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CONTENIDO DE LA SESION 05 BIOLOGIA Forense 1.- BUSQUEDA DE INDICIOS BIOLOGICOS Como introducción se enumeraran cuales son los indicios biológicos más frecuentes en los Laboratorios Forenses. La metodología a seguir en la búsqueda vendrá condicionada por las circunstancias particulares de cada caso en concreto; si bien es muy conveniente efectuar una interpretación “in situ” de los indicios antes de manipular nada, ya que una correcta valoración de los mismos exige su estudio dentro del contexto del lugar en que se ha producido el delito. La búsqueda en sí debe de ser minuciosa, ordenada y sistemática, extremando las precauciones para no pasar por alto algún indicio o destruirlo inadvertidamente; siendo muy recomendable seguir los métodos de dividir la escena en cuadrículas, que se irán examinando sucesivamente, o bien en círculos concéntricos, tomando como centro el lugar que consideremos más importante, por ejemplo, la ubicación del cadáver. En cualquier caso, antes de proceder a la recogida, se debe documentar la localización de todos los indicios biológicos que se vayan a recoger mediante esquemas, fotografías o vídeo, lo cual nos podrá servir para poder plantear una hipótesis sobre los hechos. En cuanto a los lugares de búsqueda, vendrán condicionados por las circunstancias particulares de cada caso en concreto. A título de ejemplo, se describirá como se procedería en los casos más comunes (lugar cerrado, abierto, vehículos, víctima y agresor). 2.- RECOGIDA DE INDICIOS BIOLOGICOS Durante el proceso de recogida es muy conveniente adoptar una serie de precauciones que abarcan un doble ámbito: La protección del personal encargado de la recogida y la protección de las muestras (esta última para evitar distintos procesos que puedan afectar a su integridad, fundamentalmente la posible contaminación de las mismas).

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Como complemento a la práctica de la Inspección Ocular, en muchos casos se efectúa la toma de las denominadas muestras de referencia o indubitadas, que serían aquellas de las que sabemos de qué persona proceden (víctima, sospechoso, cadáver) para su cotejo con las evidencias recogidas en el lugar del delito (muestras dubitadas).

En lo referente a la recogida de indicios biológicos en el lugar de los hechos, se enumerarán las normas básicas a seguir para efectuar una correcta recogida de los indicios, con ejemplos de la casuística mas frecuente (manchas en soportes pequeños y de fácil transporte, en soportes no transportables, soportes absorbentes y no absorbentes, indicios húmedos, líquidos, pelos, etc.) 3.- EL LEVANTAMIENTO DEL CADÁVER Se trata de una actuación judicial por la que se constituye en el lugar de los hechos la Comisión Judicial, formados por el Juez, el Secretario, el Médico Forense y el Perito Judicial. Una vez practicada, el Juez ordena el LEVANTAMIENTO DEL CADÁVER y su traslado al lugar donde vaya a realizarse la autopsia. La diligencia de inspección ocular y levantamiento del cadáver es de extraordinario interés médico forense ya que como dice el profesor Gisbert un examen a la ligera del cadáver en el lugar de los hechos puede invalidar y hacer ineficaz la más minuciosa y perfecta de las autopsias. En primer lugar, se trata de proceder al examen del cuerpo para comprobar la realidad de la muerte, el momento estimado del fallecimiento y el posible origen (natural o violento) de la misma. A continuación habrá que recoger aquellos datos e indicios que nos permitan la posibilidad de reconstruir los hechos, una aproximación a la causa, circunstancias de la muerte y la posible intervención de terceros. Para ello se tomará nota de los siguientes datos: posición del cuerpo y relaciones con el entorno, examen somero de las ropas, apreciación de lesiones de forma general, búsqueda y recogida de indicios biológicos y no biológicos y cualquier otra circunstancia de interés. Es fundamental apoyar la recogida de estos elementos con croquis, esquemas, fotografías o videos. 2

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Ciñéndonos al tema que nos ocupa es evidente que en el estudio biológico forense de un determinado caso nosotros somos el primer eslabón de la cadena. De nada sirve un extraordinario laboratorio, con los mejores recursos humanos y materiales, sí el médico forense no sabe que indicios buscar, como los tiene que recoger, conservar, enviar y que tiene que solicitar al laboratorio. VESTIGIOS DE INTERÉS MÉDICO LEGAL BIOLÓGICOS NO BIOLÓGICOS - Sangre - Ropas - Semen - Balas, tacos, perdigones - Restos - Fibras diversas. - Tejidos - Restos de pintura - Uñas - Fragmentos de vidrio - Mordeduras / saliva - Tierra -Otros - Otros

CONSERVACIÓN DE LOS VESTIGIOS A.- DURANTE EL TRASLADO - Evitar pérdidas y contaminaciones. - Proteger las manos - Envolver el cuerpo. B.- EN EL DEPÓSITO - Mínima manipulación. - No retirar envoltorio. - No desnudar ni lavar. - No obtener la necrorreseña. RECUPERACIÓN DE LOS VESTIGIOS I.- EXAMEN CUIDADOSO DEL CUERPO - Búsqueda de elementos adheridos en ropa / piel. - Toma de muestras de sangre. - Toma de muestras de uñas - Toma de muestra de boca / ano / vagina. 3

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II.- RECOGIDA DE VESTIGIOS BIOLÓGICOS III.- RECOGIDA DE VESTIGIOS NO BIOLÓGICOS RECONOCIMIENTO Y RECOGIDA DE MUESTRAS DEL POSIBLE AUTOR INSPECCIÓN GENERAL. Encaminada a la búsqueda de lesiones o signos de lucha o defensa, que puedan orientarse hacia su participación en los hechos. RECOGIDAS DE INDICIOS. -

Ropas que llevaba en el momento de la agresión. Muestras de pelos: cabellos, barba, bigote, vello púbico... Muestras de sangre y/o saliva. Hisopo lavado de glande.

OTROS PROBLEMAS MÉDICO LEGALES QUE NOS PUEDE RESOLVER LA BIOLOGÍA FORENSE

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INVESTIGACIÓN BIOLÓGICA DEL PARENTESCO − INDIVIDUALIZACIÓN DE RESTOS HUMANOS. − IDENTIFICACIÓN DE RESTOS ÓSEOS. − ESTUDIO BIOLÓGICOS DE LA MUERTE POR SUMERSIÓN. Si nos dejásemos llevar por nuestra imaginación, uno pensaría que no hay nada imposible para un laboratorio de biología, en este caso forense, y esto es porque la visión que la sociedad recibe de la biología moderna suele ser a menudo una simplificación llena de falsedades procedentes del sensacionalismo periodístico y de la ciencia-ficción. A pesar de los avances tecnológicos, aún quedan cuestiones por resolver, tales como la data exacta de una mancha, por ejemplo. Los tipos de estudios solicitados más frecuentemente en un laboratorio de biología forense son: Estudios de filiación: el caso más simple sería la investigación biológica de la paternidad o maternidad en un trío hijo-madre-padre o bien contando únicamente con el progenitor cuestionado y el hijo. Las complicaciones aparecen cuando no es posible contar con el progenitor cuestionado por 4

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fallecimiento, siendo necesario en tal caso recurrir al análisis de otras muestras biológicas del fallecido, al análisis de familiares directos de éste que permitan reconstruir su genotipo o incluso a la exhumación del cadáver. Estudios de identificación de restos cadavéricos: se realiza mediante el análisis biológico de maternidad o paternidad o en su defecto análisis de otros familiares que compartan la línea materna o paterna. También puede recurrirse al análisis de otras muestras biológicas del fallecido o de objetos personales del mismo. Identificación de indicios biológicos de interés criminal: son el tipo de análisis más solicitado en el laboratorio de biología forense. Todos los indicios recogidos sobre la víctima, el sospechoso o el lugar de los hechos deben ser objeto de un minucioso y exhaustivo estudio que permita localizar, conocer o confirmar la naturaleza de los indicios, que variaran en función de las características del suceso investigado. Los vestigios biológicos más frecuentes son los restos de sangre, fluidos seminales, fluidos vaginales, saliva, pelos y restos orgánicos en uñas. Otro tipo de restos biológicos menos frecuentes son la orina, las heces, la caspa, las uñas... . En el próximo tema de este curso tendremos ocasión de conocer en detalle cuales son los métodos de detección de estos indicios en función de sus características, los tipos de soporte más frecuentes sobre los que se encuentran así como sus posibilidades de individualización.

Identificación de especie: determinados restos hallados casualmente pueden ser indicios de hechos delictivos que puedan ser causa para abrir una investigación. La solicitud de identificación de especie suele ir frecuentemente ligada al hallazgo de restos óseos muy fragmentados o cualquier otro resto orgánico del que pueda sospecharse un origen humano. Estudios complementarios en casos de muerte por sumersión-asfixia: siempre que se recupera un cadáver del agua o cuando se sospecha que la causa de la muerte puede haber sido la sumersión, será necesario confirmar los datos macroscópicos obtenidos en la autopsia mediante estudio anatomopatológico y considerar otros datos tales como la existencia de hidremia ( hemodilución de la sangre del ventrículo izquierdo respecto de la del derecho) y la existencia de elementos formes en las vísceras del cadáver que deben compararse, siempre que sea posible, con las del líquido de sumersión. Estudios bioquímicos en casos de muertes súbitas e intoxicaciones: En casos de shock anafiláctico, los marcadores biológicos que se investigan son la 5

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histamina, la triptasa y la IgE total y la específica. En casos de muerte súbita interesa la determinación de glucosa, urea, creatinina y cloruros. En casos de intoxicación por organofosforados y carbamatos se procederá a la determinación de acetilcolinesterasas y/o pseudocolinesterasas. Identificación de setas y plantas superiores en casos de intoxicación: cuando se sospecha una intoxicación debida a setas o plantas tóxicas es necesario la identificación del elemento tóxico para confirmar si es el responsable de los síntomas observados. La confirmación del origen de la intoxicación servirá para adecuar el tratamiento médico al tóxico concreto en función de su naturaleza. A tal fin, deben enviarse al laboratorio los especimenes completos responsables de la intoxicación, si se cuenta con ellos, o restos cocinados o de contenido gástrico. Es posible identificar restos de setas en contenido gástrico o en otras muestras utilizando técnicas de ADN, como veremos a lo largo de este curso. Estudios microbiológicos en muestras postmortem en casos de etiología no aclarada: en el caso concreto del INTCF se realizan únicamente en el Departamento de Madrid y su finalidad es intentar arrojar algo de luz en aquellos casos de muertes de etiología desconocida en los que se sospeche un origen infeccioso. Si durante el curso de la investigación se detecta algún patógeno de reconocida alarma social tal como el meningococo, en colaboración con otros centros de referencia se procederá a informar a la consejería de salud correspondiente y a la puesta en marcha de los dispositivos de control epidemiológico.

Estudio del contenido gástrico: en algunos casos, conocer el estado de la digestión así como la naturaleza de la última comida puede aportar datos en una investigación. A menudo, la integridad de los fragmentos de alimento hallados en un contenido gástrico podría indicar un período corto de digestión, sin embargo, este dato no puede correlacionarse con una ingesta inmediata al momento de la muerte ya que pueden confluir muchos factores que hacen esta correlación muy inexacta. Los estados emocionales del individuo así como la propia naturaleza de los alimentos influyen en el tiempo de digestión y permanencia de los alimentos en el estómago. IDENTIFICACIÓN DE INDICIOS

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Los tipos de indicios más comúnmente estudiados en el laboratorio de biología forense son los restos de sangre, semen, fluidos vaginales, saliva y pelos, que se presentan sobre una amplia variedad de soportes. Casi todos tienen en común que son escasos, están degradados o contaminados y son únicos e irrepetibles. La localización de una determinada evidencia de asiste a menudo con el uso de una fuente de luz forense que nos permite la utilización de diversas longitudes de onda y diversos filtros para detectar la fluorescencia típica de los fluidos orgánicos. En nuestro laboratorio contamos con una de estas fuentes (MCS-400 de Spex Forensics) basadas en el uso de distintos filtros, que han ido reemplazando a las fuentes laser por sus ventajas en el campo forense. Tras ser localizado, realizaremos una serie de pruebas preliminares, específicas para cada tipo de indicio, con las que estableceremos el diagnóstico de orientación o de certeza sobre la naturaleza del indicio. Sangre: es un tipo de indicio fácilmente reconocible sobre determinados soportes. Existe una amplia variedad de tests de diagnóstico previo que ponen de relieve su presencia (luminol, benzidina, fenolftaleina, o-toloidina, guayacol, verde leucomalaquita...). Los tipos de soporte más comunes sobre los que se presenta son ropas, armas, uñas, en el lugar de los hechos (tierra, suelo, piedras, paredes..). El estudio de la morfología de las manchas en la escena del delito proporciona información a cerca de cómo se produjeron los hechos. Semen: el principal componente celular del semen es el espermatozoide, célula especializada flagelada que suele medir entre 50 y 55 μm, distinguiéndose básicamente dos partes: cabeza y cola. Su número puede variar entre 50 x 106 y 150 x 106 por mililitro de eyaculado, con una media de unos 100 x 106/ml en individuos normospermos. El volumen de eyaculado también varía entre unos 2 ml y 6 ml con un valor medio de unos 3,5 ml. Existe una gran variabilidad en estos datos no sólo entre individuos, sino también dentro del mismo individuo según la edad o entre distintos eyaculados. Además de los espermatozoides, en el semen podemos encontrar otros elementos formes tales como leucocitos y células epiteliales del tracto urinario aunque en número mucho menor. Así, si en un individuo normospermo podemos esperar unos 450 μg de ADN/ml de eyaculado, en un individuo azoospérmico esperaremos unos 30 μg, esto es, sólo un 6,3% del normal. Otros rasgos característicos del semen son su pH básico (8,3) y su capacidad de fluorescer en la región visible del espectro cuando es irradiado con luz ultravioleta. La presencia característica de altas concentraciones de fosfatasa 7

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ácida y de una proteína específica (proteína P30 ó PSA) serán rasgos que se utilicen en el diagnóstico previo ( test presuntivos) en la investigación de restos de semen. Las técnicas de confirmación implican la observación de espermatozoides en preparaciones microscópicas realizadas a partir de las muestras a analizar. Fluidos vaginales: las células del epitelio vaginal sintetizan glucógeno bajo la acción de los estrógenos. La identificación de estos restos se basa en esta particularidad (Reacción de PAS (+) Periodic Acid-Schiff) así como en la presencia de flora bacteriana característica (bacilos de Döderlein). Sin embargo, este carácter glucogenogénico está ausente en mujeres amenárquicas (aunque las terapias con estrógenos pueden afectar esto) y sufre variaciones durante el ciclo menstrual, alcanzándose los niveles más altos de glucógeno durante la ovulación. Estas células no son exclusivas del epitelio vaginal ya que se encuentran también en menor cantidad en la boca y en el tracto uretral de hombres (en concreto en la fosa navicular). Por tanto, el hallazgo de unas pocas células puede ser comprometido, hecho que se da a veces cuando se solicita la localización de células procedentes del epitelio vaginal en un hisopo penil. Saliva: a menudo estos restos se hallan en cantidades mínimas, por lo que es comprometido decidir entre la identificación del tipo de vestigio o la obtención del perfil de ADN. Los humanos producimos entre 1 y 1,5 litros de saliva al día y, acompañando a la saliva, se encuentran las células descamadas del epitelio bucal que serán el sustrato para la extracción de ADN en estos restos. Las pruebas de orientación se basan en la detección de actividad alfa-amilasa. Esta enzima no es específica de la saliva, se encuentra también en el páncreas, en el sudor, en la leche materna, en el semen y en los fluidos vaginales. Puede considerarse un buen marcador para la presencia de saliva ya que sus niveles son 50 veces más altos en saliva que en el resto de fluidos orgánicos. Las amilasas se encuentran también en animales (tipo alfaamilasas) y en plantas (tipo beta-amilasas). Para la confirmación de presencia de restos de saliva deberán observarse células del epitelio bucal en los extractos de las muestras. Los soportes más comunes son colillas, sellos, sobres, mordazas, mordeduras, manchas en ropas, chicles, vasos... . TRICOLOGIA. Estudio y tratamiento del pelo sus características y fenómenos. Pelos: en los mamíferos, el pelo atraviesa tres fases en su ciclo de crecimiento, anágena, catágena y telógena. La fase anágena es la fase de crecimiento activo del pelo, en ella las células del folículo se multiplican por mitosis y forman el pelo al queratinizarse completamente.

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Un cabello humano crece a un ritmo aproximado de 0.35 mm por día. La fase catágena es una transición entre el estado de crecimiento activo y el estado de no crecimiento. En la fase telógena, ha cesado la actividad del folículo. Una cabeza humana tiene aproximadamente entre 100.000 y 150.000 folículos pilosos, de los cuales entre el 80 y el 90% estarán en fase anágena y entre el 10 y el 20% en fase catágena o telógena. En nuestra actividad diaria, los humanos perdemos entre 50 y 100 pelos. A menudo un perito es consultado sobre la cuestión de sí un determinado pelo hallado en la escena de un crimen puede haber sido arrancado o simplemente cayó allí. Si el pelo fue arrancado por la fuerza muy probablemente quedará tejido folicular adherido a la base del pelo, sin embargo es posible arrancar pelos que estuviesen en fase telógena o que no cuenten con ningún tejido adherido a la base. Por tanto, la ausencia de tejido folicular no prueba necesariamente que el pelo fuese caído y no arrancado. A diferencia de los cabellos, los pelos púbicos pasan más tiempo en fase telógena que en anágena. La mayoría de los pelos que encontraremos en casos de agresión sexual serán telógenos. De entre todas las evidencias, los pelos son los más susceptibles de transferencias secundarias. Restos en uñas: una excoriación leve en la piel, cuyas señales desaparezcan a las 24 horas, puede dejar restos epidérmicos en las uñas suficientes para obtener un perfil de ADN por PCR. Un estudio realizado entre voluntarios que se produjeron excoriaciones leves y superficiales que desaparecieron dentro de las 24 horas posteriores al experimento concluyó que: los dedos índice y medio producen los arañazos más largos y profundos; a igual fuerza aplicada, en los arañazos sobre regiones de piel más suave tales como el cuello o zona superior del brazo se recuperaron restos epidérmicos pero no así en zonas de piel muy curtidas como el antebrazo; se encontró una correlación entre la fuerza aplicada y la cantidad de ADN recuperado. Otros tipos de indicios menos frecuentes en el laboratorio: a veces se solicita al laboratorio el análisis de restos que, aunque no son habituales, pueden aportar datos importantes a la investigación de un caso determinado. Entre estos restos podemos citar: Restos de orina: La identificación de la orina se basa en la detección de iones o compuestos orgánicos que se hallan más concentrados en orina que en otros fluidos fisiológicos, tales como la urea o creatinina, también presentes en sudor, sangre, saliva, semen... pero en menor concentración. Contiene células

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epiteliales del tracto urinario, así como leucocitos y eritrocitos, muy diluidas en la orina, por lo que la esperanza de recuperar ADN a partir de manchas de orina es muy baja. Además, la flora bacteriana propia de la orina acelera los procesos de degradación en la muestra. Heces: La identificación de restos fecales se basa en la presencia de pigmentos biliares y de restos alimenticios no digeridos. Son un pésimo sustrato para la extracción de ADN. No es posible el estudio de ADN nuclear en estos restos debido a la extrema degradación y a su contaminación natural (aproximadamente la tercera parte del peso seco de las heces son bacterias). Sin embargo, si se han conseguido resultados en ADN mitocondrial, en concreto la región HV1, partiendo de 10 mg de heces frescas. Otros restos también analizados en el laboratorio son secreciones nasales, uñas, restos de tejido, caspa... TECNOLOGÍA DEL ADN EN EL PROCESADO DE MUESTRAS FORENSES De todas las partes que comprende una investigación criminal, ésta que a continuación desarrollaremos, pondrá de manifiesto la capacidad pericial y profesional del laboratorio de biología forense. De forma general y una vez que tenemos seleccionadas las muestras objeto de análisis, todo el proceso analítico se puede dividir en tres grandes bloques: EXTRACCIÓN de ADN, AMPLIFICACIÓN (PCR) y DETECCIÓN. Extracción de ADN Posiblemente, de los tres bloques citados anteriormente, la extracción constituya el paso más crítico, ya que cualquier manipulación errónea de la muestra en esta etapa inicial del proceso puede conducirnos a su descarte, siendo en algunos casos, el único indicio biológico de que se dispone para resolver un delito. Cualquier laboratorio forense debe contar con diferentes métodos de extracción que permitan obtener en cantidad y calidad suficiente ADN de la enorme variabilidad muestral que recibe. Los métodos de extracción se pueden dividir en tres grupos: a) Aquel que comprende una digestión, una extracción orgánica y una purificación-concentración o, como alternativa, una precipitación con etanol. Se utiliza para la mayoría de las muestras biológicas de interés forense. b) Aquel que comprende una etapa de digestión seguida de una precipitación con etanol. Se usa, principalmente, para obtener mucha cantidad de ADN a partir de sangre en buen estado. 10

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c) Aquel que comprende solo una extracción directa mediante membranas especiales o bolas de sílice o similares. Su uso se limita normalmente a muestras de sangre líquida. Centrándonos en el primer método de extracción, y en concreto en la digestión lo que se consigue con ella es romper toda la estructura celular, es decir, se alteran todos los sistemas membranosos de la célula así como todas las estructuras en las que estén implicadas proteínas (nucleosomas, citoesqueleto celular, etc.), dejando el ADN libre. Para ello, se utiliza un tampón de lisis con detergente (SDS) para solubilizar los lípidos y una enzima proteolítica (Proteinasa K) para lisar las proteínas. Una vez que se encuentran todos los componentes celulares libres entre sí, pasamos al proceso de extracción propiamente dicho, donde se recuperará el ADN de todo ese “caldo molecular”. El método más extendido de todos es el de extracción orgánica con fenol cloroformo isoamílico (FCI). Al mezclar esta solución de FCI con el lisado celular obtenido de la etapa de digestión se genera una emulsión, que después de un centrifugado, permitirá separar el ADN de todo el material celular, aunque a veces junto con el ADN se separen otras moléculas que ser una fuente potencial de inhibidotes para el proceso de amplificación. Seguidamente, se añade N-butanol para eliminar los posibles restos de fenol que pudieran haber quedado en la solución acuosa. A continuación, esta solución acuosa se pasa por unidades de microfiltración-purificación para obtener un ADN lo más “limpio” posible, óptimo para el proceso de amplificación. Alternativamente a esta última etapa podremos llevar a cabo una precipitación con etanol. Como ejemplo de métodos de extracción directa expondremos la extracción con Chelex y con columnas GFx, entre otros. Por último, realizaremos un recorrido por los distintos tipos de muestras que llegan al laboratorio y por los métodos de extracción que se aconseja aplicar en cada caso. Además, se abordará brevemente la cuantificación del ADN humano y sus diferentes métodos. Amplificación de ADN Sin lugar a dudas, posiblemente el desarrollo de esta tecnología de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y su aplicación a la biología molecular ha 11

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permitido que este campo de la ciencia se haya desarrollado a un ritmo espectacular. El proceso en sí mismo es muy sencillo; utilizando solo unos cuantos “ingredientes” se puede multiplicar (en millones de copias) cualquier fragmento de ADN que queramos. Desde el punto de vista molecular se requiere exclusivamente dNTPs, Cl2Mg, cebadores, polimerasa termorresistente, agua y el molde de ADN que se quiera multiplicar. El proceso de amplificación se puede dividir en tres etapas: a) Desnaturalización del ADN a 95ºC b) Annealing o unión de los cebadores al molde de ADN c) Extensión, es decir, la polimerasa empieza a fabricar la nueva cadena de ADN. Como requerimiento instrumental se necesitará un Termociclador. En definitiva, la PCR constituye un método fiable, sencillo, rápido y económico. Sistemas de detección de ADN Hace unos años, la gran mayoría de los laboratorios de genética molecular utilizaba como principal sistema de detección, geles de poliacrilamida seguidos de una tinción con plata. Sin embargo, con el desarrollo de los secuenciadores automáticos, que combinan química y fluorescencia tanto en su formato de gel como de capilar, no solo se ha mejorado en gran medida la calidad y la rapidez en la detección de un producto amplificado, sino que además ha permitido incluso analizar simultáneamente fragmentos de ADN del mismo peso molecular. Dentro de los secuenciadores automáticos parece que ha tomado ventaja en el mercado el de capilar respecto al de gel entre otras razones porque requiere una menor manipulación de la muestra y permite reanalizarla sin tener que volver a prepararla. En la actualidad existen varios modelos de secuenciadores del formato de capilar: uno, cuatro, dieciséis y noventa y seis capilares.

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