Proyecto Nº SC95-091

DESARROLLO Y VALIDACION DE SISTEMAS DE DETECCION DE TOXICIDAD DE EFLUENTES Y VERTIDOS

Equipo Investigador: María Jesús Muñoz Reoyo (Dra. C.B.) Matilde Carballo Santaolalla (Dra. C.B.) Argelia Castaño Calvo (Dra. C.B.) Gregoria Carbonell Martin (Dra. C.B.) José Antonio Ortiz López (L.Q.) José Vicente Tarazona Lafarga (Dr. Vet.) Equivalente de jornada completa: 2,00 Centro de Investigación: Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA). INIA Duración: Enero 1995 - Diciembre 1997 Coste: Miles de pesetas: 14.475 Financiación INIA 100%

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PLANTEAMIENTO Y OBJETIVOS Las características toxicologías actuales de las emisiones de efluentes al medio acuático suponen cada vez más un riesgo conocido por su repercusión en la salud de las poblaciones. Las circunstancias especiales que vive nuestro pís en materia de aguas, imponen un riesgo adicional que repercute no solo en inversiones mayores en depuración sino en sistemas de vigilancia eficaces para mantener los criterios de calidad exigidos cada vez más con niveles mayores de protección. Cada vez existe mayor información acerca de la naturaleza y composición de estas muestras complejas, dependiendo de la actividad generadora de los focos contaminantes. También cada vez se conocen más las repercusiones de estos focos en la salud de las poblaciones que viven y dependen de su medio receptor. Por todo ello, a pesar de que el abordaje más frecuentemente utilizado para valorar el riesgo de un efluente se basa en metodología analítica, y a pesar de que actualmente existen listas de compuestos conocidos por su peligrosidad en la que figuran las concentraciones máximas admisibles para cada uno de ellos, desde hace algún tiempo están siendo utilizados otros abordajes que consideran el conocimiento de estas características tóxicas independientemente de que con las analíticas puedan conocerse su composición. Estos nuevos abordajes están muy indicados cuando se valoran estas mezclas complejas, ya que: 1. Llevan en su composición microcontaminantes que, a pesar de presentarse a bajas concentraciones poseen una toxicidad elevada. 2. Su composición es difícil de conocer ya que entrar a formar parte muy frecuentemente metabolitos y compuestos de degradación difíciles de valorar. 3. El valor tóxico de estas muestras se debe a la acción conjunta de todos sus componentes, no a la de compuestos mayoritariamente presentes, más fáciles de identificar. Ante esta complejidad es lógico suponer que cualquier aproximación que se haga para valorar el riesgo de estas muestras complejas, deberá de incluir necesariamente sistemas que indiquen, al margen de su composición, la repercusión que la emisión va a suponer en el medio receptor para las poblaciones, objetivo último en la interpretación de resultados utilizando cualquier metodología. A este respecto dos han sido las aproximaciones que con diversos motivos de estudio se han venido utilizando recientemente. Las dos utilizan una combinación de métodos analíticos y biológicos: • Las Valoraciones por Identificación Toxicológica (TIE: Toxicity Identification Evaluation). • Las Membranas Semipermeables con Trioleína, utilizadas de método pasivo concentrador de contaminantes orgánicos biodisponibles, en combinación con bioensayos. Para acometer los objetivos de este proyecto, la información de la cual partíamos era la siguiente: •

Información acerca de naturaleza de efluentes, vertidos y condiciones de medio receptor. 2

• Disponibilidad de un buen número de bioensayos de toxicidad, tanto estandarizados como los que hemos desarrollado recientemente en nuestro grupo. •

Avances en metodologías VIT y con MSP, desarrollados recientemente por nuestro grupo.

Por todo ello, los objetivos que se plantearon fueron: 1. Seleccionar aquellos bioensayos que destacaran por su representatividad, sensibilidad y capacidad de valoración de contaminantes y muestras. 2. Combinación de aquellos seleccionados con la metodología analítica necesaria en cada circunstancia, para detectar toxicidad. 3. Valoración global de efluentes industriales y agropecuarios mediante un protocolo que, combinado adecuadamente metodología analítica y biológica, sea eficaz. 4. Validar esta metodología en campo. RESULTADOS Se conoce la eficacia de cada uno de los sistemas de los bioensayos propuestos (“in vivo” de peces, “in vitro” de peces, de toxicidad aguda de Daphnia magna, modificado para equeños volúmenes de Daphnia magna, de inhibición de Chlorella vulgaris, crónico de teratogenia en pez Medaka (Oryzias latipes). Se conoce la eficacia de extracción de compuestos “tipo” (representativos de grupos de compuestos tóxicos con repercusión en el medio), utilizando el procedimiento basado en membranas semipermeables (MSP) con Trioleína. De los bioensayos anteriormente citados para valorar los extractos obtenidos de las MSP, el ensayo modificado para pequeños volúmenes, de Daphnia magna, es el que mejor expresa efectos de toxicidad, en los extractos vehiculados con n-hexano. Se comprueba que el procedimiento basado en MSP, es útil, por sí mismo (sin combinar con bioensayo), para la detección de un compuesto (Xileno de Almizcle) de origen difuso y ubicuo, sospechoso de ser responsable de su bioacumulación en peces de interés comercial. Se comprueba así mismo que, este procedimiento sirve para detectar la carga inespecífica de compuestos orgánicos de origen difuso en cuencas fluviales, así como para definir zonas conflictivas en grandes áreas. TambiÉn se comprueba que este procedimiento es útil como sistema concentrador analítico de muestras complejas en laboratorio. Hemos conseguido caracterizar toxicológicamente un vertido industrial y otro agropecuario mediante la combinación de métodos analíticos y determinados ensayos o baterías de ensayos. A este respecto nuestro abordaje ha consistido en: Utilizar una batería de bioensayos (los mismos y alternativos a los que se utilizan para la clasificación de la toxicidad de las sustancias por la U.E.), para valorar la toxicidad de los 3

vertidos y su evolución en el tiempo y/o a lo largo del procedimiento de depuración de estos, cuando existían. Con esto: conocemos los que expresan con mayor nivel de sensibilidad esta variabilidad. Conocemos, en los vertidos estudiados, en los que se identifican los compuestos mayoritariamente presentes, y en los que se ha realizado un fraccionamiento de la muestra, el porcentaje de información toxicológica ausente debido a las caracterizaciones analíticas insuficientes. Hemos valorado la metodología combinada desarrollada para vertidos (basada en concentración de la muestra, fraccionamiento y valoración con bioensayo), comparándola con las metodologías más convencionales (analíticas y estimación de Unidades de toxicidad para compuestos mayoritariamente presentes). Hemos conseguido una interpretación más rápida y una valoración más exacta y rentable. Disponemos de un procedimiento de concentración y extracción de microcontaminantes en mezclas complejas, que se ha aplicado a sustancias y a compuestos puros. Este sistema se complementa con la valoración de los distintos pasos del procedimiento mediante dos bioensayos miniaturizados, de nuevo desarrollo y el estudio de recuperación de los compuestos en cada paso. En purines (vertidos agropecuarios), hemos avanzado en la caracterización analítica y toxicológica de los compuestos orgánicos, valorando mediante dos bioensayos, para seleccionar el que mejor expresa efectos. INFORMACIÓN CIENTIFICA Y TECNICA PROYECTO. POSIBLES APLICACIONES

PROPORCIONADA

POR

EL

Respecto a los bioensayos Eficacia del ensayo de toxicidad aguda de Daphnia magna estandarizado y modificado para pequeños volúmenes, para: Demostrar en 24 horas, rangos de mayor toxicidad que con otros bioensayos. Eficacia en la valoración de extractos en: metanol, n-hexano, con porcentajes de solventes máximos admisibles de: 2,5 % y 0,05% respectivamente. Disponibilidad de un nuevo bioensayo desarrollado con la tecnología de cultivos celulares, que consigue menores tiempos de expresión y lectura automatizada. Es el ensayo de inhibición del crecimiento en Chlorella vulgaris. Este es un ensayo alternativo al estandarizado que puede ser eficaz en la valoración de muestras fitotóxicas, pero que presenta un bajo nivel de sensibilidad en los efluentes industriales ensayados y en los vertidos agropecuarios. Eficacia del ensayo de citotoxicidad en línea celular RTG-2 (alternativo al ensayo “in vivo” estandarizado de toxicidad aguda en Onchorrynchus mikyiss) en los estudios de recuperación de compuestos en los procedimientos de concentracción y extracción.

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Acortamiento de tiempos de expresión de efectos en ensayos de cronicidad: En el test del pez Medaka (Oryzias latipes), hemos conseguido tiempos de expresión de 14 días, basados en los siguientes parámetros de expresión: • • • •

Tiempo de eclosión Porcentaje de eclosión Viabilidad larvaria Anormalidades en el desarrollo

Respecto al procedimiento de las MSP con Trioleína: Eficacia para extraer compuestos “tipo”. Valoración de extractos con el ensayo de Daphnia magna modificado. Concentración de un compuesto sospechoso en una cuenca fluvial: Xileno de Almizcle. Concentración de compuestos orgánicos biodisponibles de origen difuso en una cuenca fluvial. Valoración con batería de bioensayos. Eficacia en la valoración de efluentes agropecuarios: Valoración con batería de bioensayos. Respecto a la caracterización ecotoxicológica de efluentes.: Eficacia de la batería de bioensayos alternativos compuesta por: Alternativa a toxicidad aguda en peces. Test de citotoxicidad en línea celular RTG-2. Test de toxicidad aguda en crustáceos. Alternativa al test de toxicidad aguda en algas: Test miniaturizado de Chlorella vulgaris Mayor sensibilidad demostrada en un

% con Daphnia magna.

Eficacia demostrada de Daphnia magna en valoración “in situ” de efluentes. Eficacia demostrada del ensayo modificado de Daphnia magna para valorar fracciones y concentrados (Fase orgánica e inorgánica) de las muestras obtenidas por procedimientos de concentración analítica. Respecto al procedimiento de concentración y extracción de microcontaminentes y la valoración de los distintos pasos del procedimiento: Respecto a la caracterización de vertidos agropecuarios: • • • •

Concentración de compuestos orgánicos presentes. Toxicidad de fracciones orgánicas obtenidas mediante concentración con MSP Variabilidad de toxicidad de efluentes Variabilidad de procesos de depuración.

Información técnica y posibles aplicaciones:

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Se dispone de un procedimiento más eficaz para valorar la toxicidad de un efluente sobre los organismos del medio, consistente en una batería compuesta por tres bioensayos, dos de ellos de nuevo desarrollo. Se dispone de un procedimiento rápido para conocer la responsabilidad de compuestos con distinta naturaleza, importante para considerar antes de emprender las costosas metodologías analíticas y ofreciendo en paralelo con esta información, el porcentaje de contribución de las distintas fracciones a la toxicidad global del vertido. Se dispone de un procedimiento para detectar compuestos traza sospechosos de procesos patológicos en peces, que están basados en sistemas sencillos de MSP y Trioleína que expresan la acumulación en tejido adiposo de compuestos orgánicos biodisponibles (capacidad de atravesar barreras de membranas celulares por difusión pasiva). Se dispone de un procedimiento capaz de detectar compuestos de origen difuso en el medio acuático en cuencas de ríos, incapaces de detectar con métodos analíticos por presentarse muchas veces por debajo del límite de detección de las técnicas analistas. Se dispone de un método eficaz para fraccionar mezclas complejas (vertidos, efluentes, etc.) y conocer simultáneamente el valor tóxico de cada una de ellas con respecto a la toxicidad global. Se dispone de un sistema de concentración y extracción de microcontaminantes, especialmente valioso en la detección de pesticidas en aguas reutilizables. Ayudará a: • La adecuación de los sistemas de depuración a la carga tóxica real de los efluentes agroindustriales, con métodos menos costosos y más informativos. • Estimar el riesgo toxicológico que los efluentes pueden producir en las poblaciones animales expuestas. • Actuar en estudios de seguimiento de situaciones conflictivas en el medio acuático, que pondrían en peligro la supervivencia de las poblaciones, si estos se utilizaran como bioindicadores. • Contribuirá a conocer el riesgo tóxico de las aguas reutilizables, que pueden llevar microcontaminentes. • Conocer las posibles repercusiones de los compuestos orgánicos (menos estudiados) de los purines aplicados en campo, lixiviados a aguas subterráneas o con posibilidad de llegar a aguas superficiales. PUBLICACIONES Artículos científicos De la Torre, A.I., Fernández, C., Tarazona, J.V., Muñoz, M.J. 1995. Detection of aroclor, DDT, Malathion and HCB using semiimpermeable membranes as concentration method. Chemosphere, 31.2. 2727-2737. Ramos, C., De la Torre, A.I., Tarazona, J.V., Muñoz, M.J. 1996. Desarrollo de un ensayo de inhibición de Chlorella vulgaris, utilizando un test en microplacas. Revista de Toxicología, 13. 97-100. 6

Muñoz, M.J., Ramos, C., Tarazona, J.V. 1996. Bioaccumulation and toxicity of hecachlorobenzene in Chlorella vulgaris and Daphnia magna. Aquatic Toxicology,35. 211220. De la Torre, A.I., Fernández, C., Cuéllar, M., Tarazona, J.V., Muñoz, M.J. 1998. Utilización de membranas semipermeables rellenas de Trioleína para el seguimiento y detección de compuestos de relevancia medioambiental. Revista de Toxicología, 15.23-28. De la Torre, A.I., Fernández, C., Tarazona, J.V., Muñoz, M.J. 1998. Combination of semipermeable membranes and toxicity bioassays for the detection of lipophylic toxic chemicals in environmental samples. Ecotoxicology and Environmental Restauration, 2.1 79-84. Muñoz, M.J. 1995. Nuevas alternativas en la gestión de vertidos y residuos. Libro del 1er Congreso Nacional de Veterinaria y Medio Ambiente. 145-150. Fernández, C., de la Torre, A.I., Carbonell, G., Muñoz, M.J., Tarazona, J.V. 1995. Evaluación toxicológica del riesgo medioambiental ligado al vertido de los purines de cerdo. Libro del 1er Congreso Nacional de Veterinaria y Medio Ambiente. 291-295. García, M.A., Martín-Otero, L., De la Torre, A.I., Fernández, C., Valdovinos, C., Carballo, M., Sánchez, P., Muñoz, M.J. 1995. Utilización de baterias tests y membranas semipermeables como métodos de valoración ecotoxicológica de un tramo de una cuenca fluvial. Libro del 1er Congreso Nacional de Veterinaria y Medio Ambiente. 365-374. Pinilla, M.J., Cuéllar, M.L., Tarazona, J.V., Muñoz, M.J. 1995. Estudio de los efectos del Antraceno durante los estadios embiolarvales del pez japonés Medaka (Oryzias latipes). Libro del 1er Congreso Nacional de Veterinaria y Medio Ambiente. 233-236. Artículos de divulgación Muñoz, M.J., De la Torre, A.I., Fernández, C., 1996. Valoración Toxicológica de la fracción orgánica en purines de cerdo. Porci, 31. 53-66. Muñoz, M.J. 1996. El impacto medioambiental de las explotaciones de porcino. Aula Veterinaria. Porci, monografía, 31. Muñoz, M.J., Castaño, A. 1997. Las explotaciones porcinas en nuestro país. Gestión medioambiental en el marco de la U.E. Porci . Muñoz, M.J.1997. Medioambiente. Aula Veterinaria. Porci, monografía, 41. Trabajos presentados a congresos, reuniones o simposios Muñoz, M.J. Nuevas alternativas en la gestión de vertidos y resíduos. 1º Congreso Nacional de Veterinaria y Medio Ambiente. Murcia (España). Diciembre, 1995. Pinilla, M.J., Cuellar, M., Tarazona, J.V., Muñoz, M.J. Estudio de los efectos del Antraceno durante los estadíos embriolarvarios del pez japonés Medaka (Oryzias latipes). 1º Congreso Nacional de Veterinaria y Medio Ambiente. Murcia (España). Diciembre, 1995. 7

Garcia, M.A., Martin-Otero, L., De la Torre, A.I., Valdovinos, C., Carballo, M., Sanchez, P., Muñoz, M.J. Valoración ecotoxicológica de la cuenca baja del rio Jarama mediante la aplicación de una bateria test y membranas semipermeables. 1º Congreso Nacional de Veterinaria y Medio Ambiente. Murcia (España). Diciembre, 1995. Fernandez, C., De la Torre, A.I., Carbonell, G., Muñoz, M.J., Tarazona, J.V. Evaluación toxicológica del riesgo medioambiental ligado al vertido de los purines de cerdo. 1º Congreso Nacional de Veterinaria y Medio Ambiente. Murcia (España). Diciembre, 1995. De la Torre, A.I., Castaño, A., Carballo, M., Tarazona, J.V., M.J. Muñoz. Toxicity detection by bioassays in monitoring studies using semipermeable devices as passive sampler. Sixth SETAC-Europe Annual Meeting. 1996. Castaño, A., Pinilla, M.J., Sanchez, P., Carballo, M., Tarazona, J.V., Muñoz, M.J. Alternative systems to acute and chronic assays on fish. Fourth European Conference on Ecotoxicology and Environmental Safety. Metz (Francia). Agosto, 1996. Carballo, M., Carbonell, G., Fernandez, C., Boleas, S., Castaño, A., Muñoz, M.J., Tarazona, J.V. Comparison of stres response and biomarker based informationin a pollutedmarine environment. Fourth European Conference on Ecotoxicology and Environmental Safety. Metz (Francia). Agosto, 1996. Muñoz, M.J. El pez Medaka japonés (Oryzias latipes) como modelo de teratogenia en el estudio de tóxicos ambientales: Malformaciones macroscópicas y lesiones microscópicas. IV Congreso Nacional de la S.E.C.A.L. Octubre, 1996 Roset, J., Carballo, M. y M.J. Muñoz. El lagunaje de aguas residuales de pequeños núcleos. Introducción al estudio en condiciones cntroladas. V Jornadas Científicas de Veterinaria Militar. Veterinaria y Medio Ambiente. Mayo, 1997 Pinilla, M.J., Roset, J., Carballo, M., Muñoz, M.J. Toxicidad del Benzo(a)pireno en los estadíos embriolarvales del pez medaka (Oryzias latipes). Modelo de valoración para contaminantes ambintales. V Jornadas Científicas de Veterinaria Militar. Veterinaria y Medio Ambiente. Mayo, 1997 De la Torre, A.I., Rueda, O., Roset, J., Carballo, M., Castaño, A., Muñoz, M.J. Herramientas técnico-científicas aplicables en los estudios de impacto ambiental y en ecoauditorias de explotaciones ganaderas intensivas. I Congreso Internacional Medio Ambiente y Veterinaria. Cáceres (España). Abril, 1997 Muñoz, M.J., Carballo, M., Roset, J., de la Torre, A.I., Castaño, A. Herramientas biológicas necesarias en el saneamiento de una cuenca fluvial. I Congreso Internacional Medio Ambiente y Veterinaria. Cáceres (España). Abril, 1997. Carballo, M., Muñoz, M.J., Roset, J., de la Torre, A.I., Castaño, A. Control de vertidos en industrias agroalimentarias. I Congreso Internacional Medio Ambiente y Veterinaria. Cáceres (España). Abril, 1997. Fernandez,C., Muñoz, M.J. Congreso Nacional de Toxicología. XII Jornadas Toxicológicas Españolas. Septiembre, 1997. 8

Carballo, M., Castaño, A., de la Torre, A.I., Roset, J., Muñoz, M.J. Evaluation of effluent ecotoxicity from chemical industry. SETAC, 18 th Annual Meeting. Noviembre,1997.

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