Facultad de Química, UNAM

1630 Genética y Biología Molecular

Código Genético y Traducción Unidad 7

Dogma Central de la Biología Molecular. Flujo de la Información Genética Replicación

Transcripción. Síntesis de RNA

Traducción Síntesis de Proteínas

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Comparación de la expresión génica entre eucariontes y procariontes Eucariontes

Procariontes

Núcleo

Transcripción Traducción

Transcripción

Traducción

Código genético: DNA

-------Æ

Bases

RNAm

-------Æ

Bases

Proteína

-------Æ

Aminoácidos

En DNA y RNA hay 4 bases pero en proteínas: 20 aminoácidos Combinaciones de bases para determinar un aminoácido: Combinaciones de 2 bases: 42 = 16 (no alcanzan!!) Combinaciones de 3 bases: 43 = 64 !! (ahora sobran!!) Codón: Secuencia de tres bases en el RNAm que especifica un aminoácido en la secuencia de la proteína o causa la terminación de la traducción.

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Nirenberg y Matthaei descifraron el código genético usando un lisado de E. coli para sintetizar proteínas in vitro al cual le agregaban RNAm sintético poli-U, poli-A, poli-CA.....

RNA

Proteína

Solamente 61 de las 64 combinaciones posibles codifican para aminoácidos

Código Genético

61 codones determinan aminoácidos 3 codones son “non-sense” y funcionan como señales de término (stop) de la traducción Segunda posición

Primera posición

18 de los 20 aminoácidos están determinados por más de un codón. El código genético es redundante.

3

Solamente Met y Trp están determinados por un codón. Codones sinónimos: Para muchos aminoácidos determinados por mas de un codón, las 2 primeras bases no varían y solamente hay cambio en la 3a posición. ¿Qué característica común tiene esa 3a base en los aminoácidos determinados por dos codones?

Esta propiedad minimiza los efectos de alguna mutación. Sustitución por transición en el que hay un cambio de una purina por otra purina.

AAG -Æ AAA

El código genético está altamente conservado filogenéticamente. De hecho, por muchos años, se consideró que era UNIVERSAL, hasta que se encontraron las excepciones que son mínimas. La mayor parte de estas excepciones se identificaron en los genomas mitocondriales y en algunos protozuarios. Codón

Código genético

Excepción

Genoma

AGA/ AGG

Arg

Ser

Mitocondria animal

CGG

Arg

Trp

Mitocondria plantas

UAA/ UAG

Término

Glu

Nuclear protozuarios

UGA

Término

Trp

Micoplasma

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Para los aminoácidos determinados por mas de un codón, estos no son usados con la misma frecuencia.

Para los aminoácidos determinados por mas de un codón, estos no son usados con la misma frecuencia.

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En el proceso de traducción participan los RNAt, RNAr y RNAm. Estructura de un RNAm maduro.

UAA UAG

AUG

Codones de término

UGA

Región codificante

Cola de Poli-A

CAP Región 5’ no traducida

Región 3’ no traducida

5’-UTR

3’-UTR

Marco de lectura abierto (Open Reading Frame)

Marco de Lectura 1

La misma secuencia de RNAm. Marco de Lectura 2

Tres secuencias de polipéptidos distintas!!!

Marco de Lectura 3

Solamente uno de los marcos de lectura es el correcto para la traducción. ¿Cómo es reconocido este marco por el aparáto traduccional?

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El codón del RNAm es reconocido por la secuencia anticodón del RNAt

5’

C

G

C

3’

RNAm La interacción ocurre por apareamiento de bases complementarias. Las dos moléculas de RNA son antiparalelas.

Hipótesis del “bamboleo” (wobble) Debido a que el código genético es redundante: • Algunos aminoácidos están determinados por 6 codones • Algunos aminoácidos están determinados por 4 codones • Algunos aminoácidos están determinados por 3 codones • Algunos aminoácidos están determinados por 2 codones

Algunos codones que determinan al mismo aminoácido son reconocidos por el mismo RNAt Esto implica que hay apareamientos de bases tipo Watson-Crick para las dos primeras posiciones del codón, pero no para la tercera.

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Hipótesis del “bamboleo” (wobble) La inosina es una purina que forma interacciones débiles con C, U, A

5’

C

G

I/U C

3’

RNAm Muchos RNAt tienen inosina en la posición 5’ del anticodón

Los RNAt son las moléculas adaptadoras (traductoras) que decodifican la información en el RNAm acarreando al aminoácido correspondiente.

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Estructura Secundaria del RNAt Asa D – Brazo D

* El brazo variable (3- 21 nts) puede formar un tallo de hasta 7 pb. Brazo T. Tallo de 4-5 pb

*

Función de los RNAt

RNAt + Aminoácido --Æ Aminoacil RNAt La reacción ocurre en dos etapas: 1. Activación del aminoácido: Formación del aminoacil adenilato

Aminoácido + ATP Æ Aminoácido-AMP + PPi

R

Se forma el aminoacil adenilato que tiene un enlace de alta energía. La hidrólisis del pirofosfato inorgánico que se produce genera energía para la reacción.

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2. Formación del aminoacil-RNAt

Aminoacil adenilato + RNAt Æ Aminoacil-RNAt + AMP

El aminoácido se une al extremo 3’-OH del RNAt. En el brazo aceptor.

Aminoacil RNAt sintetasas A pesar de que catalizan la misma reacción, estas enzimas pueden ser muy diferentes. Algunas son monómeros, dímeros y tetrámeros. La misma enzima realiza los dos pasos de la reacción. Tiene sitios de unión para: • el aminoácido • ATP • RNAt

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Aminoacil RNAt sintetasas. Reconocen secuencias en la región interna del RNAt. Tienen muy alta especificidad pues distinguen entre 40 RNAt que tienen una estructura similar, solamente con algunos cambios en la secuencia de bases. Reconocen elementos de identidad en el RNAt que incluyen: • Región anticodón • Pares de bases en el tallo aceptor.

La síntesis de proteínas se lleva a cabo en los ribosomas

2.76 x 106 Da El ribosoma procarionte se puede disociar en dos subunidades. Cada una de éstas se compone de RNAr y muchas proteínas

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La estructura de los ribosomas se resolvió por cristalografía de rayos X

Premio Nobel de Química 2009

Estructura de los Ribosomas. Los ribosomas son ribozimas que

1. Decodifican la información genética y 2. Polimerizan los aminoácidos. Aseguran que la síntesis de proteínas ocurra progresivamente y con alta especificidad. Una bacteria en fase exponencial tiene aprox. 105 ribosomas.

Subunidad Pequeña 30S

Lectura de los codones 21 proteínas + RNAr 16S

Subunidad Grande 50S

Polimerización de Aminoácidos 31 proteínas + RNAr 23S y 5S

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Sitio de unión al ribosoma En los RNAm procariontes hay una secuencia altamente conservada que está entre 8 y 13 nts del codón de inicio. Esta secuencia es rica en purinas y el consenso es:

5’-AGGAGGU-3’ Esta secuencia se aparea por interacciones de puentes de hidrógeno con la secuencia 3’-UCCUCCA-5’ que se encuentra en el RNAr 16S de la subunidad pequeña del ribosoma. Se llama Secuencia de Shine-Dalgarno o sitio de unión al ribosoma. Sirve para posicionar de manera correcta al RNAm en el ribosoma con respecto al codón de incio.

El codón que marca el inicio de la traducción es AUG que codifica para el aminoácido metionina

5’- UTR 5’

En procariontes, el codón de inicio AUG codifica para formil metionina:

En eucariontes, el codón de inicio AUG codifica para metionina:

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Formación del complejo de iniciación • Ensamblaje del ribosoma en el RNAm • Se requiere de: – – – – –

Subunidad pequeña del ribosoma Subunidad grande del ribosoma RNAm Aminoacil-RNAt (formil-Met) Factores de iniciación (IF) • IF1 e IF3 => se unen a la subunidad 30S y previenen la unión de 50S en ausencia de RNAm • IF2-GTP ayudan a la unión del aminoacil-RNAt de iniciación

Formación del complejo de Iniciación. Los factores IF1 e IF3 se unen a la subunidad 30S del ribosoma y previenen la unión de la subunidad 50S En procariontes, el codón de inicio es reconocido por un aminoacil-RNAt que acarrea formil-Met

RNAt

El grupo formilo se añade después de la carga del RNAt, por una enzima (transformilasa) que usa formiltetrahidrofolato. Solamente el RNAtf-Met se usa para formar el complejo de iniciación. Todos los demás aminoacil-RNAt requieren que el ribosoma esté completamente ensamblado.

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Formación del complejo de Iniciación.

La unión de AA-RNAt(fMet) al codón de inicio es un proceso dependiente de la hidrólisis de GTP. El IF2 se une a GTP acompaña al AA-RNAtf-Met

Al disociarse IF1, se une la subunidad 50S del ribosoma. Queda formado el complejo de iniciación.

Fase de elongación • Factores de elongación EF – EF-Tu / EF-Ts/ EF-G • Aminoacil-RNAt del resto de los aminoácidos. • GTP • Complejo de Iniciación

La fase de elongación se divide en tres etapas ¾ Ocupación del sitio aminoacil ¾ Formación del enlace peptídico ¾ Translocación

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En el ribosoma se pueden distinguir tres sitios E, P y A, de los cuales el sitio P y A pueden ser ocupados por AA-RNAt Sitio P (Peptidil) del ribosoma

Sitio A (Aminoacil) del ribosoma

El AA-RNAtf-Met ocupa el sitio Peptidil en el ribosoma.

FASE DE ELONGACION Ocupación del sitio Aminoacil por el siguiente AA-RNAt

Thr

EF-Tu

GTP

GDP

5'

AUG

P Sitio P (Peptidil)

ACA

A Sitio A (Aminoacil)

3'

EF-Ts EF-Ts regenera el GTP

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FASE DE ELONGACION Formación del enlace peptídico

Thr

5'

AUG

P

El grupo amino del AA-RNAt del sitio A está bien posicionado para atacar el enlace éster entre el RNAt que ocupa el sitio P y el aminoácido.

ACA

3'

A

Mecanismo de Formación del Enlace Peptídico

El grupo amino del AA-RNAt del sitio A está bien posicionado para atacar el enlace éster entre el RNAt que ocupa el sitio P el aminoácido que acarrea.

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Mecanismo de Formación del Enlace Peptídico

Se forma un intermediario tetraédrico que es estabilizado por la peptidil transferasa.

Intermediario tetraédrico

Mecanismo de Formación del Enlace Peptídico El intermediario se cierra para formar el enlace peptídico y liberar al RNAt que está ocupando el sitio P

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Thr

5'

AUG

P

ACA

3'

A

El sitio P queda vacío.

El centro de peptidil transferasa se encuentra en el RNA ribosomal 23S con participación de algunas proteínas de la subunidad grande del ribosoma. Es una ribozima que acomoda a los sustratos estereoquímicamente para facilitar la formación del enlace peptídico. El centro catalítico responsable de la actividad de la peptidil transferasa se encuentra altamente conservado filogenéticamente.

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El ribosoma provee la estereoquímica adecuada para la formación de un enlace peptídico, así como la guía para la translocación del sitio A al sitio P y los medios geométricos adecuados para la catálisis mediada por el sustrato. El sitio catalítico del ribosoma, llamado CENTRO DE PEPTIDIL TRANSFERASA (CPT) está situado en una región simétrica altamente conservada:

Esta arquitectura le permite al CPT reacomodarse cuando se une el sustrato.

Elongación Translocación

Thr

EF-G

5'

3'

P

A

La translocación es mediada por el factor EF-G, guíado por la hidrólisis de GTP

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Elongación

Thr

Translocación EF-G

5'

3'

P

A

El RNAt que acarrea a la cadena polipeptídica creciente ahora ocupa el sitio P. El sitio A queda desocupado para el siguiente AA-RNAt según el codón que está posicionado en el sitio A.

Terminación.

El ribosoma llega al codón de término del marco de lectura del RNAm Ruptura del enlace éster

Los codones UAA, UAG y UGA no son reconocidos por ningún RNAt

Factor de liberación o de terminación (RF)

UAA (codón de término) “STOP”

RF1=> UAA y UAG / RF2 => UAA y UGA

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El mecanismo que se ha propuesto para la liberación se basa en la semejanza estructural entre un AA-RNAt y los factores de liberación. El factor de liberación se une al sitio A del ribosoma y acarrea una molécula de agua a la región de elongación de la cadena polipeptídica.

H O La actividad de peptidil transferasa emplea esa molécula de agua para romper el enlace éster y liberar al polipéptido.

H

Polisomas. Un solo RNAm puede ser traducido por varios ribosomas de manera simultánea.

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La investigación sobre la estructura de los ribosomas tiene aplicaciones prácticas pues muchos antibióticos tienen actividad sobre la síntesis de proteínas de procariontes. Los antibióticos actúan por mecanismos diversos, pero basados en una estrategia común que es la de coincidir con los centros críticos de la función de los ribosomas. Una de las claves para que un antibiótico sea útil es que se unan con mayor afinidad a los sitios de los ribosomas procariontes.

Varios inhibidores de la síntesis de proteínas se han usado como antibióticos: ANTIBIÓTICO

ACCIÓN

Estreptomicina

Inhibe la iniciación y causa una lectura incorrecta del RNAm (Procariontes)

Tetraciclina

Se une a la subunidad 30S del ribosoma e inhibe la unión del aminoacil-RNAt (Procariontes)

Cloramfenicol

Inhibe a la peptidil transferasa (Procariontes)

Eritromicina

Se une a la subunidad 50S e inhibe la translocación (Procariontes)

Puromicina

Causa terminación prematura de la traducción. Actúa como análogo estructural del aminoacilRNAt

Cicloheximida

Inhibe a la peptidil transferasa (Eucariontes)

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Origen de los ribosomas. (Protoribosoma) Un vestigio de un aparato de RNA con capacidades de ribozima forma parte del ribosoma. Posible existencia de una maquinaria prebiótica a partir de un oligonucleótido que adquirió una estructura secundaria dada y que posiblemente se dimerizó para formar una hendidura química que permitiera la formación del enlace peptídico.

Traducción en Eucariontes.

Los ribosomas en eucariontes son más grandes y están formados por un número mayor de proteínas que los ribosomas procariontes.

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La principal diferencia en la traducción entre procariontes y eucariontes radica en la fase de iniciación. Los RNAm eucariontes carecen de una secuencia consenso de unión al ribosoma (Shine-Dalgarno). Hipótesis del “scanning” o barrido. La subunidad 40S del ribosoma se une al extremo 5’ del RNAm y hace un barrido hasta encontrar el codón AUG. La subunidad 40S Este codón se debe encontrar en el contexto correcto que es:

5’-CCRCCAUGG-3’

En eucariontes hay varios factores de iniciación que se pueden clasificar por su función: eIF6, eIF3, eIF4C que se unen a las subunidades del ribosoma. eIF4(A,B,E,F) que se unen a la estructura del cap en el extremo 5’ del RNAm eIF2, eIF2B que acarrean al AA-RNAt iniciador

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El proceso de elongación es similar a los procariontes y la actividad de peptidil transferasa se encuentra en.... El proceso de terminación es similar al de los procariontes y se reconocen los mismos codones de término:

UAA UAG UGA

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