ORIGINAL

Detección de la duplicación del gen PMP22 en pacientes con neuropatía periférica: estudio en la población mexicana Hernán Cortés, Óscar Hernández-Hernández, Teresa Bautista-Tirado, Rosa Elena Escobar-Cedillo, Jonathan J. Magaña, Norberto Leyva-García

Introducción. La enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT) es una neuropatía que afecta los nervios motores y sensitivos, y la CMT1A es el subtipo más frecuente en el mundo. La CMT1A se produce por una duplicación de 1,5 Mb en el locus 17p11.2-p12, donde se localiza el gen PMP22. Para el diagnóstico de CMT1A es importante contar con técnicas moleculares específicas para la determinación de esta mutación. Objetivos. Establecer un método de uso rutinario para detectar la duplicación de PMP22 en la población mexicana y estimar su frecuencia en pacientes con características clínicas para la CMT. Pacientes y métodos. Se analizaron 157 pacientes mexicanos no relacionados entre sí, diagnosticados de CMT por valoración clínica. La determinación de la duplicación de PMP22 se realizó a través de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real mediante el método comparativo 2–∆∆CT. Resultados. El método 2–∆∆CT para detectar la duplicación del gen PMP22 mostró ser sensible y fiable. Los resultados fueron consistentes con los obtenidos mediante la técnica de hibridación in situ fluorescente. Se detectó la duplicación de PMP22 en 79 pacientes (50,3%), con un comportamiento similar a lo comunicado en Estados Unidos, Australia, Finlandia, Suecia y España. Sin embargo, se observó que existen diferencias con otras poblaciones. Conclusiones. La técnica de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa se implementó como un diagnóstico molecular de CMT1A eficaz y de bajo coste, por lo que puede utilizarse rutinariamente en México. Esto es esencial para el asesoramiento genético y el tratamiento oportuno de los pacientes con CMT. La frecuencia de la duplicación del gen PMP22 varía entre regiones geográficas, por lo que es importante estimarla en diferentes poblaciones. Palabras clave. Charcot-Marie-Tooth 1A. Diagnóstico molecular. Neuropatía periférica. PCR cuantitativa. PMP22. Pobla­ ción mexicana.

Introducción Las neuropatías hereditarias son un grupo de tras­ tornos neurológicos clínica y genéticamente he­ terogéneos que afectan principalmente el sistema nervioso periférico. Dentro de ellos, la forma etio­ lógica más importante es la neuropatía hereditaria sensitivomotora, también conocida como enferme­ dad de Charcot-Marie-Tooth (CMT) [1]. La CMT produce manifestaciones clínicas caracterizadas por debilidad distal en las extremidades, deformación del pie (pie cavo), debilidad y atrofia muscular pro­ gresiva [2]. Basándose en las características clínicas y las velocidades de neuroconducción motora (VNM), la CMT se clasificó inicialmente en dos tipos: – CMT1 o desmielinizante: afecta directamente la mielina de las células de Schwann, y se caracteri­ za por la disminución de las VNM < 38 m/s. – CMT2: afecta principalmente los axones de las neuronas periféricas, sin que las VNM se vean alteradas significativamente (VNM > 38 m/s) [3].

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Recientemente se han identificado neuropatías pe­ riféricas que producen afectaciones tanto mielíni­ cas como axonales [4,5], por lo que la identificación de los genes relacionados con este tipo de enferme­ dades ha permitido una mejor clasificación de los subtipos de CMT [6]. En el mundo, se estima que la prevalencia de CMT oscila entre 10 y 40 por cada 100.000 habitan­ tes [7-10]. En muchas de las poblaciones estudia­ das, la CMT1 se considera el grupo más frecuente [11], por lo que su estudio adquiere gran importan­ cia. La CMT1 puede ser de origen esporádico o fa­ miliar con un patrón de herencia autosómica domi­ nante, y se subdivide, al menos, en seis tipos (A, B, C, D, E o F), dependiendo de la mutación que la ori­ gina. La causa más frecuente de CMT1 es la duplica­ ción de una región de 1,5 Mb en el locus 17p11.2-p12 [12], región donde se localiza el gen PMP22, que codifica para el componente de la mielina del siste­ ma nervioso periférico, la proteína integral de mem­ brana PMP22. Se ha sugerido que el aumento en la

Laboratorio de Medicina Genómica, CENIAQ; Departamento de Genética (H. Cortés, O. Hernández-Hernández, T. Bautista-Tirado, J.J. Magaña, N. Leyva-García). Servicio de Electrodiagnóstico (R.E. EscobarCedillo). Instituto Nacional de Rehabilitación. México DF, México. Correspondencia: Dr. Jonathan Javier Magaña. Laboratorio de Medicina Genómica, CENIAQ. Departamento de Genética. Instituto Nacional de Rehabilitación. Avda. México-Xochimilco, 289. Col. Arenal de Guadalupe. CP 14389. México DF, México. E-mail: [email protected] Nota: J.J.M. y N.L.G. contribuyeron igualmente en el manuscrito. Aceptado tras revisión externa: 07.01.14. Cómo citar este artículo: Cortés H, Hernández-Hernández O, Bautista-Tirado T, Escobar-Cedillo RE, Magaña JJ, Leyva-García N. Detección de la duplicación del gen PMP22 en pacientes con neuropatía periférica: estudio en la población mexicana. Rev Neurol 2014; 59: 111-7. © 2014 Revista de Neurología

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dosis génica de PMP22 ocasiona las manifestacio­ nes clínicas en el subtipo CMT1A [13,14]. Adicio­ nalmente, se han notificado mutaciones puntuales en el gen PMP22 asociadas con CMT [15]; sin em­ bargo, son mucho menos frecuentes [16]. El diagnóstico molecular de CMT1A es de gran relevancia, ya que permite un tratamiento adecua­ do del paciente, así como un oportuno asesora­ miento genético. De acuerdo con los estándares in­ ternacionales para el diagnóstico de las neuropatías periféricas hereditarias, la detección de la duplica­ ción génica de PMP22 es fundamental en el diag­ nóstico de pacientes con características clínicas de CMT1 [17,18]. Para ello, se han usado técnicas diag­ nósticas como la electroforesis en gel de campos pulsados [19], Southern blot [20] e hibridación in situ fluorescente (FISH) [21]. Sin embargo, debido a su coste, consumo de tiempo, uso de sondas marca­ das radiactivamente y de equipo especializado, es­ tos métodos no han podido establecerse para un diagnóstico de rutina. En búsqueda de un estudio diag­ nóstico rutinario, el análisis de marcadores micro­ satélite por electroforesis capilar ha mostrado ser útil [22]; sin embargo, su especificidad no es del 100% [23], además de que se hace necesario analizar al menos seis marcadores polimórficos, así co­mo mar­ cadores internos, lo que incrementa los tiempos de análisis y los costes de la operación. Por ello, en los últimos años se han desarrollado técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa en tiem­ po real (qPCR) [24-26], las cuales, gracias a su pre­ cisión y sensibilidad, han revolucionado el diagnós­ tico de CMT1A. La necesidad de implementar un diagnóstico efi­ caz para la enfermedad de CMT1A ha llevado a realizar diversos estudios, la gran mayoría en po­ blaciones caucásicas [21,22,24-26] y asiáticas [23,27]. En México no existen datos epidemiológicos que describan la frecuencia de CMT1A. Un estudio previo en pacientes mexicanos describió sólo siete individuos con la duplicación de PMP22, a partir de una cohorte de 17 pacientes con probable CMT1A, lo que no refleja la frecuencia real de CMT1A en México [28]. Aunado a esto, el diagnóstico molecu­ lar de CMT1A no está al alcance para la gran mayo­ ría de la población mexicana, debido a que se reali­ za en instituciones privadas a un alto coste econó­ mico. A fin de estimar la frecuencia de CMT1A en pacientes mexicanos, en el presente trabajo se im­ plementó y validó una técnica de qPCR rápida, sen­ sible y de bajo coste, para la detección de la dupli­ cación del gen PMP22, con lo que fue posible anali­ zar una cohorte de 157 pacientes mexicanos con criterios clínicos de CMT. Finalmente, la distribu­

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ción de los casos con la duplicación del gen PMP22 en nuestra población se comparó con estudios rea­ lizados en diversas regiones geográficas del mundo.

Pacientes y métodos Muestra Se analizaron 157 pacientes mestizos mexicanos de ambos sexos con probable CMT, no relacionados biológicamente entre sí, provenientes de distintos puntos de la República Mexicana, con al menos tres generaciones nacidas en el país. Los criterios clíni­ cos para la selección de los pacientes se basaron en guías internacionales para el diagnóstico de CMT [17,18]. Como controles sanos se incluyeron 13 vo­ luntarios sin hallazgos clínicos de CMT y con diag­ nóstico negativo para CMT1A conforme a un labo­ ratorio de referencia (Kleberg Cytogenetics Labora­ tory, Baylor College Medicine, Houston, TX, EE. UU.). Los pacientes y los sujetos sanos se integraron al protocolo voluntariamente mediante la firma de una carta de consentimiento informado. El estudio fue aprobado por el Comité de Investigación del Instituto Nacional de Rehabilitación.

PCR cuantitativa (qPCR) Se extrajo ADN genómico a partir de leucocitos de sangre periférica utilizando el sistema de purifica­ ción Gentra PureGene ® (Qiagen, Hilden, Alemania). El análisis de la duplicación del gen PMP22 se lle­ vó a cabo mediante qPCR, empleando ensayos Taq­ Man ® (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). Se utilizaron oligonucleótidos dirigidos al exón 3 del gen PMP22, así como al exón 12 del gen de la albúmina sérica humana (HSA), usado como con­ trol endógeno. La secuencia de los oligonucleótidos fue la siguiente: PMP22 sentido 5’-GCCACCAT­ GATCCTGTCGAT-3’; PMP22 reverso 5’-CCCTT­ GGTGAGGGTGAAGAGT-3’; HSA sentido 5’-AATGCTGCACAGAATCCTTGGT-3’; HSA reverso 5’-TCATCGACTTCCAGAGCTGAAA-3’. Se utili­ zaron dos sondas marcadas fluorescentemente: la sonda 5’-FAM-TTCAGCATTCTGTCTCTGTTCCTGTTCTTCTG-3’, dirigida al exón 3 del gen PMP22, y la sonda 5’-VIC-ACAGGCGACCATGC-3’, dirigi­ da al exón 12 de HSA. La qPCR se realizó en un vo­ lumen de reacción de 15 μL, que incluyó 1X Taq­ Man Universal Master Mix II ® (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.); 30 ng de ADN humano; 300 nM de cada oligonucleótido para PMP22; 1.200 nM de cada oligonucleótido para HSA, y 100 nM de ca­

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da sonda. La qPCR se realizó en un equipo Step One ® (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). La PCR consistió en una desnaturalización inicial de 10 min a 95 °C, seguida de 45 ciclos, incluyendo un paso de desnaturalización a 95 °C durante 15 s, y un paso de hibridación y polimerización de 60 °C du­ rante 60 s. Las muestras se analizaron por triplicado, en presencia de un control positivo y uno sano con­ firmados previamente (Kleberg Cytogenetics Labora­ tory, Baylor College Medicine, Houston, TX, EE. UU.).

Figura 1. Identificación de la duplicación del gen PMP22 a través de qPCR. Se muestran las curvas de amplificación de PMP22 y HSA obtenidas por qPCR (izquierda), y la comparación de los resultados obtenidos por la técnica de FISH (derecha). a) Cinética de amplificación a partir de una muestra de un paciente positivo para la duplicación de PMP22; b) Cinética de amplificación de un paciente negativo para la duplicación de PMP22, con características clínicas para CMT. dup: duplicación; nl: normal.

a

Cálculo de la dosis génica de PMP22 Para el análisis de datos se empleó el método com­ parativo 2–∆∆CT a través del programa Step One 2.2, conforme a lo comunicado por Aarskog y Vedeler [24] y Thiel et al [25]. La determinación de dosis gé­ nica o número relativo de copias se calculó median­ te el logaritmo: 2–(∆∆CT), donde ∆∆CT = [∆CT HSA (calibrador) – ∆CT PMP22 (calibrador)] – [∆CT HSA (paciente) – ∆CT PMP22 (paciente)], descrito por Livak y Schmittgen [29]. Valores ≥ 1,5 indican duplicación del gen PMP22, mientras que valores de 1 o ≤ 0,5 indican un número normal de copias o deleciones del gen PMP22, respectivamente.

b

Resultados Diagnóstico molecular de CMT1A La detección de la duplicación del gen PMP22 se realizó a través de cuantificación relativa mediante qPCR. La cinética de amplificación para el gen PMP22 fue normalizada con respecto a la cinética del gen endógeno, con lo que fue posible determi­ nar la dosis génica de PMP22 en cada muestra ana­ lizada. Los valores del ciclo correspondiente para el umbral de detección (CT) obtenidos para PMP22 y HSA fueron semejantes en las muestras de indivi­ duos sanos, mientras que en los pacientes que pre­ sentaron la duplicación, los valores de CT para PMP22 disminuyeron con respecto a HSA. Es im­ portante resaltar que cada evaluación se validó ana­ lizando paralelamente tanto un control positivo como un control sano, analizados mediante la téc­ nica de FISH. En la figura 1a se muestra el resultado positivo para la duplicación de PMP22 en un pa­ ciente con características clínicas de CMT. Se ob­ serva claramente que la cinética de reacción para el probando y para el control positivo es la misma. Por otro lado, en la figura 1b se observa un individuo sano con un resultado negativo. La concordancia entre el probando y el control sano es clara, mien­

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tras que la cinética de reacción para el control posi­ tivo muestra una diferencia significativa con res­ pecto a la dosis génica. A la derecha de cada estudio (Figs. 1a y 1b) se observan los resultados de la du­ plicación de PMP22 por medio de la técnica de FISH, que validan los resultados obtenidos por qPCR. A partir de la validación del método, se inició el es­ tudio en pacientes con características clínicas para CMT en la población mexicana.

Duplicación del gen PMP22 en la población mexicana Se analizaron por triplicado 157 muestras de pa­ cientes mexicanos mestizos referidos por la Clínica de Enfermedades Neuromusculares del Instituto Nacional de Rehabilitación, con diagnóstico clínico y electrofisiológico de CMT. La duplicación del gen PMP22 se detectó en 79 pacientes (50,3%). Los va­ lores obtenidos por el método comparativo 2–∆∆CT

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Figura 2. Valores de 2–ΔΔCT en los 157 pacientes analizados. a) Se observa la duplicación de PMP22 con valores de 2–ΔΔCT ≥ 1,5; b) En los pacientes negativos, los valores obtenidos de 2–ΔΔCT fueron cercanos a 1, lo que indica un número normal de copias de PMP22. a

b

Frecuencia de la duplicación de PMP22 en México con respecto a otras poblaciones De acuerdo con los datos obtenidos, el 50,3% de los pacientes analizados fueron positivos para la dupli­ cación de PMP22. Este porcentaje representa un valor aproximado de la frecuencia de CMT1A en pacientes mexicanos con características clínicas de CMT. Al comparar la frecuencia de la duplicación de PMP22 en la cohorte de pacientes analizados con respecto a lo descrito anteriormente en otras poblaciones (Tabla), se observa que los pacientes mexicanos presentan una frecuencia similar a la co­ municada en poblaciones de Estados Unidos [30], Australia [31], Finlandia [32] y Suecia [33] (p ≥ 0,05). Por otro lado, países como Japón (p = 0,0001) [34], Rusia (p = 0,0035) [35] y Gran Bretaña (p = 0,0001) [36] presentan diferencias estadísticamente significativas en comparación con la población mexicana, lo que significa que la duplicación del gen PMP22 es menos frecuente en estas poblacio­ nes. Por último, a pesar de que la población mexi­ cana posee una fuerte carga genética de la pobla­ ción española, un estudio previo sugirió que la fre­ cuencia de la duplicación en pacientes de origen español es ligeramente mayor a la que observamos en nuestra población (p = 0,01935) [37]; sin embar­ go, recientemente se notificó un análisis con una cohorte mayor de pacientes de España que no pre­ sentó diferencias estadísticamente significativas de la frecuencia de la duplicación entre ambas pobla­ ciones (p ≥ 0,05) [38].

Discusión

para la detección de la duplicación de PMP22 en cada individuo analizado se muestran en la figura 2. Como es posible observar, los 79 individuos posi­ tivos mostraron valores promedio de 1,82 ± 0,17 (rango: 1,52-2,2), conforme a lo esperado (valores > 1,5) (Fig. 2a), mientras que los 78 individuos ne­ gativos presentaron valores promedio de 1,05 ± 0,11 (rango: 0,76-1,21), semejante a lo observado en las 13 muestras utilizadas como controles sanos (1,02 ± 0,12; rango: 0,82-1,17) (Fig. 2b). En la figura 3 se observa el incremento promedio en el valor de 2–∆∆CT en el grupo de pacientes positivos con res­ pecto a los negativos (≥ 0,5), que no se sobrepone en ninguno de los casos analizados, lo que garanti­ za la fiabilidad de la prueba.

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De acuerdo con Saporta et al [17] y Berciano et al [18], los pacientes con probable CMT deben ser evaluados clínica y neurofisiológicamente para de­ terminar si la patología es de origen desmielinizan­ te, axonal o mixta. En ese sentido, aunque se cono­ cen más de 40 subtipos diferentes de CMT, el tipo 1 se considera la neuropatía más frecuente en el mun­ do, y en especial la CMT1A [30-34], por lo que, para los pacientes con neuropatía desmielinizante y con patrón de herencia autosómico dominante, es indispensable identificar la duplicación del gen PMP22. Debido a que México no cuenta con méto­ dos de diagnóstico rutinario para la CMT1A, en el presente trabajo se estableció el diagnóstico mole­ cular para detectar la duplicación del gen PMP22. Posteriormente, se analizó un grupo de 157 pacien­ tes de origen mestizo mexicano con probable CMT, con la finalidad de estimar la frecuencia de CMT1A

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Detección de la duplicación del gen PMP22 en neuropatía periférica

Tabla. Comparación de la frecuencia de CMT1A en pacientes mexicanos con neuropatía periférica del presente estudio frente a la población de otros países. n

Duplicación PMP22

México

157

79 (50,3%)

Australia [31]

224

136 (60,7%)

España [37]

133

86 (64,7%)

España [39]

438

184 (42,0%)

Estados Unidos [30]

153

79 (51,6%)

Finlandia [32]

122

64 (52,5%)

Japón [34]

354

53 (14,9%)

Reino Unido [36]

443

125 (28,2%)

Rusia [35]

174

59 (33,9%)

Suecia [33]

67

39 (58,2%)

en la población mexicana, ya que hasta la fecha no se tienen datos epidemiológicos y sólo se ha reali­ zado un trabajo con un número limitado de pacien­ tes [28], por lo cual fue importante evaluar un ma­ yor número de casos. De acuerdo con nuestro co­ nocimiento, éste es el primer estudio que se ha lle­ vado a cabo a gran escala en población mexicana. En el presente trabajo implementamos una téc­ nica de qPCR para detectar la duplicación de PMP22. Dicha técnica se basa en la comparación de la can­ tidad de producto de PCR generado del gen blanco duplicado (PMP22) con respecto a la cantidad de producto de un gen de referencia constitutivo (HSA) [24-26]. Mediante el método comparativo 2–∆∆CT descrito por Livak y Schmittgen [29], se determinó para cada muestra la relación PMP22/HSA (2–∆∆CT). En nuestro estudio, los valores promedio de 2–∆∆CT para los grupos de pacientes negativos y positivos fueron de 1,05 ± 0,11 y 1,82 ± 0,17, respectivamen­ te, lo que coincide con comunicaciones previas que muestran valores en los rangos de 0,79-1,2 para pa­ cientes negativos y de 1,35-2,36 para pacientes po­ sitivos [23-27]. Dado que los valores de 2–∆∆CT ob­ tenidos de pacientes con y sin la duplicación de PMP22 no se superponen en ningún caso (Fig. 3), y que en cada experimento se utilizó un control po­ sitivo y uno sano validado por la técnica de FISH,

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Figura 3. Frecuencia para los valores de 2–ΔΔCT de los pacientes positivos y negativos para la duplicación de PMP22. Como se describe en el texto, los valores de 2–ΔΔCT para los pacientes negativos estuvieron en un rango de 0,76-1,21, mientras que en los pacientes positivos el rango fue de 1,52-2,2. Los rangos para ambos grupos no se superponen entre sí, lo que confirma la sensibilidad de la técnica utilizada.

que es la técnica de referencia para diagnosticar la CMT1A, se sugiere que la técnica de qPCR permite detectar con certeza la duplicación de PMP22 de acuerdo con lo comunicado en la bibliografía. El número de pacientes evaluados en este estu­ dio es insuficiente para estimar la prevalencia de esta enfermedad en la población mexicana; sin em­ bargo, debido a que el Instituto Nacional de Reha­ bilitación es un centro de referencia al cual son ca­ nalizados pacientes de todo el país, nuestros datos podrían representar un índice aproximado de la frecuencia de la duplicación del gen PMP22 en ca­ sos de CMT en México. De esta manera, encontra­ mos que 79 de los 157 pacientes analizados fueron positivos para CMT1A, lo que representa una fre­ cuencia del 50,3%. La frecuencia de la duplicación de PMP22 en pacientes índice con datos clínicos de CMT a lo largo de diversas poblaciones analizadas varía entre el 14,9-64,7% (media: 45,18%); sin em­ bargo, en la mayoría de las poblaciones, la CMT1A es la más frecuente. El porcentaje de pacientes mexi­ canos con la duplicación fue similar al que se ha co­ municado previamente en otras poblaciones de Es­ tados Unidos, Australia, Finlandia y Suecia [30-33]; sin embargo, existen diferencias estadísticamente significativas con otras poblaciones, como Japón, Ru­ sia y Gran Bretaña [34-36], las cuales presentan un

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menor número de casos de la duplicación del gen PMP22. En ese sentido, las claras diferencias con respecto a la presencia de la duplicación entre dife­ rentes poblaciones pueden verse influenciadas por el origen étnico de cada población y su situación geográfica. De manera peculiar, es importante seña­ lar las diferencias entre las frecuencias observadas en la población española y la población mexicana, ya que comparten un cierto grado de ancestría en común. En un primer estudio se observó una mayor frecuencia de la duplicación de PMP22 en pacientes españoles [37], lo que sugería diferencias que po­ drían explicarse por el mestizaje y la influencia de la ancestría tanto nativoamericana como africana en la población mexicana [39]. Sin embargo, un estudio reciente con un mayor número de pacientes [38] in­ dica que la frecuencia de la duplicación disminuye significativamente con respecto a lo comunicado por Bort et al [37], y muestra una mayor similitud a lo observado en nuestra población. Estos resultados nos hacen considerar que los estudios entre diversas poblaciones no son completamente comparables, debido a que existe una alta diversidad en la mues­ tra de los pacientes, tamaño de la muestra, métodos diagnósticos y formas de notificar los resultados, por lo que será importante homogeneizar el análisis de los resultados entre los diversos estudios para poder tener una mayor visión del comportamiento de la duplicación entre diferentes poblaciones. Con respecto al 49,7% de los pacientes negativos para la duplicación del gen PMP22, es necesario identificar la mutación causante de la patología a través de la secuenciación de genes involucrados en la CMT, como PMP22, MPZ y connexina 32; en ca­ so de que estos estudios se consideren negativos, se debe identificar la mutación en más de 40 posibles genes implicados en la CMT. Para ello, es posible secuenciar el exoma completo del paciente median­ te secuenciación de la siguiente generación, con el objetivo de determinar la mutación causal a un cos­ te menor en comparación con el análisis indepen­ diente de la secuencia de cada gen implicado en la CMT [40]. En conclusión, la detección de la duplicación de PMP22 por medio de qPCR en los pacientes afecta­ dos permitió realizar el diagnóstico molecular de la CMT1A, lo que es crucial para el asesoramiento genético y el manejo integral del paciente. La iden­ tificación de la mutación permitirá informar a los pacientes afectados en edad reproductiva acerca de los riesgos de recurrencia de la enfermedad en su descendencia. Adicionalmente, el diagnóstico opor­ tuno de esta enfermedad podría permitir el diseño

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de estrategias de tratamiento temprano, sobre todo en niños, lo que permitirá evitar o reducir futuras complicaciones. Finalmente, la técnica de qPCR, ade­ más de rápida y sensible, también es altamente fia­ ble para diagnosticar la CMT1A, por lo que se po­ drá ofrecer el servicio de diagnóstico molecular de forma certera y de bajo coste en hospitales e institu­ tos de salud pública de México, lo que redundará en beneficios para nuestra población. Bibliografía 1. Palau F, Cuesta A, Pedrola L. Avances en la genética molecular de las neuropatías hereditarias. Rev Neurol 2002; 35: 246-53. 2. Berciano J, Berciano MT, Combarros O. Original descriptions of peroneal muscular atrophy. Muscle Nerve 2003; 28: 251-2. 3. Bouche P, Gherardi R, Cathala HP, Lhermite F, Castaigne P. Peroneal muscular atrophy. Part I. Clinical and electro­ physiological study. J Neurol Sci 1983; 61: 389-99. 4. Banchs I, Casasnovas C, Montero J, Volpini V, MartínezMatos JA. Charcot-Marie-Tooth disease with intermediate conduction velocities caused by a novel mutation in the MPZ gene. Muscle Nerve 2010; 42: 184-8. 5. Chung KW, Hyun YS, Lee HJ, Jung HK, Koo H, Yoo JH, et al. Two recessive intermediate Charcot-Marie-Tooth patients with GDAP1 mutations. J Peripher Nerv Syst 2011; 16: 143-6. 6. Patzcó A and Shy ME. Update on Charcot-Marie-Tooth disease. Curr Neurol Neurosci Rep 2011; 11: 78-88. 7. Combarros O, Calleja J, Polo JM, Berciano J. Prevalence of hereditary motor and sensory neuropathy in Cantabria. Acta Neurol Scand 1987; 75: 9-12. 8. Emery AE. Population frequencies of inherited neuromuscular diseases –a world survey. Neuromuscul Disord 1991; 1: 19-29. 9. Braathen GJ. Genetic epidemiology of Charcot-Marie-Tooth disease in the general population. Eur J Neurol 2011, 18: 39-48. 10. Foley C, Schofield I, Eglon G, Bailey G, Chinnery PF, Horvath R. Charcot-Marie-Tooth disease in Northern England. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2012; 83: 572-3. 11. Li J. Inherited neuropathies. Semin Neurol 2012; 32: 204-14. 12. Pentao L, Wise CA, Chinault AC, Patel PI, Lupski JR. Charcot-Marie-Tooth type 1A duplication appears to arise from recombination at repeat sequences flanking the 1.5 Mb monomer unit. Nat Genet 1992; 2: 292-300. 13. Huxley C, Passage E, Robertson AM, Youl B, Huston S, Manson A, et al. Correlation between varying levels of PMP22 expression and the degree of demyelination and reduction in nerve conduction velocity in transgenic mice. Hum Mol Genet 1998; 7: 449-58. 14. Niemann S, Sereda MW, Suter U, Griffiths IR, Nave KA. Uncoupling of myelin assembly and schwann cell differentiation by transgenic overexpression of PMP22. J Neurosci 2000; 20: 4120-8. 15. Russo M, Laura M, Polke JM, Davis MB, Blake J, Brandner S, et al. Variable phenotypes are associated with PMP22 missense mutations. Neuromuscul Disord 2011; 21: 106-14. 16. Li J, Parker B, Martyn C, Natarajan C, Guo J. The PMP22 gene and its related diseases. Mol Neurobiol 2013; 47: 673-98. 17. Saporta AS, Sottile SL, Miller LJ, Feely SM, Siskind CE, Shy ME. Charcot-Marie-Tooth disease subtypes and genetic testing strategies. Ann Neurol 2011; 69: 22-33. 18. Berciano J, Sevilla T, Casasnovas C, Sivera R, Vílchez JJ, Infante J, et al. Guía diagnóstica en el paciente con enfermedad de Charcot-Marie-Tooth. Neurologia 2012; 27: 169-78. 19. Lupski JR, De Oca-Luna RM, Slaugenhaupt S, Pentao L, Guzzetta V, Trask BJ, et al. DNA duplication associated with Charcot-Marie-Tooth disease type 1A. Cell 1991; 66: 219-32. 20. Raeymaekers P, Timmerman V, Nelis E, De Jonghe P, Hoogendijk JE, Baas F, et al. The HMSN Collaborative Research

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28.

29.

Group: duplication in chromosome 17p11.2 in Charcot-MarieTooth neuropathy type 1A (CMT1A). Neuromuscul Disord 1991; 1: 93-7. Shaffer LG, Kennedy GM, Spikes AS, Lupski JR. Diagnosis of CMT1A duplications and HNPP deletions by interphase FISH: implications for testing in the cytogenetics laboratory. Am J Med Genet 1997; 69: 325-31. Latour P, Boutrand L, Levy N, Bernard R, Boyer A, Claustrat F, et al. Polymorphic short tandem repeats for diagnosis of the Charcot-Marie-Tooth 1A duplication. Clin Chem 2001; 47: 829-37. Chen SR, Lin KP, Kuo HC, Chen CM, Hsieh ST, Lee MJ, et al. Comparison of two PCR-based molecular methods in the diagnosis of CMT 1A and HNPP diseases in Chinese. Clin Neurol Neurosurg 2008; 110: 466-71. Aarskog NK, Vedeler CA. Real-time quantitative polymerase chain reaction. A new method that detects both the peripheral myelin protein 22 duplication in Charcot-Marie-Tooth type 1A disease and the peripheral myelin protein 22 deletion in hereditary neuropathy with liability to pressure palsies. Hum Genet 2000; 107: 494-8. Thiel CT, Kraus C, Rauch A, Ekici AB, Rautenstrauss B, Reis A. A new quantitative PCR multiplex assay for rapid analysis of chromosome 17p11.2-12 duplications and deletions leading to HMSN/HNPP. Eur J Hum Genet 2003; 11: 170-8. Lorentzos P, Kaiser T, Kennerson ML, Nicholson GA. A rapid and definitive test for Charcot-Marie-Tooth 1A and hereditary neuropathy with liability to pressure palsies using multiplexed real-time PCR. Genet Test 2003; 7: 135-8. Choi JR, Lee WH, Sunwoo IN, Lee EK, Lee CH, Lim JB. Effectiveness of real-time quantitative PCR compare to repeat PCR for the diagnosis of Charcot-Marie-Tooth Type 1A and hereditary neuropathy with liability to pressure palsies. Yonsei Med J 2005; 46: 347-52. Hernández-Zamora E, Arenas-Sordo ML, MaldonadoRodríguez R. Capillary electrophoresis for the detection of PMP22 gene duplication: study in Mexican patients. Electrophoresis 2008; 29: 1582-4. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2–∆ΔCT method. Methods 2001; 25: 402-8.

30. Boerkoel CF, Takashima H, Garcia CA, Olney RK, Johnson J, Berry K, et al. Charcot-Marie-Tooth disease and related neuropathies: mutation distribution and genotype-phenotype correlation. Ann Neurol 2002; 51: 190-201. 31. Nicholson GA. Mutation testing in Charcot-Marie-Tooth neuropathy. Ann NY Acad Sci 1999; 883: 383-8. 32. Silander K, Meretoja P, Juvonen V, Ignatius J, Pihko H, Saarinen A, et al. Spectrum of mutations in Finnish patients with Charcot-Marie-Tooth disease and related neuropathies. Hum Mutat 1998; 12: 59-68. 33. Holmberg BH, Holmgren G, Nelis E, Van Broeckhoven C, Westerberg B. Charcot-Marie-Tooth disease in northern Sweden: pedigree analysis and the presence of the duplication in chromosome 17p11.2. J Med Genet 1994; 31: 435-41. 34. Abe A, Numakura C, Kijima K, Hayashi M, Hashimoto T, Hayasaka K. Molecular diagnosis and clinical onset of CharcotMarie-Tooth disease in Japan. J Hum Genet 2011; 56: 364-8. 35. Mersiyanova IV, Ismailov SM, Polyakov AV, Dadali EL, Fedotov VP, Nelis E, et al. Screening for mutations in the peripheral myelin genes PMP22, MPZ and Cx32 in Russian Charcot-Marie-Tooth neuropathy patients. Hum Mutat 2000; 15: 340-7. 36. Antonidi T, Majumdar A, Burton-Jones S, Williams M. Inherited peripheral neuropathies: genetic testing in the diagnostic laboratory. Neuromuscul Disord 2011; 21: 687-8. 37. Bort S, Nelis E, Timmerman V, Sevilla T, Cruz-Martínez A, Martínez F, et al. Mutational analysis of the MPZ, PMP22 and Cx32 genes in patients of Spanish ancestry with CharcotMarie-Tooth disease and hereditary neuropathy with liability to pressure palsies. Hum Genet 1997; 99: 746-54. 38. Sivera R, Sevilla T, Vílchez JJ, Martínez-Rubio D, Chumillas MJ, Vázquez JF, et al. Charcot-Marie-Tooth disease: genetic and clinical spectrum in a Spanish clinical series. Neurology 2013; 81: 1617-25. 39. Noris G, Santana C, Meraz-Ríos MA, Muñoz ML, MajluftCruz A, Magaña JJ, et al. Mexican mestizo population substructure: effects on genetic and forensic statistical parameters. Mol Biol Rep 2012; 39: 10139-56. 40. Jiménez-Escrig A, Gobernado I, Sánchez-Herranz A. Secuenciación de genoma completo: un salto cualitativo en los estudios genéticos. Rev Neurol 2012; 54: 692-8.

Detection of the PMP22 gene duplication in peripheral neuropathy patients: a study in Mexican population Introduction. Charcot-Marie-Tooth disease (CMT) is a neuropathy that affects sensory and motor nerves. The most common CMT subtype is CMT1A due to a PMP22 duplication of a 1.5 Mb fragment on the 17p11.2-p12. The development of a specific molecular technique that detects the PMP22 duplication is necessary for the diagnosis of CMT1A. Aim. To establish a routinary test for detection of the PMP22 gene duplication in Mexican population and to estimate the CMT1A frequency in patients clinically diagnosed as CMT. Patients and methods. A cohort of 157 individuals clinically diagnosed as CMT were analyzed. The detection of the PMP22 gene duplication was performed using the comparative 2–∆∆CT qPCR method. Results. The comparative 2–∆∆CT method was sensitive and reliable for the detection of the PMP22 duplication. In order to validate the testing, data was compared with FISH results. Duplication of PMP22 was detected in 79 patients (50.3%). Although CMT1A frequency is different among populations, in Mexican patients it was similar with other populations such as United States, Australia, Finland, Sweden and Spain. Conclusions. The qPCR technique is an accurate and inexpensive method for the diagnosis of CMT1A. This method can be routinely used in México where CMT1A represents ≈ 50% of CMT cases. Molecular diagnosis of CMT1A is essential for the genetic counseling and treatment of patients. Key words. Charcot-Marie-Tooth 1A. Mexican population. Molecular testing. Peripheral neuropathy. PMP22. Quantitative PCR.

www.neurologia.com  Rev Neurol 2014; 59 (3): 111-117

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