CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN (SEC)

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN (SEC) • PORATH - 1957 – Cromatografía Filtración Gel - GFC Disolvente - agua - Muestras – Solubles en agua-Biopolímeros -

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CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN (SEC)

• PORATH - 1957 – Cromatografía Filtración Gel - GFC Disolvente - agua - Muestras – Solubles en agua-Biopolímeros - Empaque - Suave, Gel Hidrofílica (Sephadex) -

• MOORE - 1962 – Cromatografía Permeación en Gel - GPC Disolventes - THF, Decalina, Tolueno - Muestras – Polímeros Orgánicos - Empaque – Poliestireno entrecruzado (Styragel) -

GFC, GPC IDÉNTICO MECANISMO HPLC 7 10/96

1

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN (SEC)

• SEC caracterización de polímeros (PM 1000 a 1 millón)

• Resinas orgánicas (GPC) o bio-moléculas (GFC)---cadenas de moléculas pequeñas

• Las cadenas de distintos largos y formas • Se puede calcular el peso molecular y su distribución

HPLC 7 10/96

2

COMPARACIONES

• GPC vs LSC o Fase Reversa • GPC separa moléculas basada en su tamaño en disolución

• Tamaño en disolución depende de PM y otros factores (disolvente, temperatura, etc.)

• La moléculas más grandes eluyen primero las más pequeñas al final

HPLC 7 10/96

3

VENTAJAS DE SEC



Trabaja con altos PM y tiene tiempos de corrida cortos



Tiempos de separación y orden de elución fácilmente predecibles



No existen pérdidas o reacciónes en la columna



Desarrollo de métodos relativamente simple, sin gradientes HPLC 7 10/96

4

GPC DE GOMA DE MASCAR GPC

CHICLE

Ablandador

Sabor

Estabilizador

COMPONENTES

HPLC 7 10/96

5

PROBLEMAS EN SEC



Limitada capacidad de pico (baja resolución)



No puede resolver compuestos de tamaño similar (isómeros)



Se requiere de una diferente estrategia de optimización



Debe poder disolver al polímero

HPLC 7 10/96

6

MECANISMO DE SEPARACIÓN • Las moléculas más pequeñas penetran en los poros más pequeños y se retienen más

• Las moléculas mayores son EXCLUIDAS

• La separación en función del VOLUMEN HIDRODINÁMICO y no el PM

HPLC 7 10/96

7

CROMATOGRAMA DE EXCLUSIÓN Respuesta del detector

V0

VR Volumen interno

Volumen muerto grande

pequeño

.

Inyección

Volumen de elución [ml]

HPLC 7 10/96

8

CURVA DE CALIBRACIÓN EXCLUSIÓN TOTAL

6

.

PE

RM

5

EA

log

CI ÓN

PM

SE

LE C

4

TI VA

3 PERMEACIÓN Vo

Vi

TOTAL

2 0

10

20 Volumen de elución

30

40

[ml] HPLC 7 10/96

9

CURVAS DE CALIBRACIÓN PARA VARIAS COLUMNAS PS-DVB POLYSTYRENE MOLECULAR WEIGHT

107

106

10 6 Å 10 5 Å

105 10 4 Å

104

1000 Å 500 Å

MIXED BED

100 Å

103

50 Å

102

4

5

6

7

8

9

10

E LUT ION VOL UME [m in p er 30 cm ] HPLC 7 10/96

10

DESARROLLO DE MÉTODOS

• Seleccione un buen disolvente (consulte la literatura)

• Escoja el tamaño de poro adecuado • Corra estándares; desarrolle una curva de calibración

• Inyecte una disolución diluída (~1%) HPLC 7 10/96

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DISOLVENTES PARA GPC •Deben disolver al polímero •Compatible con el empaque y

•Baja viscosidad •Toxicidad, costo, punto de

detector

ebullición

SOLVENT THF

Viscosity UV cutoff BP [20°C, cP] [nm] [°C]

Flash Pt. Toxicity [°C]

0.55

220

66

14

Slight

m-Cresol

20.8

302

203

94

Moderat

Toluene

0.59

285

111

4

Moderat

Dichloromethane0.44

233

40

None

Severe

Synder and Kirkland, Introduction To Modern Liquid Chromatography , 2nd ed., (1979) HPLC 7 10/96

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PAPEL DE LA FASE MÓVIL DISOLVENTE A: Polímero completamente solvatado

DISOLVENTE B: Sin solvatar

HPLC 7 10/96

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SELECCIONANDO COLUMNAS GPC PORES SIZES

MW RANGE (polystyrene)

50 Å

< 1,000

100 Å

< 4,000

500 Å

500 - 2 x10

1000 Å

1000 - 4 x10

4 4

10

4

Å

4 x 10

3

- 4 x10

5

10

5

Å

4 x 10

4

- 4 x10

6

10

6

Å

4 x 10

5

- 4 x10

7

Mixed Bed

500 - 10

7

HPLC 7 10/96

14

REQUERIMIENTOS DE HARDWARE

• •

BOMBA – un control preciso de flujo, esencial



COLUMNA – empaque estable (no cambie disolventes), control de temperatura



DETECCIÓN – No-destructivo (trabajo prep.), amplio intervalo lineal



OBTENCIÓN DE DATOS - computarizado, cálculos automáticos de Mn, Mw, etc.

INYECTOR – mejor automuestreador (10100µl)

HPLC 7 10/96

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PREPARACIÓN DE MUESTRA

•Seleccione un buen disolvente, caliente si es necesario

•Prepare una disolución diluída (~1%) PM1Millón ~0.01%

•Siempre filtre (¡No guarda-columnas!) HPLC 7 10/96

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DETECTORES PARA SEC ÍNDICE DE REFRACCIÓN:

• Respuesta universal • Sensibilidad moderada • Mala temp. y estabilidad de flujo

UV/VISIBLE:

• Buena estabilidad, muchos polímeros no tienen cromóforos

LASER DE LUZ DISPERSA DE ÁNGULO BAJO:• da valores para M n, M w (LALLS)

• resultados de PM ABSOLUTO, ya que se mide el volumen hidrodinámico

VISCOMETRÍA DIFERENCIAL:• Volumen hidrodinámico = Visc.  M n • Útil para calibración universal, da M n, M w viscosidad intrínseca DETECTORES EVAPORATIVOS DE MASA:• Universal, da masa, igual respuesta HPLC 7 10/96

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APLICACIONES DE GPC



Separaciones de polímeros de alto peso molecular



Caracterización de polímeros: Mn, Mw, Mz, polidispersión



Limpieza de muestra: Remueve materiales de alto PM

HPLC 7 10/96

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APLICACIONES DE GPC CONTROL DE CALIDAD RÁPIDO 6

Buen polímero

log PM

5

4

Mal polímero

.

3

2 0

10

20

30

40

Volumen de elución [m l] HPLC 7 10/96

19

SEPARACIÓN DE ADITIVOS DE POLÍMEROS 7 3

1

Muestra: 1. Irganox 1010 2. DSTDP 3. Irganox 1076 4. Estearamide 5. Desconocido 6. Tinuvin 327 7. BHT

Columna: G2000 H8

6

7.5 mm ID x 60 cm x 2

Eluente: Tetrahidrofurano Flujo: 1.6 ml/min Caida Presión : 54 kg/cm2 Detector: RI Temp.: Ambiente

2

4 5

15

20

25

30

35

Tiempo de elución [min] HPLC 7 10/96

20

GPC DE ALTA RESOLUCIÓN C36

C28

C32 C22

MUESTRA:

n-Parafinas

COLUMNA:

SHODEX a-802 x 4, 2m

ELUENTE:

THF

FLUJO:

1 ml/min

PRESIÓN:

48 kg/cm2

C24

C20 C18 C16

C13 C12 C14

DETECTOR: IR

C11

C9

30

40

50

60

C8

70

min

HPLC 7 10/96

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PROPIEDADES FÍSICAS

• Número

PM promedio

cristalinidad, flujo, compresión

• Peso

PM promedio

fuerza (tensil, impacto) resistencia

•z

PM promedio

elongación, flexibilidad

• Z+1

PM promedio

“die swell” HPLC 7 10/96

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VARIABLES DE SEPARACIÓN SEC : TEMPERATURA, CARGA DE MUESTRA A. Incremente la Temperatura para mejorar: - Solubilidad de la muestra - Eficiencia de la columna - Tiempo de corrida (menores debidos a flujos altos, menor viscosidad) - Carga de muestra (solubilidad incrementada)

B. Tamaño de muestra: Limitada por la viscosidad - Cerca de 15 mg max para columnas de 25 x 0.8 cm; VR y HETP se degradan a valores mayores Intervalo PM a 20K 34K a 200K 400K a 2,000K

Concentración Max [%wt./vol.] 0.25 0.10 0.05

Synder and Kirkland, Introduction To Modern Liquid Chromatography., (1979) p. 507 HPLC 7 10/96

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CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN RESUMEN

• DOS TIPOS: GFC - Biopolímeros Acuosos en Geles Hidrofílicos GPC - Polímeros Orgánicos en Poliestireno

• MECANISMO Separación por tamaño (PM)

• CURVA DE CALIBRACIÓN Correlaciona PM y Volumen de Elución

• DISOLVENTE Debe disolver al polímero HPLC 7 10/96

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