CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN (SEC)

• PORATH - 1957 – Cromatografía Filtración Gel - GFC Disolvente - agua - Muestras – Solubles en agua-Biopolímeros - Empaque - Suave, Gel Hidrofílica (Sephadex) -

• MOORE - 1962 – Cromatografía Permeación en Gel - GPC Disolventes - THF, Decalina, Tolueno - Muestras – Polímeros Orgánicos - Empaque – Poliestireno entrecruzado (Styragel) -

GFC, GPC IDÉNTICO MECANISMO HPLC 7 10/96

1

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN (SEC)

• SEC caracterización de polímeros (PM 1000 a 1 millón)

• Resinas orgánicas (GPC) o bio-moléculas (GFC)---cadenas de moléculas pequeñas

• Las cadenas de distintos largos y formas • Se puede calcular el peso molecular y su distribución

HPLC 7 10/96

2

COMPARACIONES

• GPC vs LSC o Fase Reversa • GPC separa moléculas basada en su tamaño en disolución

• Tamaño en disolución depende de PM y otros factores (disolvente, temperatura, etc.)

• La moléculas más grandes eluyen primero las más pequeñas al final

HPLC 7 10/96

3

VENTAJAS DE SEC

•

Trabaja con altos PM y tiene tiempos de corrida cortos

•

Tiempos de separación y orden de elución fácilmente predecibles

•

No existen pérdidas o reacciónes en la columna

•

Desarrollo de métodos relativamente simple, sin gradientes HPLC 7 10/96

4

GPC DE GOMA DE MASCAR GPC

CHICLE

Ablandador

Sabor

Estabilizador

COMPONENTES

HPLC 7 10/96

5

PROBLEMAS EN SEC

•

Limitada capacidad de pico (baja resolución)

•

No puede resolver compuestos de tamaño similar (isómeros)

•

Se requiere de una diferente estrategia de optimización

•

Debe poder disolver al polímero

HPLC 7 10/96

6

MECANISMO DE SEPARACIÓN • Las moléculas más pequeñas penetran en los poros más pequeños y se retienen más

• Las moléculas mayores son EXCLUIDAS

• La separación en función del VOLUMEN HIDRODINÁMICO y no el PM

HPLC 7 10/96

7

CROMATOGRAMA DE EXCLUSIÓN Respuesta del detector

V0

VR Volumen interno

Volumen muerto grande

pequeño

.

Inyección

Volumen de elución [ml]

HPLC 7 10/96

8

CURVA DE CALIBRACIÓN EXCLUSIÓN TOTAL

6

.

PE

RM

5

EA

log

CI ÓN

PM

SE

LE C

4

TI VA

3 PERMEACIÓN Vo

Vi

TOTAL

2 0

10

20 Volumen de elución

30

40

[ml] HPLC 7 10/96

9

CURVAS DE CALIBRACIÓN PARA VARIAS COLUMNAS PS-DVB POLYSTYRENE MOLECULAR WEIGHT

107

106

10 6 Å 10 5 Å

105 10 4 Å

104

1000 Å 500 Å

MIXED BED

100 Å

103

50 Å

102

4

5

6

7

8

9

10

E LUT ION VOL UME [m in p er 30 cm ] HPLC 7 10/96

10

DESARROLLO DE MÉTODOS

• Seleccione un buen disolvente (consulte la literatura)

• Escoja el tamaño de poro adecuado • Corra estándares; desarrolle una curva de calibración

• Inyecte una disolución diluída (~1%) HPLC 7 10/96

11

DISOLVENTES PARA GPC •Deben disolver al polímero •Compatible con el empaque y

•Baja viscosidad •Toxicidad, costo, punto de

detector

ebullición

SOLVENT THF

Viscosity UV cutoff BP [20°C, cP] [nm] [°C]

Flash Pt. Toxicity [°C]

0.55

220

66

14

Slight

m-Cresol

20.8

302

203

94

Moderat

Toluene

0.59

285

111

4

Moderat

Dichloromethane0.44

233

40

None

Severe

Synder and Kirkland, Introduction To Modern Liquid Chromatography , 2nd ed., (1979) HPLC 7 10/96

12

PAPEL DE LA FASE MÓVIL DISOLVENTE A: Polímero completamente solvatado

DISOLVENTE B: Sin solvatar

HPLC 7 10/96

13

SELECCIONANDO COLUMNAS GPC PORES SIZES

MW RANGE (polystyrene)

50 Å

< 1,000

100 Å

< 4,000

500 Å

500 - 2 x10

1000 Å

1000 - 4 x10

4 4

10

4

Å

4 x 10

3

- 4 x10

5

10

5

Å

4 x 10

4

- 4 x10

6

10

6

Å

4 x 10

5

- 4 x10

7

Mixed Bed

500 - 10

7

HPLC 7 10/96

14

REQUERIMIENTOS DE HARDWARE

• •

BOMBA – un control preciso de flujo, esencial

•

COLUMNA – empaque estable (no cambie disolventes), control de temperatura

•

DETECCIÓN – No-destructivo (trabajo prep.), amplio intervalo lineal

•

OBTENCIÓN DE DATOS - computarizado, cálculos automáticos de Mn, Mw, etc.

INYECTOR – mejor automuestreador (10100µl)

HPLC 7 10/96

15

PREPARACIÓN DE MUESTRA

•Seleccione un buen disolvente, caliente si es necesario

•Prepare una disolución diluída (~1%) PM1Millón ~0.01%

•Siempre filtre (¡No guarda-columnas!) HPLC 7 10/96

16

DETECTORES PARA SEC ÍNDICE DE REFRACCIÓN:

• Respuesta universal • Sensibilidad moderada • Mala temp. y estabilidad de flujo

UV/VISIBLE:

• Buena estabilidad, muchos polímeros no tienen cromóforos

LASER DE LUZ DISPERSA DE ÁNGULO BAJO:• da valores para M n, M w (LALLS)

• resultados de PM ABSOLUTO, ya que se mide el volumen hidrodinámico

VISCOMETRÍA DIFERENCIAL:• Volumen hidrodinámico = Visc.  M n • Útil para calibración universal, da M n, M w viscosidad intrínseca DETECTORES EVAPORATIVOS DE MASA:• Universal, da masa, igual respuesta HPLC 7 10/96

17

APLICACIONES DE GPC

•

Separaciones de polímeros de alto peso molecular

•

Caracterización de polímeros: Mn, Mw, Mz, polidispersión

•

Limpieza de muestra: Remueve materiales de alto PM

HPLC 7 10/96

18

APLICACIONES DE GPC CONTROL DE CALIDAD RÁPIDO 6

Buen polímero

log PM

5

4

Mal polímero

.

3

2 0

10

20

30

40

Volumen de elución [m l] HPLC 7 10/96

19

SEPARACIÓN DE ADITIVOS DE POLÍMEROS 7 3

1

Muestra: 1. Irganox 1010 2. DSTDP 3. Irganox 1076 4. Estearamide 5. Desconocido 6. Tinuvin 327 7. BHT

Columna: G2000 H8

6

7.5 mm ID x 60 cm x 2

Eluente: Tetrahidrofurano Flujo: 1.6 ml/min Caida Presión : 54 kg/cm2 Detector: RI Temp.: Ambiente

2

4 5

15

20

25

30

35

Tiempo de elución [min] HPLC 7 10/96

20

GPC DE ALTA RESOLUCIÓN C36

C28

C32 C22

MUESTRA:

n-Parafinas

COLUMNA:

SHODEX a-802 x 4, 2m

ELUENTE:

THF

FLUJO:

1 ml/min

PRESIÓN:

48 kg/cm2

C24

C20 C18 C16

C13 C12 C14

DETECTOR: IR

C11

C9

30

40

50

60

C8

70

min

HPLC 7 10/96

21

PROPIEDADES FÍSICAS

• Número

PM promedio

cristalinidad, flujo, compresión

• Peso

PM promedio

fuerza (tensil, impacto) resistencia

•z

PM promedio

elongación, flexibilidad

• Z+1

PM promedio

“die swell” HPLC 7 10/96

22

VARIABLES DE SEPARACIÓN SEC : TEMPERATURA, CARGA DE MUESTRA A. Incremente la Temperatura para mejorar: - Solubilidad de la muestra - Eficiencia de la columna - Tiempo de corrida (menores debidos a flujos altos, menor viscosidad) - Carga de muestra (solubilidad incrementada)

B. Tamaño de muestra: Limitada por la viscosidad - Cerca de 15 mg max para columnas de 25 x 0.8 cm; VR y HETP se degradan a valores mayores Intervalo PM a 20K 34K a 200K 400K a 2,000K

Concentración Max [%wt./vol.] 0.25 0.10 0.05

Synder and Kirkland, Introduction To Modern Liquid Chromatography., (1979) p. 507 HPLC 7 10/96

23

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN RESUMEN

• DOS TIPOS: GFC - Biopolímeros Acuosos en Geles Hidrofílicos GPC - Polímeros Orgánicos en Poliestireno

• MECANISMO Separación por tamaño (PM)

• CURVA DE CALIBRACIÓN Correlaciona PM y Volumen de Elución

• DISOLVENTE Debe disolver al polímero HPLC 7 10/96

24