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DESARROLLO DEL CULTIVO DE LENGUADO, Paralichthys californicus: AVANCES SOBRE LA FISIOLOGIA DIGESTIVA Y NUTRCION DE LARVAS Y JUVENILES Juan Pablo Lazo Laboratorio de Nutrición de Peces Departamento de Acuicultura CICESE
Esquema de la platica
Introducción Cultivo larvario
Ontogenia del sistema digestivo y capacidad digestiva Digestibilidad in vitro Microdietas y protocolos de destete Pigmentación
Cultivo de Juveniles
Temperatura óptima Efecto de la relación E/P Tasas de alimentación
Laboratorio de Nutrición de Peces Marinos
Participantes:
Benjamín Barón-Sevilla Emmanuel Martínez Verónica Vizcaino Mario Galaviz Magali Zacarias Jean Benoit Muguet Sharon Herzka
Armando García-Ortega Mark Drawbridge Nathaniel Schmit Jesús Mariscal Daniel Vargas Héctor Canseco Luz López
¿Por qué cultivar Peces Marinos?
La pesca mundial ha llegado a un tope de cosecha (aprox. 90-100 millones de toneladas) La mayoría de las poblaciones naturales están sobreexplotadas y disminuyendo A través del cultivo de peces marinos se puede:
Disminuir la presión pesquera sobre las poblaciones naturales Repoblar especies nativas en vía de extinción Estudiar la biología básica en el laboratorio (ecofisiolgía y ontogenía)
Excelente fuente alternativa de proteína y lípidos Alternativa para la acuacultura en Latino América
Lenguado, Paralichthys californicus
El lenguado es un recurso pesquero nativo de gran importancia en las costas del Pacífico Mexicano y del sur de California de los Estados Unidos Americanos Se distribuye desde Canadá hasta Bahía Magdalena Baja California, México Es la especie que alcanza mayores tallas de toda la familia Paralichthidae, alcanzando tallas de 1.5 m de longitud total y un peso de 32 Kg Tiene gran aceptación comercial por la textura y sabor de su carne Se comercializa a precios del orden de $10 a $20 USD, dependiendo de su presentación
Distribución natural Río Quillayute
o éan Oc i fi c Pa c o
Bahía Magdalena
Situación actual pesquerías Se han reportado reducciones de más del 80% en la capturas totales multiespecificas de lenguados en las costas de la Baja California A nivel nacional, se puede generalizar que las capturas de lenguado han disminuido en un 33% en los últimos veinte años
Estado actual del cultivo
Reproducción controlada en cautiverio Cultivo larvario con alta supervivencia (hasta un 80%) Producción comercial de semilla por el CICESE
Capacidad actual 50,000 a 70,000 juveniles Nuevo Laboratorio con capacidad de 250,000
Varias granjas comerciales cultivando juveniles en Baja California Comercializado en Baja California con precios de $10 dólares el kilo pez entero
Nuevo Laboratorio Comercial Instalaciones de 1000 m2 en el CICESE Capacidad de producir 250,000 juveniles de lenguado y/o jurel aleta amarilla Primer laboratorio comercial de peces marinos en el país
Laboratorio de Cultivo de Peces Marinos
Reproducción en cautiverio
Desoves naturales
Desoves inducidos
Cultivo Larvario
TIPO DE ALIMENTO
DIETA COMPUESTA
ARTEMIA 5 Rot mL-1
5-10 naup mL-1
15 Rot mL-1
ROTIFEROS
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51
DIAS DESPUES DE LA ECLOSION (DDE)
Protocolo de Alimentación
Engorda en Granja Comercial
Pezco S.A. de C.V.
Problemas
Altos costo de producción de alimento vivo y mortalidad en el destete (transición de alimento vivo a microdietas) Producción de juveniles con pigmentación anormal Temperatura altas durante la engorda en B.C. Crecimiento moderado (500 a 600 g en 12 meses) Canibalismo en juveniles tempranos
Cultivo de Peces Marinos
La etapa larvaria es considerada la más crítica La mayoría de los problemas están asociados con la nutrición y alimentación Para satisfacer sus requerimientos nutricionales las larvas deben: Ingerir alimento Digerirlo a través de procesos enzimáticos Absorber y metabolizar los nutrientes necesarios Se considera que las larvas poseen un sistema digestivo poco desarrollado: carecen de estómago funcional que secrete HCl y pepsina
Alimentación de larvas Dos alternativas: 1) La utilización de presas vivas como rotíferos o Artemia
Difícil de mantener Laborioso y costoso (70-80 % del costo producción) Valor nutricional subóptimo
2) Microdietas formuladas
Buen perfil nutricional Tamaño adecuado Poco éxito con estas dietas
Dietas formuladas Crecimiento
Supervivencia Sobrevivencia (%)
Longitud (mm)
6 5 4 3 2 1 0
Zooplancton
Microdietas
Tipo de alimento
45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
Zooplancton
Microdietas
Tipo de Alimento
PROBLEMAS CON LA PIGMENTACION
Larvas: Estudios de Fisiología Digestiva
Estrategias de investigación • Morfología e histología durante la ontogenia del sistema digestivo • Estudios de actividad enzimática: ¿cual es la capacidad digestiva? • Digestibilidad in vitro: selección de ingredientes adecuados • Aplicaciones practicas de la fisiología digestiva: • Desarrollo de microdietas • Protocolos de destete
Ontogenia del sistema digestivo
2 DDE. Zona prevalvular (pr),gota de aceite (∗), ángulo de constricción (→).
2 DDE. Intestino tubular (it), saco vitelino (s), ojo (o). H-E (10X).
Páncreas 2 DDE. Epitelio cilíndrico con microvellosidades eosinófilas formando el borde en cepillo (ep), serosa (→). H-E (63X).
3 DDE. Gránulos de zimógeno (z), hígado (h), intestino (i). H-E (40X).
14 DDE. Asa intestinal (*), páncreas (p), hígado (h), intestino (i). H-E (10X).
13 DDE. Asa intestinal (→).
Glándulas gástricas
↓ ↓
26 DDE; primeros esbozos de las glándulas digestivas H-E, 400X
44 DDE. Región cardiaca (rc), región fúndica (rf), región pilórica (rp), hígado (h), páncreas (p), intestino (i), H-E (5X).
Capacidad digestiva
Enzimas Digestivas
Proteasas (digestión de proteínas)
Lipasas (digestión de lípidos)
Proteasas ácidas (pH 2) Proteasas alcalinas (pH 7-10) Tripsina y Quimiotripsina (proteasas pancreáticas típicas) Aminopeptidasa, fosfatasa alcalina (epitelio intestinal) Peptidasas, catepsinas, (intracelulares) Lipasas generales Lipasas dependiente de sales biliares, Fosfolipsas
Amilasas (digestión de C.H.)
Amilasas Maltasas
Metodología para estudiar enzimas digestivas Muestreo y preparación de los extractos: 1 larvas
larvas • 2 h (limpieza del intestino) 2
• LE
Disección 3
Homogenizado
Sistema digestivo
4
Centrifugado 5
Sobrenadante
Leu-Aminopeptidasa
• Proteína disuelta • Actividad enzimática • Digestibilidad in vitro
Proteasas 50
Total activity (U/larvae)
Total activity (U/larvae)
70 60 50 40 30 20 10
40 30 20 10
0
0 0
4
8 12 16 20 24 28 32 36 40 44
0
4
Days post hatch
Days post hatch
Tripsina
Aminopeptidasas 6
Total activity (U/larvae)
30
Total activity (U/larvae)
8 12 16 20 24 28 32 36 40 44
25 20 15 10 5 0
5
Destete?
4 3 2 1 0
0
4
8 12 16 20 24 28 32 36 40 44
Days post hatch
Proteasas alcalinas
0
4
8 12 16 20 24 28 32 36 40 44
Days post hatch
Protesas acidas
Histoquímica
Enzimas digestivas:
Tripsina (endoproteasa alcalina por excelencia) Lipasas (digestión de lípidos) Amilasas (digestión carbohidratos) Aminopeptidasas (exoproteasa de la membrana intestinal, indicador de maduración del intestino) Fosfatasa ácida (digestión intracelular) Fosfatasa alcalina (enzima de la membrana intestinal)
Histoquímica 100
AC AB
90
b b
B
80
ab
90
bc
ab
ac
bcd
Nivel de gris (%)
70
CD
bc
60
BDEF
BC
50
CE
a 40
AC ad
CB
a a
B
bcd Nivel de gris (%)
A
b
100
CF
C
ABC a
70
D
c
DE
60
E 50
I.A. I.P.
30
80
a
ab
I.A I.P.
40
A 0
0 0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Días después de la eclosión (DDE)
Actividad de la fosfatasa alcalina en el intestino de P. californicus, durante su desarrollo larvario. Media ± D.E. (n=3).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Días después de la eclosión (DDE)
Actividad de la fosfatasa acida en el intestino de P. californicus, durante su desarrollo larvario. Media ± D.E. (n=3).
Eclosión
Inicio de alimentación
Metamorfosis
Estómago incipiente
Modelo ontogénico
Sistema digestivo prematuro
Embrión d0 • Tripsina
Intestino proximal (Digestión de lípidos y proteínas) Intestino distal (Absorción intracelular de proteínas)
Intestino posterior
Etapa larvaria
Juvenil
d 2-5 • Quimotripsina
•Aminopeptidasa •Fosfatasa
d 30-40 Digestión proteica
Pepsina
Digestión de péptidos •Amilasa •Lipasa
•Lisosomas
Esófago Estómago Intestino anterior
Extracelular
Carbohidratos Lípidos Intracelular
Digestibilidad in vitro
Digestibilidad in vivo
La digestibilidad integra los procesos digestivos con los de absorción de los nutrientes Permite inferir el grado de aprovechamiento del alimento Limitantes en el estudio de larvas de peces marinos
Muy difícil recolectar heces Difícil cuantificar alimento consumido Muchas especies no aceptan microdietas formuladas al inicio de la alimentación exógena
Algunos estudios de digestibilidad en larvas peces
Aun no se consideran los cambios ontogénicos
Digestibilidad in vitro Técnicas alternativas Ensayos sencillos y de bajo costo Evaluación rápida de la calidad de los ingredientes Uso de extractos enzimáticos de larvas o enzimas comerciales Evaluación de la digestibilidad de:
proteínas
(por amino ácidos) lípidos (por ácidos grasos)
Parámetros: técnica pH-STAT
Extracto de enzimas de larvas de lenguado Proporción de [E]:[S]
30 Unidades de enzima por ensayo 8 mg/ml proteína por ingrediente
Rx: pH 8.0 Base: 0.1 N NaOH Temp: 25 ºC Tiempo de Rx: 1h
INGREDIENTES 1.600
1.400
1.200
1.000
0.800
0.600
0.400
0.200
0.000
INGREDIENTES
RO
TI FE RO S
CA LA M AR
G LU
TE N
G LU
TE N
SO YA
1.800
SO YA
39 DDE
AR TE M IA
RO S
TRATAMIENTOS
AR TE M IA
TI FE
26 DDE
RO
TRATAMIENTOS
AR
KR IL L
PR O T
DH (%)
9 DDE
CA LA M
0.000
RI LL
0.500
K
2.000
PR O T
2.500
G A
0.000 P
0.000
CU
1.000
O M EG A
0.500
SI LV ER
1.000
P
go
6.000
C U
1.000 CA SE IN A
tri
2.500
IL VE R
1.500
DH (%)
de
so ya
7.000
O M E
TE N
G lu te n
H. de
ia
ro t if er os
ca la m ar
l
ro t
kr il
Ar te m
H. de
H. de
P
1.500
SE IN A
LU
YA
IA
eg a
lve rc up
H. de
O m
Si
a
2.000
CA
G
SO
AR TE M
S
R
TI FE R O
M A
L
T
UP
PR O
C
KR IL
A
C AL A
EG
RO
M
VE R
Ca se in
DH (%) 3.000
S
O
SI L
C AS EI N A
DH (%)
Ontogenia de la digestibilidad 15 DDE
5.000
4.000
3.000
2.000
R
INGREDIENTES
O T
IA
G LU
TE N
SO YA
TE M
O S
AR
IL L
O TI FE R AR
A
UP
PR
KR
A
C
IN
AL AM
EG
ER
AS E
0
C
O M
SI LV
C
DH (%)
PR O T
CU P
NA
TI FE RO S
G LU TE N
SO YA
AR TE M IA
RO
CA LA M AR
KR IL L
O M EG A
SI LV ER
CA SE I
DH (%)
51 DDE
1.800
1.600
1.400
1.200
1.000
0.800
0.600
0.400
0.200
0.000
INGREDIENTES
2.5
2
1.5 9
15 26
1 39 51
0.5
Microdietas
Diseño experimental
Se formularon 2 dietas, 1 comercial y 1 control Bioensayo por 42 días Larvas alimentadas con alimento vivo enriquecido con HUFA n-3
Rotíferos @ 5 por ml iniciando 3 DDE Artemia @ 5-7/ml iniciado 16 DDE
Co-alimentación al día 20 DDE Completamente destetados para el día 26 Se alimento en exceso (> 3020% peso)
Composition of experimental diets Ingredient Artemia decapsulated cysts Sardine fishmeal Menhaden fish meal CPS90 (Prot hydrolysate) Skipjack muscle Cod liver oil Skipjack orbit oil Vitamin premix Mineral premix Mesquite gum Carrageen CMC Whey protein concentrate Sodium alginate Proximate composition (% dw) Protein Lipid Ash Dry matter
Diets (g/100 g dry weight) QA MC 74 15.7 49.4
AL
9.8 2.6 1.7 1
14.8 2 1 3.1 0.6
5 0.6 0.6
49.5 18.3 9.7 92.4
67 21 10 93
56 15 12 93
Resultados Peso Humedo 0.0600
16.0 14.0 12.0 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0
0.0500 peso (g)
SL (mm)
Longitud
0.0400 0.0300 0.0200 0.0100 0.0000
AL
CT
MC
AL
QA
CT
Trt
100
800
80
% Albinos
No. org
Albinismo
1000
600 400
60 40
200
20
0
0
CT
MC Trt
QA
Trt
Mortalidad
AL
MC
QA
AL
CT
MC
QA
Trt
AL= alimt comercial, CT = alimento vivo, MC = Microcapsulas, QA = dieta quistes
Destete
Tiempo del destete
Diseño experimental I Determinar
la fecha mas temprana para realizar el destete Larvas alimentadas inicialmente con rotíferos y artemia (tratamiento control) 4 fechas de destete: 16, 26, 36 y 46 DDE 3 días de periodo de co-alimentación 3 replicas por tratamiento
Evaluación de edad para el destete a
100
90
90
80
80 70
Survival (%)
Survival (%)
b
100
60 50 40
70 60 50 40
30
30
20
20
10
10
0
0
16
21
26
31
36
41
46
51
56
26
31
36
41
dph
c
51
56
d
100 90 80
80 70
70 Survival (% )
Survival (%)
100 90
46
dph
60 50 40
60 50 40
30 20
30
10 0
10
20 0
36
39
42
45
48
dph
51
54
57
60
46
48
50
52
54
56
58
60
dph
Figure 1. Survival rate (n=3) of larvae weaned at 16 (a), 26 (b), 36 (c) and 46 (d) dph. Muguet et al., 2004
Actividad enzimática: tripsina 4.5
40
A: total activity
A: total activity
4
35
3.5
30
3 25 2.5 20 2 15
1.5
10
1 0.5
5
0
0
16W
16C
100 90
26W
180
A: total activity
26C
A: total activity
160
80
140
70
120
60 100 50 80
40
60
30
40
20
20
10 0
0
36W
36C
46W
46C
Muguet et al., 2004
Leucino-aminopeptidasa 50
A: total activity
*
250
A: total activity
45
* 200
40 35 30
150
25 100
20 15 10
50
5 0
0
16W
800
16C
26W
26C
1200
A: total activity
A: total activity *
700
1000
600 800 500 600
400 300
400
200 200 100 0
0
36W
36C
46W
46C
Efecto del nivel de DHA en el destete DHA nutrientes esencial Diseño experimental II
Antecedentes
en Japón (Kanazawa, 90’s) Cuatro niveles de DHA en el enriquecimiento con Artemia DHA 0, 5, 10 y 15 % del total de los ácidos grasos en la emulsión enriquecedora Destete total en el día 36 Bioensayo 78 días
Efecto del DHA en el éxito del destete Peso final
Talla Final
0.45
35
0.4
30
0.35
25 (mm)
(g)
0.3 0.25 0.2 0.15
20 15 10
0.1
5
0.05
0
0 0
5
10
0
15
5
10
DHA Level (% of Total Fatty acids)
DHA Level (% of Total Fatty acids)
No.final 500 400 0 300
5
200
10 15
100 0 0
5
10
DHA Level (%of total fatty acids)
15
15
Pigmentación
Causas de la malpigmentación
Nutricionales Ácidos
grasos: DHA, EPA y ARA Vitamina A Yodo: hormonas tiroedianas
Ambientales Calidad
de la Luz Intensidad de la luz UV
Efecto del DHA en la pigmentación Pigmentacion 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
Albino Machas Pigmentado
0
5
10
15
Nivel de DHA (%acidos grasos totales)
NIVEL ADECUADO DE DHA ENTRE 10-15 % AGT
Modelo del efecto del UV
Efecto de la luz UV 160.00 140.00 120.00 100.00 PIGMENT
80.00
ALBINO
60.00 40.00 20.00 0.00 0% UV
33% UV
66% UV
100% UV
Las larvas requieren niveles de UV normales para una pigmentación adecuada
Nutrición y Cultivo de Juveniles
Requerimientos nutricionales
Aproximación utilizando información de otras especies similares como el P. olivacius, P. dentatus y P. lethostigma. Proteína
(45-55%) Lípidos (10-16%) Energía (18-20 kj/100 g) Cenizas (10%) Carbohidratos (