Descripción de sistema de P. methanolica Los genes que codifican para la enzima alcohol oxidasa de P. methanolica son: AUG 1 (gen utilizador de alcohol), el cual es el responsable de la mayor actividad enzimática conteniendo un promotor fuerte AUG1 utilizado para dirigir la expresión de la proteína de interés. El gen AUG2 posee el 83% de similitud con el AUG 1, sin embargo las cepas con este genotipo crecen más lento en metanol. La expresión del gen AUG 1 es inhibida por la dextrosa e inducida por metanol (Pichia methanolica Expression kit, 2009), el promotor AUG 1 tiene la capacidad de producir 2500 mg de proteína secretada por litro (Wang. et al., 2007). En el proceso experimental de expresión de proteínas en P. methanolica, se tienen en cuenta varios factores; en primera instancia el sistema de P. methanolica cuenta con dos vectores de expresión: pMET usado para expresión intracelular y extracelular usando su propia secuencia señal de proteína nativa, y pMETα empleado para expresión de proteínas secretadas. Por otra parte pMET posee un péptido C-terminal que codifica el epítope V5 y una cola tag His hexa Histidinas (6XHIS); por el contrario, el vector pMET-α posee tanto el péptido C-terminal que codifica para el epítope V5 y la cola 6XHIS, así como el N-terminal y el factor α de secreción (figura 3).

Figura 3. Vector pMET-α de P. methanolica. (Pichia methanolica Expression kit, 2009). 25  

El cassette de expresión consiste en el promotor AUG1, el gen de interés, el gen AUG1 TT que permite la transcripción, terminación y poliadenización del mRNA y el gen ADE2 que provee el marcador para el aislamiento de las cepas recombinantes. Al realizar la escisión del cassette que contiene la proteína de interés, ocurre una separación del cuerpo del plásmido y del cassette para aumentar la eficiencia de la transformación (Pichia methanolica Expression kit, 2009). P. methanolica cuenta con dos cepas: PMAD 11 y PMAD 16, ambas poseen alelos ade-, son fenotípicamente ADE- y crecen en medios como YPD o suplementado con adenina YPAD, con el fin de generar cepas trasformantes ade+ con fenotipos Mut+ y Muts; estos dos fenotipos no difieren en tasa de crecimiento a menos que se utilice metanol, con el cual los transformantes Mut+ presentan mayor crecimiento y permiten la selección de colonias. La cepa PMAD16 es utilizada para expresión intracelular y se caracteriza por la prevención de la proteólisis, la cepa PMAD11 es utilizada para la secreción de la proteína y posee la característica de crecer mejor en medio mínimo (Pichia methanolica Expression kit, 2009). P. methanolica utiliza diferentes medios de crecimiento como YPAD (medio de extracto de levadura, peptona, adenina y dextrosa), utilizado para el crecimiento de inóculos de la levadura y células electrocompetentes, medio MD/MM (medio mínimo en dextrosa o metanol), para la siembra de las cepas en medio sólido y expresión de proteínas recombinantes, medio BMDY, para el crecimiento de células transformadas optimizando su expresión, medio BMMY, que induce y optimiza la expresión de proteínas secretadas, y medio BMD/BMM (Mínimo dextrosa o metanol), para la expresión de proteínas secretadas ( Pichia methanolica Expression kit, 2009).

26  

5. METODOLOGÍA 5.1

DISEÑO DE CEBADORES

Los cebadores fueron diseñados teniendo en cuenta la secuencia teórica del gen rv1411, que se encuentra en la base de datos Tuberculist (© Copyright Institut Pasteur, 1999-2004) y realizando análisis acerca de las características funcionales de la proteína codificada por este gen. Los cebadores se diseñaron empleado el software GeneRunner 3.01 (Copyright © 1994 Hastings Software, Inc.), de tal forma que anillaran en las regiones flanqueantes del gen, exceptuando la región que codifica para el péptido señal. La longitud del cebador no debe ser superior a 25 nucleótidos, su temperatura de anillamiento debe encontrarse a 55 ºC y debe ser una región rica en G-C. Se incluyeron secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción al extremo 5’ de cada cebador, teniendo en cuenta las características del sitio de múltiple clonaje del vector pMETα B (Invitrogen, 2009), y las enzimas disponibles en el laboratorio para tal fin. Por otra parte, se analizó la secuencia del vector pMETα B (Invitrogen, 2009) con el fin de revisar el proceso de inserción de la secuencia del gen rv1411, y verificar la conservación del marco de lectura importante para la posterior transcripción del gen.

5.2

AMPLIFICACIÓN DEL GEN rv1411 POR PCR

Se realizó extracción de ADN total a partir de la cepa Mycobacterium tuberculosis H37Rv, mantenida en cultivo por la Fundación Instituto de Inmunología de Colombia (FIDIC), utilizando el kit comercial Ultra Clean ® Microbial DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories, Inc., Carlsbad, CA). Posteriormente se realizó amplificación de la región correspondiente al gen Rv1411 de Mtb H37Rv a través de la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) utilizando TAQXpedite™ PCR System (FAST End-Point) (EPICENTRE ® Biotechnologies, Madison, WI), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los cebadores utilizados correspodieron a rv1411 Directo y rv1411 Reverso. 27  

La reacción fue corrida bajo las siguientes condiciones: Un paso de denaturación inicial a 95ºC por 30 segundos, seguido por 35 ciclos que consisten en: denaturación a 95ºC por 10 segundos, anillamiento a 55ºC por 10 segundos y extensión a 72ºC por 1 minuto; finalmente un ciclo de extensión final a 72ºC por un minuto. Como control negativo de la amplificación se utilizó agua libre de nucleasas en lugar de ADN. Para la visualización de la amplificación se realizó gel de agarosa al 1% teñido con SYBR SafeTM (Invitrogen, Carlsbad, CA) y como marcador de peso molecular se uso Hyper LadderTM II (Bioline, London, UK).

5.3

PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO DE PCR CORRESPONDIENTE AL GEN rv1411 Y LIGACIÓN AL VECTOR pMET α B

Se purificó el producto de PCR utilizando el kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega Corporation, Madison, WI), siguiendo las instrucciones del fabricante y posteriormente se realizó doble digestión con las enzimas de restricción Spe I y EcoR I (NEW ENGLAND BioLabs Inc) con el fin de generar extremos cohesivos tanto en el producto de PCR como en el vector pMET α B (Invitrogen, 2009). Seguido a eso se realizó la ligación del producto de PCR y el vector pMETα B utilizando la enzima T4 DNA Ligase (Promega Corporation, Madison, WI) bajo las siguientes condiciones de reacción: •

5 µL de Buffer T4

•

3 µL de Producto de PCR

•

1µL de vector

•

1 µL de T4 DNA ligase

La reacción fue sometida a las siguientes condiciones de termociclaje: 120 minutos a 20 ºC, y 792 ciclos de 30 segundos a 10 ºC seguido de 30 segundos a 30ºC.

28  

5.4

CLONACIÓN DEL CONSTRUCTO EN E. coli Y SEPARACIÓN DEL CASSETTE DE EXPRESIÓN

Luego de la ligación, el vector fue integrado en células termocompetentes E. coli TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA) utilizando el procedimiento de transformación propuesto por la casa comercial: Inóculos del producto transformado fueron crecidos durante 24 horas en medio sólido Luria Bertani (LB) suplementado con ampicilina, donde se seleccionaron las colonias transformantes, que fueron utilizadas para verificar la presencia del vector con el inserto de interés a través de PCR de colonia, bajo las condiciones descritas para la amplificación del gen. Utilizando como cebadores el Directo del Gen rv1411 y el AUG reverso que anillan en el vector pMET α B, el peso esperando para el producto amplificado fue de 839 pb (Pares de bases), luego las colonias positivas fueron extendidas en una nueva caja con medio LB solido con el fin de aislarlas a través de siembra por agotamiento. Las transformantes positivas para la PCR de colonia fueron crecidas en medio LB líquido y este inóculo fue sometido a extracción de plasmídico utilizando el kit Wizard PCR preps Kit (Promega Corporation, Madison, WI), este procedimiento se realizó por duplicado, una de las muestras fue enviada a secuencia, la segunda fue sometida a digestión enzimática con la enzima AscI (NEW ENGLAND BioLabs Inc) para extraer el cassette de expresión gracias al doble corte enzimático que realiza esta enzima sobre la secuencia del vector pMETα B. Este procedimiento se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones: 20 µl de DNA, 6 µl de Buffer (1X NEBuffer 4), 1,6 µl de enzima AscI y 32,4 µl de agua, la reacción se incubó a 37 ºC por 3 horas y fue inactivada a 65 ºC por 20 minutos. Posteriormente se realizó purificación de la digestión utilizando el kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega Corporation, Madison, WI), y esta fue visualizada en gel de agarosa al 1%, se utilizó Hyper Ladder I (Bioline, London, UK) como marcador de peso molecular. Luego de la verificación, la banda correspondiente al producto de interés fue cortada de un segundo gel que se realizó con agarosa de bajo punto de fusión para facilitar la purificación siguiendo el protocolo recomendado por el kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega Corporation, Madison, WI); seguidamente se envió a secuenciar utilizando los cebadores α-factor y AUG Reverso. 29  

5.5

PREPARACIÓN

DE

CÉLULAS

ELECTROCOMPETENTES

Y

TRANSFORMACIÓN POR ELECTROPORACIÓN  

Cepas PMAD11 fueron plaqueadas en YPAD agar e incubadas de 28-30ºC durante dos días, luego se seleccionó una colonia de color blanco que fue crecida en medio YPAD líquido toda la noche en agitación (250 rpm) de 28 a30ºC. La densidad óptica (OD) del inóculo fue medida hasta alcanzar un valor de 1.04 (Pichia methanolica Expression kit, 2009).  

A continuación se estimularon las células electrocompetentes a través del tratamiento con soluciones estabilizadoras (KD, DTT, STM buffer) de las colonias que crecieron en medio YPAD, para facilitar la permeabilización de la pared de la levadura y soportar el choque eléctrico al que se someterían para permitir la integración del producto al genoma. La electroporación se realizó utilizando el electroporador BTX, Electroporation System ECM® 600 (Genetronics, Inc., Sorrento Valley Road San Diego CA) bajo las condiciones de 500V (voltios), capacitancia 50 μF (micro Faradios), resistencia 8 o 360 ohms. Se seleccionaron las levaduras transformadas plaquéandolas en medio MD durante 4 días; a partir de las colonias crecidas se realizó PCR de colonia bajo las condiciones descritas anteriormente aumentando la temperatura de anillamiento a 60 ºC y utilizando como cebadores α-factor y reverso del gen; para la visualización se realizó gel de agarosa al 1% utilizando marcador de peso molecular Hyper Ladder II (Bioline, London, UK). Las colonias recombinantes fueron crecidas en medio YPD, una parte del inóculo fue utilizada para realizar gliceroles y el volumen restante se utilizó para extraer ADN genómico (ADNg) utilizando el kit Ultra Clean ® Microbial DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories, Inc., Carlsbad, CA). A partir del ADNg se realizó amplificación por PCR bajo las condiciones anteriormente descritas con una temperatura de anillamiento de 58 ºC.

30  

6. RESULTADOS 6.1

DISEÑO DE CEBADORES

Se definieron las secuencias de los cebadores directo y reverso del gen rv1411, y luego se les adicionaron los sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción SpeI, al extremo 5’del primer directo, y EcoRI, al extremo 5’del primer reverso. Rv1411-D: 5'-GGAATTCCAAGCGGCGGACCACTT-3' Rv1411-R: 5'-GACTAGTACCGGGGGCTTCGTGAC-3' Posteriormente se evaluó la inserción del producto de interés en el vector pMETα B (figura 4.).

Figura 4. Sitio de inserción del gen rv1411 en el vector pMETα B. 31  

6.2

AMPLIFICACIÓN DEL GEN rv1411 POR PCR

Se obtuvo una banda a una altura de 620 pb (Pares de bases) usando ADN genómico de Mycobacterium tuberculosis H37Rv como molde y utilizando los primers diseñados para la amplificación de la región correspondiente al gen rv1411. Como control negativo se reemplazo el volumen correspondiente a muestra en una reacción por agua libre de nucleasas (Figura 5).

Figura 5. Amplificación del gen rv1411. (1. Marcador de peso Hyper Ladder II (Bioline, London, UK); 2. Otra proteína evaluada; 3. Amplificación de la región correspondiente al gen rv1411; 4-6. Otras proteínas evaluadas; 7. Control negativo de PCR).

6.3

CLONACIÓN DEL AMPLÍMERO EN E. coli:

Luego de la transformación de E coli TOP10 con el producto de la ligación del gen rv1411al vector pMETα B se obtuvo un producto amplificado de 765 pb a partir de la PCR de colonia (Figura 6).

32  

Figura 6. PCR de colonia para verificar la clonación en E. coli. (1. Marcador de peso Hyper Ladder II (Bioline, London, UK); 2-5. Amplificación para diferentes colonias; 6. Control negativo de PCR). Adicionalmente, fue confirmada la presencia del constructo en las colonias a través secuenciación de las muestras positivas para la PCR de colonia (Figura 7).

Figura 7. Verificación del proceso de clonación en E. coli por secuenciación. 33  

6.4

SEPARACIÓN DEL CASSETTE DE EXPRESIÓN

Luego de la digestión enzimática el producto de la reacción fue visualizado a una altura de 6387 pb, para el caso del cassette de expresión y de 2210 pb, para el resto del vector (Figura 8).

Figura 8. Digestión del DNA plasmídico con la enzima AscI (1. Marcador de peso Hyper Ladder I (Bioline, London, UK); 2-5. Producto de digestión para las cuatro colonias seleccionadas.

6.5

PURIFICACIÓN DEL CASSETTE DE EXPRESIÓN

Luego de la purificación de la banda correspondiente al cassette de expresión se observó una única banda a una altura de 6387 pb (Figura 9).

34  

Figura 9. Purificación del cassette de expresión. (1. Marcador de peso Hyper Ladder I (Bioline, London, UK); 2-5. Bandas correspondientes al cassette de expresión de las colonias seleccionadas).

6.6

TRANSFORMACIÓN

DE

CEPAS

PMAD11

DE

P.

methanolica

POR

ELECTROPORACIÓN: Luego del proceso de electroporación, donde se da la integración del cassette de expresión en genoma de la cepa PMAD11 de P. methanolica, se realizó un primer paso de confirmación mediante PCR de colonia, donde se observaron colonias positivas a una altura de 681 pb (Figura 10).

35  

Figura 10. PCR de colonia a partir de la electroporación de células electrocompetentes. (1. Marcador de peso Hyper Ladder II (Bioline, London, UK); 2-9. Muestras de 8 colonias seleccionadas.

36  

7. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES El estudio de las lipoproteínas de Mtb y la relación de estas moléculas con la activación de la respuesta inmune del hospedero, constituyen una parte fundamental para entender los diferentes factores de virulencia y patogenicidad del bacilo, por lo que resulta importante reconocer sus patrones estructurales y funcionales, que podrían contribuir al desarrollo de estrategias adecuadas para el control de la tuberculosis. Por otra parte, los sistemas de expresión de proteínas recombinantes como P. methanolica, contribuyen a la construcción de proteínas funcionales y estructuralmente estables, de gran utilidad con fines investigativos y posiblemente terapéuticos. De esta manera se propone la clonación del gen rv1411 en E. coli y su posterior integración en el genoma de P. methanolica, como una parte fundamental para la posterior expresión de esta molécula como proteína recombinante, lo cual podría contribuir al desarrollo de estudios encaminados a la postulación de posibles candidatos a una vacuna contra la enfermedad. Investigaciones previas han determinado que Mtb puede regular la función de las células T CD4 a través de los glicolípidos PIM y de las lipoproteínas de pared LpqH, LprA, y LprG, que corresponde a la proteína Rv1411 (Mahon et. al., 2009), la cual está implicada en la inhibición del sistema inmune, incrementando la susceptibilidad de infección de los organismos expuestos a Mtb (Hovav et. al., 2006); esta lipoproteína contiene la señal peptidasa tipo II, la cual es característica del grupo de proteínas intramembranales, que desempeñan un papel importante en la señalización intracelular (Hovav et. al., 2006). La lipoproteína Rv1411 está codificada en un operón donde se transcriben los genes lpgrA, lpgrX y lpgrF, los cuales codifican para otras proteínas también implicadas en la inhibición de la respuesta inmune, y aunque algunos análisis sugieren que esta lipoproteína forma parte de la membrana (Bigi et. al., 2000), recientemente se ha predicho que dicha proteína se encuentra localizada en el periplasma de la pared celular (Drage et. al., 2010). Según la base de datos de referencia Tuberculist (© Copyright Institut Pasteur, 1999-2004) la lipoproteína Rv1411 es probablemente conservada, contiene la secuencia señal en el N-terminal, está posicionada como una lipoproteína de unión en procariotas; y aunque se afirma que su función es desconocida, diferentes estudios han demostrado su implicación en la señalización y modulación de la 37  

respuesta inmune del hospedero (Hovav et. al., 2006, Pieters, 2008, Mahon et. al., 2009, Torrelles et. al., 2010). El gen rv1411 está codificado por una secuencia de 711 pb, que resulta ser diferente a lo encontrado en este trabajo, donde la amplificación del gen generó una banda a 620 pb, esta diferencia está relacionado con el diseño de cebadores, ya que para este paso se omite la región que codifica para el péptido señal de la proteína, debido a que el vector pMETα B contiene el αfactor como secuencia señal para la expresión del gen. De igual manera el vector determina la posterior secreción de la lipoproteína, y se utilizó para la clonación en bacteria como vehículo para introducir el gen de interés en el genoma de la levadura. En este punto resulta determinante ser cuidadoso en el momento del diseño de los cebadores utilizados para la amplificación del gen, y tener en cuenta las características del vector y de la proteína que se pretende expresar. Una primera aproximación para la expresión de la lipoproteína recombinante, es la clonación del gen codificante en la bacteria Escherichia coli, la cual ha sido ampliamente utilizada para clonación de diferentes secuencias de interés, debido a características relacionadas con su biología, como su rápido ciclo reproductivo y su facilidad de manejo en el laboratorio, entre otras, que la han convertido en el hospedero con más aplicaciones en el campo de la biología molecular. Desde 1970 se han utilizado diferentes métodos de transformación en E. coli, que han resultado ser muy eficientes; estos métodos corresponden a choque térmico, transformación química y electroporación (Yoshida et. al., 2009). En este estudio se implementó la transformación por choque térmico y se pudo evidenciar la correcta integración del plásmido en E. coli TOP10, a través de PCR de colonia y confirmación por secuenciación, lo que permite postular que este es un método fácil y adecuado para la clonación de vectores recombinantes. E. coli no se utilizó para la expresión de la proteína Rv1411 debido a que se han encontrado algunas limitaciones relacionadas con la ausencia de modificaciones post-traduccionales y el plegamiento de las proteínas (Narayanan et. al., 2010); dada la importancia de estas características P. methanolica resulta ser un sistema completo para la obtención de proteínas recombinantes con estructural altamente similares a la forma nativa. 38  

La electroporación ha sido descrita para células de mamíferos y hongos, y para el caso de P. methanolica este tipo de transformación se ha reportado como un método eficiente para permeabilización de membrana, permitiendo el paso del cassette de expresión hacia el interior de las cepas PMAD11 utilizadas para este estudio. Hay que destacar que resulta fundamental mantener constante el rango de tiempo y voltaje aplicado, así mismo la capacitancia y la resistencia del pulso, que depende del equipo seleccionado (Transformation In P. methanolica; USA Patent, Raymond et. al); aunque existen métodos químicos eficaces para transformación, en la mayoría de los casos se ha reportado el método de electroporación, obteniendo resultados satisfactorios. Las cepas PMAD11 y PMAD16 son fenotípicamente Ade- y tienen la capacidad de crecer en medios deficientes en adenina, al crecer en un medio suplementado con adenina se pueden generar dos clases de fenotipos Mut+ y Muts; el fenotipo Muts está dado por la aparición de secuencias de replicación autónomas (ARS) las cuales permanecen de forma extracromosómica e inestable, además presentan un crecimiento lento y una coloración rosada que indica la reversión a fenotipo Ade- (Transformation In P. methanolica; USA Patent, Raymond et. al). En este estudio algunas colonias transformadas presentaron una coloración rosada, esto indica que aparecieron fenotipos Muts presentándose reversión; en este caso el cassette de expresión no se integró al genoma de la levadura. El fenotipo Mut+

se integra de manera estable al genoma de la levadura obteniéndose

transformantes estables de crecimiento rápido y de color blanco (Transformation In P. methanolica; USA Patent, Raymond et. al); aunque algunas colonias presentaron reversión, la mayoría de transformantes fueron colonias blancas estables, es decir, el cassette de expresión se integró de forma adecuada en el genoma de la levadura. Si bien, la coloración de las colonias fue un primer indicio de la integración del constructo en la levadura, dicha transformación también se confirmó a través de la amplificación con los cebadores α-factor del vector y reverso del gen rv1411 en la PCR de colonia. Estos resultados constituyen un aporte para continuar el proceso de expresión de la proteína Rv1411; sin embargo se deben tener cuenta variables que pueden afectar la expresión como pH 39  

de los cultivos, concentración de metanol en la inducción, actividad proteolítica de la cepa en caso de utilizar PMAD11, toxicidad de la proteína, entre otras. Además resulta relevante conocer la biología de la levadura y las modificaciones que presentan las dos cepas PMAD11 Y PMAD16, con el fin de obtener una proteína estructural y biológicamente funcional; al utilizar la cepa PMAD11 es recomendable medir su actividad proteolítica para evitar la degradación del producto de interés. Aunque la cepa PMAD16 presenta un crecimiento lento, su uso es recomendable debido a que los genes codificantes de proteasas PEP4 Y PRB1 fueron eliminados a través de mutagenesis dirigida (Transformation In P. methanolica; USA Patent, Raymond et. al), por lo que la expresión de la proteína no se vería afectada por dichas proteasas. Finalmente la utilización del sistema de P. methanolica constituye una herramienta efectiva para la producción altos niveles de proteínas recombinantes, por lo cual es indispensable seguir de manera adecuada los estándares definidos para su óptima producción; el sistema de expresión está compuesto de gran variedad de procedimientos que requieren ser desarrollados bajo óptimas condiciones, para lograr obtener resultados positivos con usos potenciales en diferentes áreas de la ciencia.

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