ç: DONIDYT

COMISIÓN NACIONAL DF IMSTIGACIÓN OFNI1FICAYT(CNOLÓGICA

*** Concurso Nacional de Proyectos FONDECYT 2005 ***

GOBIERNODECHILE

COMPROBANTE DE RECEPCION DE INFORME FINAL NUMERO RESPONSABLE :TOMAS WALTER KLIMUNDA :5273825-3 RUT ETAPA :2007 :FONDECYTREG. TIPO

: 1050068#

DURACION : 3 A-no(s)

TITULO : FERRITINA, UNA POTENCIAL TERCERA VIA DE ABSORCION DE HIERRO: ESTUDIOS CELULARES Y DE BIODISPONIBILIDAD EN HUMANOS. DISCIPLINA :Gl ENFERMEDADES DE LA NUT (MEDICINA Gi)

FECHA RECEPCION :14/03/2008 TIMBRE RECEPCION

Fondecyt FONDO NACIONAL DE DESARROLLO CIENTIFICO Y TFCNOLÓCCO

INFORME FINAL GOBIERNO DE CHILE CONICYT FONDECVT

PROYECTO FONDECYT REGULAR

1050068

3años

2007

NÚMERO PROYECTO

bURACIÓN

TOMÁS WALTER KLIMUNDA

AÑO DE EIECUcIÓN 5.273.825-3

Macul 5540, Macul

9781480

DIRECCION

FONO

[email protected] E-mafl

15/03/08

15/03/05

PERÍODO QUE INFORMA

HASTA

DESDE

CONTENIDO

(MARQUE CON UNA X EL CASILLERO QUE CORRESPONDA) INCLUYE Formulario de Informe Final

NO INCLUYE

X X

Publicaciones Resumen de Tesis Título/Grado

X X

Información acerca de inventos y patentes Otros (especificar) Resúmenes de Congresos

X

Informe Incentivo Coop. Internacional (Si ^ Firma Coinve

dOSçaS.

- ezG'/onzález Marco Tulio N:^

Firma Investigador(a) Responsable

Tomas Walter Klimunda

0—^& Fecha: 15/03/08

CONTENIDO DEL INFORME FINAL I. CUMPLIMIENTO DE LOS OBJETIVOS PLANTEADOS EN EL PROYECTO. Marque con una X el casillero correspondiente. Cumplimiento Objetivos Objetivo A, Estudios celulares. A1.Determinar la eficiencia del paso del Fe inicialmente unido a ferritina desde el medio apical al medio basolateral A2.Determinar la ruta de internalización de Fe ferritínico (Fe-Fn) desde el medio apical: endocitosis de fase fluida; endocitosis mediada por clatrina; endocitosis caveolar.

Total X

X

A3.Determinar el posible destino lisosomal de la ferritina internalizada.

X

A4.Determinar la incorporación del Fe-Fn al pool de hierro labil (LI P)

X

A5.Determinar el posible papel de Iregi en el paso de Fe-Fn al medio basolateral.

X

B. Absorción Fe en humanos: 1131.Realizar estudio de competencia de ferritina marcada con isótopo de hierro contra dosis crecientes de sulfato ferroso 1132.Realizar estudio de competencia de ferritina marcada con isótopo de hierro contra dosis crecientes de hemoglobina 1133.Competencia de ferritina marcada con isótopo de Fe contra dosis crecientes de FeSO4 administrado simultáneamente en cápsulas de liberación entérica.

X

X

X

Parcial

No

Fundamentar el cumplimiento parcial o incumplimiento

134.Efecto del ácido ascórbico sobre la biodisponibilidad del Fe- Fn administrado tanto para ser liberados gástricamente (cápsulas de gelatina) como entéricamente (cápsulas recubiertas).

x

Otro(s) aspecto(s) que Ud. considere importante(s) en la evaluación del cumplimiento de los objetivos planteados en la propuesta original o en las modificaciones autorizadas por los Consejos. Estudios en humanos: Durante el 2007 se planteó un tercer objetivo en estudios humanos no contemplados en el proyecto original con el propósito de complementar los resultados obtenidos. B5.Este consistió en determinar el efecto de una dosis de 10 mg de Fe-ferritina sobre biodisponibilidad de Fe no-hemínico para tratar de demostrar la hipótesis "El Fe-ferritina no competirá por la vía de absorción del Fe no- h em í nico". Estudios celulares: A2.Durante el 2007 se profundizó la caracterización de la endocitosis de ferritina con experimentos de colocalización y microscopía electrónica. Estos estudios están comprendidos en la tesis para optar al título de Magister en Ciencias Biológicas del Sr. Elmer Antileo Ibarra.

II. RESULTADOS OBTENIDOS Describa brevemente los resultados obtenidos en el proyecto en un máximo de cinco páginas, tamaño carta, espacio seguido Para cada uno de los objetivos específicos, describa o resuma los resultados. Relacione las publicaciones y/o manuscritos enviados a publicación con los objetivos específicos. Incluya en anexos, la Información de apoyo que estime pertinente y necesaria para la evaluación. A. ESTUDIOS CELULARES: Objetivo A2: Caracterización de la endocitosis de ferrilina (Fn). Para demostrar la colocalizaclón de Fn con clatrina, se realizó Inmunofluorescencia utilizando Fn marcada con Alexa-0G488 y anticuerpo monoclonal anti-clatnna y como anticuerpo secundario anti-IgG Alexa 543. Las Imágenes muestran que la marca correspondiente a Fn se correlacionó con la señal de clatrina (Fig. la). En secciones ortogonales de los planos X e Y de la zona correspondiente al dominio apical (primeros 5 pm) se observó una extensa zona de colocalizaclón de las señales de Fn y clatrina (Fig. lb). Un aumento muestra distribución de ambas señales predominantemente a nivel de membrana celular apical (Fig. lc). Y Figura 1. Inmuno-colocalización de Fn con vesículas cubiertas por clatrina en células p Incubadas a 4°C. Células Caco-2 fueron . Incubadas con 10 nM de Fn-0G488 por lh a 4°C. a) Corte óptico de 0,3 i.Im en el eje apical-basal de las células. Las gráficas muestran distancia de &.. i.. la línea roja trazada en la imagen versus Intensidad relativa de la señal verde (Fn) y roja (c) (clatrina). b) Secciones ortogonales de los planos X e Y de Imagen mostrada en a. c) Aumento óptico Figura i 2x de la zona delimitada en rojo en las imágenes mostradas en b. Estos resultados fueron correlacionados con observaciones de microscopia electrónica de transmisión (MET), determinando la señal correspondiente a Fn (Fig. 2, zoom 1 y 2), la cual según literatura posee un diámetro entre 9 y 12 nm (Fig. 2, zoom 3). Figura 2. Microfotografía electrónica de una monocapa de células Caco-2. Las células fueron incubadas por 30min a 1 37°C con Fn y posteriormente fueron fijadas por 30min con 50% fijador Karnovsky, se post-fijaron con tetróxido de Osmio Ar (040s) con posterior deshidratación con alcoholes (30, 50,70 ,80 ,90 ,95 ,97 y 100%). Luego las muestras se embebieron - • , r en resma Epon 812. Se realizaron cortes finos de las muestras [ de 60nm aproximadamente. Señal correspondiente a Fn con ------.__ -.-- diámetro entre 9 y 12nm (zoom 1 y 2). Retículo endoplasmático unido a ribosomas con diámetro aproximado entre 20 y 25nm (zoom 3). Figura 2 .1 1• Adicionalmente se determinó la presencia de partículas de Fn al interior de vesículas cubiertas por clatrina (Fig. 3). Figura 3. Determinadón de presencia de Fn en vesículas cubiertas por ciatrina. Formación de una vesícula cubierta por 15. "clatrina típica (zoom 1). Señal correspondiente a la presencia de Fn al interior de vesículas cubiertas por clatrina (zoom 2). Además, se evidenció la presencia de una señal semejante a la correspondiente a Fn en endosomas que en su envoltura aún poseen clatrina (Fig.4, zoom 1) y en compartimentos de doble membrana, posiblemente correspondientes a autofagosomas (Fig.4, zoom 2). Integrando los resultados de Inmunofluorescencia y de MET, estos Figura 3 sugieren que el proceso de endocitosis de Fn exógena involucra la participación de vesículas cubiertas por clatrina.

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Figura 4. Determinación de la presencia de Fn en el endosomas. (a) endosoma apical con cubierta con clatrina que en su Interior llevan Fn y complejos moleculares de Fn (zoomi). (b) endosomas (con Fn) al interior de compartimentos de doble membrana (autofagosomas) (zoom 2).

Figura 4 2. Efecto de estímulos autofágicos en la endocitosis de Fn. Con el fin de poder evaluar la presencia de Fn en compartimentos autofágicos, se realizaron experlmantos de colocaiización de Fn con el marcador para autofagosomas LC3 bajo diferentes condiciones experimentales. 2.1. Condición de cultivo estándar. Células Caco-2 fueron mantenidas en medio de cultivo con 10% suero (condición normal de cultivo). Esta condición es equivalente a poseer una concentración aproximada de 5uM de Fe (Hg. 5). Figura S. Inmuno-colocalización de Fn con compartimentos Y w autofágicos en células en condiciones normales de cultivo (medio de cultivo con 10% suero). a) La gráfica muestra distancia de la línea roja trazada en la imagen versus intensidad relativa de la señal verde (Fn) y roja (autofagosoma, marcador LC3). b) Secciones ortogonales de los planos (c) X e Y de imagen mostrada en a. c) Aumento óptico 2x de la zona delimitada en rojo en Imágenes Figura 5 mostradas en b.

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Las intensidades relativas de fluorescencia mostraron patrones y niveles de intensidades similares en ambos canales a través de la línea trazada en todos los cortes ópticos (Fig.5a). Las secciones ortogonales de los planos X e Y mostraron múltiples zonas de colocalización de las señales de Fn y LC3, distribuidas en mayor proporción en la zona apical, como también en la zona basolateral la célula (Flg.5b y Sc). 2.2. Condición de suplemento elevado de hierro. Con el fin de poder evaluar si la endocitosis de Fn, y su paso por autofagosomas responde a la necesidad de la célula por Fe, se estimularon células con concentraciones de Fe elevado (40 pM). Células Caco-2 fueron estimuladas con 40uM de Fe-NTA (Fe-ácido nitrilo acético) por 14h. Los patrones de Intensidades relativas de fluorescencia mostraron menor Intensidad de la fluorescencia verde, Indicando menor asociación de Fn la membrana apical, tal vez debido a una expresión disminuida de los receptores de Fn bajo condiciones de alto Fe, sin embargo las intensidades relativas de fluorescencia mantienen un patrón similar a través de la línea trazada (fig. 6a). () Figura 6. Inmuno-colocalizaclón de Fn con compartimento@ autofáglcos en células tratadas ••. . con elevadas concentraciones de Fe extracelular (4OuM). a) Comparación de intensidades relativa de fluorescencia de un corte óptico entre una condición estándar y alta concentración de Fe. Las gráficas - muestran distancia de la línea roja trazada en la Imagen versus intensidad relativa de la señal verde (Fn) y roja (autofagosoma, marcador LC3). b) Secciones ortogonales de los planos X e Y de corte óptico en el eje apical-basal de la célula. c) Aumento óptico 2x de la zona delimitada en rojo en imágenes wv mostradas en b. Secciones ortogonales de los planos X e Y mostraron zonas con grado considerable de . colocallzación de las señales de Fn y LC3, distribuidas en zonas apical como basolateral de la célula (Flg.6b y Figura 6 6c).

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2.3. Condición de hambruna. Células Caco-2 se mantuvieron con medio de cultivo sin suero por 14h, esta condición estimula la formación de autofagosomas, por lo tanto se quiso evaluar colocalización de la señal dei marcador LC3 con Fn (Fig. 7).

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Figura 7. Inmuno-colocalización de En con compartimentos autofágicos en células con medio de cultivo sin suero. a) La gráfica muestra distancia de la línea roja trazada en la Imagen versus Intensidad relativa de la señal • verde (Fn) y roja (autofagosoma, marcador LC3). •. b) Secciones ortogonales de los planos X e Y de Imagen mostrada en a. c) Aumento 2x de la zona delimitada en verde en Imágenes mostradas en b.

Figura 7 Los patrones de intensidades relativas de fluorescencia mostraron mayor grado de intensidad del canal rojo (marcador LC3), debido a que en medio sin suero se estimula la expresión de LC3 y la formación de autofagosomas, sin embargo las Intensidades relativas de fluorescencia para cada canal mantuvieron un patrón muy similar a través de la línea trazada (Fig. 7a). Secciones ortogonales de los planos X e Y muestran zonas de colocalizaclón de las señales de Fn y el marcador LC3 (Flg. 7b). Esta colocalización es también aparente en un aumento de una zona en particular (Fig. 7c). 2.4. Condición de Inhibición de la autofagocitosis. En células incubadas con 3-Metil Adenina (3MeA) mostraron un menor grado de Intensidad del canal rojo (LC3), debido a que 3MeA inhibe la expresión de LC3 y la formación de autofagosomas (Fig. 8a). Secciones ortogonales de los planos X e Y mostraron zonas de colocalización de las señales de Fn y el marcador LC3 tanto en la zona apical como basolateral de las células (Fig. 8b y 8c). Figura S. Inmuno-colocallzadón de Fn con compartimentos autofágicos en células . tratadas con Inhibidor de complejos x autofágicos. Células fueron Incubadas con 5mM M 3-Metil Adenina (3MeA). a) La gráfica muestra .. distancia de la línea roja trazada en la Imagen versus intensidad relativa de la señal verde (Fn) y roja (autofagosoma, marcador LC3). b) Secciones • ortogonales de los planos X e Y de imagen mostrada en a. c) Aumento óptico 2x de la zona Figura 8 delimitada en rojo en imágenes mostradas en b. 2.5. Condición de inhibición de la actividad lisosomal. Células Caco-2 fueron estimuladas con lOOuM de Cloroquina por 14h, con el fin de poder inhibir la actividad lisosomal. El análisis de los patrones de Intensidades relativas de fluorescencia muestran un mayor grado de Intensidad del canal verde (Fn), debido a que la presencia del inhibIdor de la actividad Ilsosomal, el cual impide que Fn sea degrada, sin embargo las intensidades relativas de fluorescencia mantienen un patrón muy similar a través de la línea trazada (Fig. 9a). Secciones ortogonales de los planos X e Y muestran zonas parciales con alto grado de colocalización de las señales de Fn y el marcador LC3, debido a que la presencia del inhibidor permite aumentar la cantidad de Fn, y durante más tiempo, en compartimentos autofágicos. Estas zonas se distribuyen tanto en zona apical como basolateral de la célula (Fig. 9b), aumentando estas zonas se observa colocalización señalado en b (Fig. 9c). Figura 9. Inmuno-colocallzadón de Fn con x compartimentos autofágicos en células -. . • tratadas con inhibidor actividad lisosomal. a) •J La gráfica muestra distancia de la línea roja trazada 4I '4 IdII'S i, en la imagen versus Intensidad relativa de la señal verde (Fn) y roja (autofagosoma, marcador LC3). , b) Secciones ortogonales de los planos X e Y de (c imagen mostrada en a. c) Aumento óptico 2x de la Figura 9 zona delimitada en rojo en imágenes mostradas en b. Estos resultados fueron correlacionados con experimentos realizados a nivel de MET, observándose la presencia de Fn en compartimentos de doble membrana similares a los descritos en la literatura y señalados como autofagosomas (Fig. 10, zoom 1 y 2).

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Figura 10. Determinación de la presencia de Fn en putativos compartimentos autofágicos. (a) Compartimentos de doble membrana (autofagosomas) con señal de Fn en su interior (zoom 1). (b) Compartimentos autofágicos con señal de Fn y complejos moleculares de Fn en su Interior (zoom 2). En conclusión, estos datos apoyan un modelo endocítico degradativo, en el que Fn se internaliza a través de compartimentos que contienen clatrina transitando por compartimentos autofágicos antes de ser degradada en lisosomas.

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Objetivo AS. Papel de Iregi en la salida de Fe ferritínico al medio basolateral. Se estudió la salida de 55Fe al medio basolateral de células incubadas desde el medio apical con Fn cargada con 55Fe en presencia del anticuerpo anti-Iregi previamente purificado por cromatografia de afinidad. Se utilizaron condiciones de pre-incubación por 1, 2 y 3 h antes del experimento de transporte de 55Fe. En ninguna de estas condiciones pudimos demostrar la inhibición de la salida de 55Fe al medio basolateral. Como segunda aproximación intentamos la Inhibición de la expresión de Iregi por estrategias de RNA interferente y antisentido, utilizando los constructos pMV-AS-Iregl, y plasmidios conteniendo shRNA de Iregi (SuperArray Inc). Usando ambas estrategias tuvimos el problema de baja eficiencia de transfección (