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CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN (SEC)
• PORATH - 1957 – Cromatografía Filtración Gel - GFC Disolvente - agua - Muestras – Solubles en agua-Biopolímeros - Empaque - Suave, Gel Hidrofílica (Sephadex) -
• MOORE - 1962 – Cromatografía Permeación en Gel - GPC Disolventes - THF, Decalina, Tolueno - Muestras – Polímeros Orgánicos - Empaque – Poliestireno entrecruzado (Styragel) -
GFC, GPC IDÉNTICO MECANISMO HPLC 7 10/96
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CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN (SEC)
• SEC caracterización de polímeros (PM 1000 a 1 millón)
• Resinas orgánicas (GPC) o bio-moléculas (GFC)---cadenas de moléculas pequeñas
• Las cadenas de distintos largos y formas • Se puede calcular el peso molecular y su distribución
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COMPARACIONES
• GPC vs LSC o Fase Reversa • GPC separa moléculas basada en su tamaño en disolución
• Tamaño en disolución depende de PM y otros factores (disolvente, temperatura, etc.)
• La moléculas más grandes eluyen primero las más pequeñas al final
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VENTAJAS DE SEC
•
Trabaja con altos PM y tiene tiempos de corrida cortos
•
Tiempos de separación y orden de elución fácilmente predecibles
•
No existen pérdidas o reacciónes en la columna
•
Desarrollo de métodos relativamente simple, sin gradientes HPLC 7 10/96
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GPC DE GOMA DE MASCAR GPC
CHICLE
Ablandador
Sabor
Estabilizador
COMPONENTES
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PROBLEMAS EN SEC
•
Limitada capacidad de pico (baja resolución)
•
No puede resolver compuestos de tamaño similar (isómeros)
•
Se requiere de una diferente estrategia de optimización
•
Debe poder disolver al polímero
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MECANISMO DE SEPARACIÓN • Las moléculas más pequeñas penetran en los poros más pequeños y se retienen más
• Las moléculas mayores son EXCLUIDAS
• La separación en función del VOLUMEN HIDRODINÁMICO y no el PM
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CROMATOGRAMA DE EXCLUSIÓN Respuesta del detector
V0
VR Volumen interno
Volumen muerto grande
pequeño
.
Inyección
Volumen de elución [ml]
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CURVA DE CALIBRACIÓN EXCLUSIÓN TOTAL
6
.
PE
RM
5
EA
log
CI ÓN
PM
SE
LE C
4
TI VA
3 PERMEACIÓN Vo
Vi
TOTAL
2 0
10
20 Volumen de elución
30
40
[ml] HPLC 7 10/96
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CURVAS DE CALIBRACIÓN PARA VARIAS COLUMNAS PS-DVB POLYSTYRENE MOLECULAR WEIGHT
107
106
10 6 Å 10 5 Å
105 10 4 Å
104
1000 Å 500 Å
MIXED BED
100 Å
103
50 Å
102
4
5
6
7
8
9
10
E LUT ION VOL UME [m in p er 30 cm ] HPLC 7 10/96
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DESARROLLO DE MÉTODOS
• Seleccione un buen disolvente (consulte la literatura)
• Escoja el tamaño de poro adecuado • Corra estándares; desarrolle una curva de calibración
• Inyecte una disolución diluída (~1%) HPLC 7 10/96
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DISOLVENTES PARA GPC •Deben disolver al polímero •Compatible con el empaque y
•Baja viscosidad •Toxicidad, costo, punto de
detector
ebullición
SOLVENT THF
Viscosity UV cutoff BP [20°C, cP] [nm] [°C]
Flash Pt. Toxicity [°C]
0.55
220
66
14
Slight
m-Cresol
20.8
302
203
94
Moderat
Toluene
0.59
285
111
4
Moderat
Dichloromethane0.44
233
40
None
Severe
Synder and Kirkland, Introduction To Modern Liquid Chromatography , 2nd ed., (1979) HPLC 7 10/96
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PAPEL DE LA FASE MÓVIL DISOLVENTE A: Polímero completamente solvatado
DISOLVENTE B: Sin solvatar
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SELECCIONANDO COLUMNAS GPC PORES SIZES
MW RANGE (polystyrene)
50 Å
< 1,000
100 Å
< 4,000
500 Å
500 - 2 x10
1000 Å
1000 - 4 x10
4 4
10
4
Å
4 x 10
3
- 4 x10
5
10
5
Å
4 x 10
4
- 4 x10
6
10
6
Å
4 x 10
5
- 4 x10
7
Mixed Bed
500 - 10
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REQUERIMIENTOS DE HARDWARE
• •
BOMBA – un control preciso de flujo, esencial
•
COLUMNA – empaque estable (no cambie disolventes), control de temperatura
•
DETECCIÓN – No-destructivo (trabajo prep.), amplio intervalo lineal
•
OBTENCIÓN DE DATOS - computarizado, cálculos automáticos de Mn, Mw, etc.
INYECTOR – mejor automuestreador (10100µl)
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PREPARACIÓN DE MUESTRA
•Seleccione un buen disolvente, caliente si es necesario
•Prepare una disolución diluída (~1%) PM1Millón ~0.01%
•Siempre filtre (¡No guarda-columnas!) HPLC 7 10/96
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DETECTORES PARA SEC ÍNDICE DE REFRACCIÓN:
• Respuesta universal • Sensibilidad moderada • Mala temp. y estabilidad de flujo
UV/VISIBLE:
• Buena estabilidad, muchos polímeros no tienen cromóforos
LASER DE LUZ DISPERSA DE ÁNGULO BAJO:• da valores para M n, M w (LALLS)
• resultados de PM ABSOLUTO, ya que se mide el volumen hidrodinámico
VISCOMETRÍA DIFERENCIAL:• Volumen hidrodinámico = Visc. M n • Útil para calibración universal, da M n, M w viscosidad intrínseca DETECTORES EVAPORATIVOS DE MASA:• Universal, da masa, igual respuesta HPLC 7 10/96
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APLICACIONES DE GPC
•
Separaciones de polímeros de alto peso molecular
•
Caracterización de polímeros: Mn, Mw, Mz, polidispersión
•
Limpieza de muestra: Remueve materiales de alto PM
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APLICACIONES DE GPC CONTROL DE CALIDAD RÁPIDO 6
Buen polímero
log PM
5
4
Mal polímero
.
3
2 0
10
20
30
40
Volumen de elución [m l] HPLC 7 10/96
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SEPARACIÓN DE ADITIVOS DE POLÍMEROS 7 3
1
Muestra: 1. Irganox 1010 2. DSTDP 3. Irganox 1076 4. Estearamide 5. Desconocido 6. Tinuvin 327 7. BHT
Columna: G2000 H8
6
7.5 mm ID x 60 cm x 2
Eluente: Tetrahidrofurano Flujo: 1.6 ml/min Caida Presión : 54 kg/cm2 Detector: RI Temp.: Ambiente
2
4 5
15
20
25
30
35
Tiempo de elución [min] HPLC 7 10/96
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GPC DE ALTA RESOLUCIÓN C36
C28
C32 C22
MUESTRA:
n-Parafinas
COLUMNA:
SHODEX a-802 x 4, 2m
ELUENTE:
THF
FLUJO:
1 ml/min
PRESIÓN:
48 kg/cm2
C24
C20 C18 C16
C13 C12 C14
DETECTOR: IR
C11
C9
30
40
50
60
C8
70
min
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PROPIEDADES FÍSICAS
• Número
PM promedio
cristalinidad, flujo, compresión
• Peso
PM promedio
fuerza (tensil, impacto) resistencia
•z
PM promedio
elongación, flexibilidad
• Z+1
PM promedio
“die swell” HPLC 7 10/96
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VARIABLES DE SEPARACIÓN SEC : TEMPERATURA, CARGA DE MUESTRA A. Incremente la Temperatura para mejorar: - Solubilidad de la muestra - Eficiencia de la columna - Tiempo de corrida (menores debidos a flujos altos, menor viscosidad) - Carga de muestra (solubilidad incrementada)
B. Tamaño de muestra: Limitada por la viscosidad - Cerca de 15 mg max para columnas de 25 x 0.8 cm; VR y HETP se degradan a valores mayores Intervalo PM a 20K 34K a 200K 400K a 2,000K
Concentración Max [%wt./vol.] 0.25 0.10 0.05
Synder and Kirkland, Introduction To Modern Liquid Chromatography., (1979) p. 507 HPLC 7 10/96
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CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN RESUMEN
• DOS TIPOS: GFC - Biopolímeros Acuosos en Geles Hidrofílicos GPC - Polímeros Orgánicos en Poliestireno
• MECANISMO Separación por tamaño (PM)
• CURVA DE CALIBRACIÓN Correlaciona PM y Volumen de Elución
• DISOLVENTE Debe disolver al polímero HPLC 7 10/96
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