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REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS MAESTRÍA EN MICROBIOLOGÍA

DETECCIÓN MOLECULAR MEDIANTE PCR DE ADENOVIRUS EN MUESTRAS DE HECES DE NIÑOS MENORES DE 5 AÑOS CON SÍNDROME DIARREICO Trabajo de Grado presentado ante la División de Estudios para Graduados para optar al grado de Magíster Scientiarum en Microbiología

AUTORA: Lcda. Cristina Rose Paredes Luengo CI: 18.427.562

TUTOR: MSc. Ricardo Atencio Tello C.I. 7.712.173

MARACAIBO, SEPTIEMBRE 2014

 

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Paredes Luengo, Cristina Rose. Detección molecular mediante PCR de adenovirus en muestras de heces de niños menores de 5 Años con síndrome diarreico Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias. División de Estudios para Graduados. Maestría en Microbiología. Maracaibo, Estado Zulia, Venezuela, 2014. 47 pp

RESUMEN La diarrea aguda es una de las enfermedades más comunes en niños menores de 5 años y la segunda causa de morbilidad y mortalidad a escala mundial; se estiman 3,3 millones de casos al año para América Latina, África y Asia. Adenovirus se considera el segundo agente causal de gastroenteritis aguda y representa entre el 5 y el 20% de los casos de diarrea en niños hospitalizados. El objetivo de este estudio FUE diagnosticar mediante LA técnica Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), la presencia de Adenovirus en muestras de heces de niños menores de 5 años que presentaron diarrea proveniente de diferentes comunidades del estado Zulia, Venezuela. Se procesó un total de 102 de un total de 120 muestras. Los resultados obtenidos indican una positividad de 21 (20,5%). La mayor prevalencia se encontró en el grupo de niños menores de 1 año, que representan el 30,3% del total de casos. No se encontraron diferencias significativas en relación a los grupos estudiados. los factores evaluados no fueron determinantes en la presencia del virus. Palabras clave: Adenovirus, diarrea aguda, niños. Correo electrónico: [email protected]

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Paredes Luengo, Cristina Rose. Molecular detection by PCR adenovirus in stool samples for children under 5 years with diarrheal syndrome. Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias. División de Estudios para Graduados. Maestría en Microbiología. Maracaibo, Estado Zulia, Venezuela, 2014. 47 pp.

ABSTRACT Acute diarrhea is one of the most common diseases in children under 5 years and the second leading cause of morbidity and mortality worldwide; 3.3 million cases per year in Latin America, Africa and Asia are estimated. Adenovirus is considered the second causative agent of acute gastroenteritis and accounts for between 5 and 20% of cases of diarrhea in hospitalized children. The aim of this study was the diagnosed by Polimerase Chain Reaction technique (PCR), the presence of adenovirus in stool samples from children under 5 years old with diarrhea from different communities of Zulia, Venezuela. A total of 102 out of 120 samples was processed. The results indicate a positivity of 21 (20.5%). The highest prevalence was found in the group of children under 1 year, accounting for 30.3% of all cases. No significant differences in the studied groups. Factors evaluated were not decisive in the presence of the virus Keyword: Adenovirus, acute diarrhea, children. E-mail: [email protected]

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ÍNDICE DE CONTENIDO Página RESUMEN…………………………………………………………………………………

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ABSTRACT………………………………………………………………………………...

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INDICE DE CONTENIDO………………………………………………………………...

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INDICE DE FIGURAS…………………………………………………………………….

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INDICE DE TABLAS………………………………………………………………………

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INDICE DE ANEXOS……………………………………………………………………..

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INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………….

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OBJETIVOS………………………………………………………………………............

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Objetivo General………………………………………………………………...........

21

•

Objetivos Específicos…………………………………………………………………

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METODOLOGÍA…………….……………………………………………………............

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•

Recolección y Almacenamiento de las Muestras ..……………………………….

22

•

Recolección de Información.……………………..………………………………….

22

•

Criterios de Inclusión……………………………….…………………………………

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•

Criterios de Exclusión…………………………………………………………..........

22

•

Controles……………………………………………………………………………….

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•

Metodología Diagnóstica…………………………………………………………….

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•

Extracción del ADN Viral…………………………………………………………….

23

•

Amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)………………

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•

Iniciadores Específicos de Adenovirus Humanos…………………………………

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•

Visualización de los Resultados……………………………………………………

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•

Factores de Riesgo……………………………………………………………..........

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•

Análisis Estadístico de los Resultados…………………………………………….

26

RESULTADOS y DISCUSIÓN…………………………………………………………..

27

CONCLUSIONES…………………………………………………………………………

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RECOMENDACIONES…………………………………………………………………...

37

INDICE DE REFERENCIAS……….…………………………………………………….

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ANEXOS……………………………………………………………………………………

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INDICE DE FIGURAS

Figura 1.

Prevalencia de infección por Adenovirus en niños menores de 5 años con síndrome diarreico………………………………...............

Figura 2.

Electroforesis

en

gel

de

agarosa

al

2%

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de

Adenovirus………………………………………………………………... 29 Figura 3.

Frecuencia de Adenovirus según el sexo en niños menores de 5 años con diarrea aguda…………………………………………………. 30

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INDICE DE TABLAS

Tabla 1.

Iniciadores utilizados para la amplificación de Adenovirus..……………

Tabla 2.

Volúmenes de reactivos empleados para la reacción de amplificación por PCR……………………………………………………..........................

Tabla 3.

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Relación entre la detección de Adenovirus y síntomas más frecuentes………………………………………………………………….....

Tabla 6.

28

Frecuencia de Adenovirus según la edad en niños menores de 5 años con diarrea aguda……………………………………………………

Tabla 5.

25

Frecuencia de Adenovirus en niños menores de 5 años con diarrea Aguda, según su procedencia. …………………………………………...

Tabla 4.

24

Relación entre la detección de Adenovirus

31

y tipo de agua

consumida.……………………………………………………………...……

33

Tabla 7.

Relación entre la detección de Adenovirus y lavado de manos....……

34

Tabla 8.

Relación entre la detección de Adenovirus y tipo de alimentación…...

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INDICE DE ANEXOS

Anexo 1.-

Historia clínica…………………………………………………………

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Anexo 2.-

Consentimiento informado……………………………………………

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INTRODUCCIÓN Las infecciones del tracto digestivo ocupan el segundo lugar por orden de frecuencia en todo el mundo, entre ellas se encuentran, el síndrome diarreico o diarrea aguda que se ha convertido en

un problema de salud ya que afecta a toda la población sin

distinción de edad, sexo, raza, ocupación ó condición social (Cermeño., 2008).

Según datos de la Organización Mundial de la Salud, la diarrea aguda y la infección respiratoria aguda de vías bajas son las causas principales de mortalidad en menores de 5 años (Montes e Iturriza – Gómara., 2008).

La diarrea aguda se define como una reducción en la consistencia de las evacuaciones (líquidas o semilíquidas) y/o un incremento en la frecuencia de las mismas, (igual o más de 3 evacuaciones en 24 horas), pudiendo acompañarse de fiebre o vómito. Su duración es por lo general menor de 7 días y nunca más de 14 días (ESPGHAN., 2008). Se divide en infecciosa o no infecciosa. Los niños y los ancianos son los que suelen sufrir sus efectos fulminantes, debido a la excesiva pérdida de electrolitos durante la enfermedad y que puede causar una deshidratación grave (Hernández y col., 2011).

La etiología de la diarrea aguda infecciosa, incluye bacterias, parásitos y virus, varía según la edad y el área geográfica (Rivero y col., 2009). Se estima que el 90% de las gastroenteritis en niños menores de 5 años son de etiología viral, entre estos los virus más frecuentemente implicados son Rotavirus, Adenovirus, Norovirus, Astrovirus y Sapovirus (Hernández y col., 2011). Los Adenovirus representan el segundo agente causal de gastroenteritis agudas después del Rotavirus, y constituye entre el 5 – 20% de los casos de diarrea en niños hospitalizados (Girard y col., 2006).

Cuando la diarrea, se produce en niños sanos y bien nutridos constituye un proceso autolimitado que se resuelve de manera espontánea en una semana, sin que sea

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necesario ningún tratamiento específico y las medidas que deben tomarse están dirigidas a corregir la deshidratación o prevenirla y a mantener una adecuada ingesta calórica. La mayoría de los niños de los países occidentales presentan al menos un episodio de diarrea aguda antes de cumplir un año, por lo que ésta, a pesar de ser un proceso benigno, continúa siendo un motivo de consulta frecuente en los centros de salud (Suárez., 2001).

Esta patología es de suma importancia sanitaria. Su manejo es relativamente fácil, solo requiere para su control: la provisión de agua potable, buenas condiciones higiénicas, alimentarias y adecuado control de las excretas; ya que su propagación se realiza por vía fecal – oral. La frecuencia de esta patología suele ser similar tanto en los países desarrollados como aquellos que están en vías de desarrollo, donde ni la calidad del suministro de agua, ni las condiciones higiénicas y sanitarias han demostrado influir en el control de la infección. Sin embargo, en los países más pobres la letalidad es mayor, producto de la desnutrición y las dificultades para acceder oportunamente a los servicios de salud (OPS., 2007).

La incidencia de síndrome diarreico, está condicionada por varios aspectos biológicos, sociales y económicos de cada población. Los principales factores de riesgo asociados a esta enfermedad son la desnutrición, la mala higiene, bajo nivel educacional de los representantes, mal estado sanitario de la vivienda y consumo de agua contaminada, entre otros (Manrique., 2006).

Moore y col. 2010, realizaron un estudio retrospectivo de 10 años en niños menores de 5 años de edad, que presentaban episodios repetidos de diarrea aguda, pertenecientes a la población Gonçalves Dias en Brasil. Obtuvieron que de los 414 niños estudiados, los más afectados fueron los menores de 2 años. Los cuales presentaron diarrea aguda 3 ó 4 veces en un año. Demostraron que con el paso del tiempo, ésta puede convertirse en diarrea persistente al desconocerse el agente causal y no ser tratada a tiempo; concluyendo que los niños que presentan diarreas agudas, varias veces al año, tienen retraso en el crecimiento, problemas de nutrición y neurológicos.

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Investigaciones realizadas en Europa estiman que cada año mueren a causa de diarrea más de 2 millones de personas, la mayoría niños de países en vías de desarrollo. Siendo los agentes etiológicos más comunes: Astrovirus, Sapovirus, Adenovirus y otros virus entéricos, cuya frecuencia es mucho menor. En la práctica habitual de los laboratorios de microbiología, sólo se reconoce un agente causal (virus, parásitos, bacterias u hongos) en el 30-40% de los casos de diarrea. Por tanto, hay una importante brecha diagnóstica de un 60-70% que queda sin diagnosticar y que las nuevas tecnologías, basadas en biología molecular, pueden reducir (Clark y McKendrick., 2004).

Las enfermedades diarreicas, son consideras como uno de los principales factores que contribuyen a la desnutrición infantil y a la hospitalización. Venezuela no escapa a esta realidad, estimándose que ocurren más de un millón de casos anuales, con una media de 2,2 episodios/niño/año, siendo los virus y las bacterias entéricas los principales agentes etiológicos involucrados (González y Macas., 2008).

En Venezuela, las estadísticas epidemiológicas ubican la diarrea en el segundo lugar de ocurrencia en la población, con un porcentaje del 16,9% de los reportes semanales de enfermedades. Su incidencia es muy elevada en la edad pediátrica, especialmente en los niños menores de 1 año en quienes la letalidad es de 0,95%, le sigue el grupo de 1 a 5 años con una letalidad de 0,28% (Wilderman y col., 2010).

Para el año 2011, según el Boletín Nº 52 del Ministerio del Poder Popular para la Salud, en toda Venezuela se reportaron 28.779 casos de diarrea con ascenso de 6,7% en relación a la semana epidemiológica anterior (26.979). Observando que el riesgo más elevado se registraba en el grupo menor de 5 años y que la mayor tasa de incidencia en este grupo correspondía a la población menor de 1 año con 624 casos. Mientras que para el año 2012, se registraron 26.418 casos de diarreas, pero el grupo más afectado, continuaba siendo la población menor de 5 años, especialmente los niños menores de 1 año (MPPS., 2012).

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En nuestro país, durante el año 2013, la diarrea aguda ocupó el tercer lugar de las principales causas de consulta con 21.380 casos (14,17%), observándose una disminución de la misma respecto al año 2012 (MPPS., 2013). En el año en curso, se han reportado hasta el mes de Octubre, 27.985 casos de diarrea aguda, observándose el mayor porcentaje de incidencia, en los grupos de poblaciones de 1 a 4 años (27,39%) y de 25 a 44 años (16,22%) (MPPS., 2014).

El Estado Zulia, es la región del país, con mayor número de reportes de diarrea (más del 22,9%). En los últimos 3 años, se ha observado un incremento alarmante en los reportes de esta enfermedad, comenzando en el 2012 con 4.599 casos y 6.435 casos en lo que va de año. Esta situación causa preocupación ya que se necesita conocer el agente causal de las mismas y establecer medidas de control acordes a la situación socio-económica de la población en estudio (MPPS., 2012 – MPPS., 2014).

La transmisión persona a persona probablemente sea el mecanismo de difusión más importante y explica los casos esporádicos y los brotes aparecidos en centros geriátricos, residencias de militares y en guarderías, también se han descrito

la

posibilidad de diarrea aguda por adenovirus vinculadas al consumo de agua contaminada (Rivero y col., 2009).

No existe un tratamiento específico para las diarreas por Adenovirus. Básicamente se indican medidas de sostén como la Terapia de Rehidratación Oral (TRO) para prevenir la deshidratación, rehidratar y mantener el estado de hidratación, independientemente de la edad del paciente. Las Sales de Rehidratación Oral (SRO) con bajas concentraciones de glucosa y sodio, además de suplementos de zinc, constituyen los dos avances más recientes en el tratamiento de las enfermedades diarreicas, los cuales permitirán reducir el número de muertes por esta causa en la infancia (Pérez y col., 2009).

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El uso de probióticos es fundamental ya que permite restablecer la flora intestinal. Los probióticos son microorganismos vivos específicos, que al administrarse en cantidades adecuadas confieren un beneficio a la salud del huésped, ya que son capaces de sintetizar sustancias antimicrobianas, de competir por los nutrientes y receptores epiteliales de los enteropatógenos, así como estimular o modificar la respuesta inmune específica y no específica del huésped ante el patógeno (Zuccotti y col., 2008).

El Adenovirus fue descrito por primera vez como agente viral único por Rowe y col. en 1953, mientras intentaban establecer cultivos celulares de amígdalas y tejido adenoideo. Rowe reconoció que un agente transmisible estaba destruyendo a las células epiteliales. Actualmente, se conoce que los adenovirus causan con más frecuencia enfermedades del tracto respiratorio; sin embargo, dependiendo del serotipo infectante, puede causar otras enfermedades como diarrea aguda, conjuntivitis, cistitis, hepatitis y exantema (Bernaola y col., 2001).

Características del Virión: El Adenovirus es un virus de ADN, que mide de 60-90 nm de diámetro, su peso es de 175 – 182 KDa, no posee envoltura y su densidad de flotación es de 1,33 – 1,34 g/cm en cloruro de cesio. El virión tiene forma icosaédrica, está compuesto por un genoma de ADN doble cadena lineal de 36 – 44 kpb y 4 proteínas internas. Posee una cápside proteica constituida por 252 capsómeros, los cuales pueden ser de tres tipos morfológicos: pentones, hexones y un glicoproteína llamada fibra que se proyecta al exterior; la cual es utilizada como ligando de unión a los receptores celulares (PortoEspinoza y col., 2012).

Los exones limitan con 6 capsómeros y forman las caras triangulares del virión, contienen antígenos comunes a los adenovirus humanos, mientras que los antígenos

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presentes en la fibra son tipo – específicos, con especificidad de grupo (Bernaola y Luque., 2001).

El tropismo de Adenovirus por un tejido específico, aún no se encuentra muy claro, pero se presume que además de participar un serotipo específico, la puerta de entrada juega un papel muy importante para el desarrollo o no de cualquier enfermedad producida por este virus. Las diferencias entre los serotipos radican principalmente en el tamaño de la fibra y en la proteína que forma la base del pentón (Bernaola y Luque., 2001).

El mecanismo de infección celular y replicación viral, es lento. El virus se une a la célula a través de la interacción de la fibra con sus receptores celulares MHC – I y receptores coxsackie – adenovirus. La partícula del virus es internalizada a través de endocitosis mediada por clatrina. Después de la internalización, la proteína VI, se expone rápidamente y provoca una interrupción en el endosoma, por lo que la cápside parcialmente sin revestir puede entrar en el citoplasma, esto permite la liberación del virión en el citoplasma celular y su transporte hasta el núcleo de la célula a través de los poros nucleares. Una vez en el núcleo, el ADN viral es convertido en un complejo histonas celulares - ADN viral. La replicación del ADN ocurre en el núcleo, la proteína viral (TP) actúa como “primer” o cebador, las cápsides inmaduras y vacías son ensambladas en el núcleo celular, donde el core es formado por el ADN genómico y proteínas core asociadas (Graziano y col., 2012).

Expresión de los genes víricos durante el ciclo lítico Fase temprana: ocurre antes de la replicación del ADN vírico. Los genes tempranos (E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y E4) codifican proteínas esenciales involucradas en la regulación de la transcripción, replicación viral, y responsables de la transformación celular. El procesamiento post-transcripcional de los ARNm es complejo. Los ARNm maduros migran al citoplasma donde son traducidos a proteína (Pina., 2001).

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Fase intermedia: en este momento, se expresan, proteínas estructurales como pIX y pIVa2, las cuales intervienen en la estabilización de la estructura de la cápside (Pina., 2001)

Fase tardía: se caracteriza por la inhibición de la replicación y expresión de proteínas celulares, y la expresión de los genes víricos que codifican las proteínas estructurales (L1, L2, L3, L4 y L5). Los ARNm maduros se traducen en el citoplasma. Los polipéptidos estructurales son transportados hasta el núcleo donde se inicia el ensamblaje de las partículas víricas. Comienza la transcripción del hexón desde la región L3 del ADN viral y la síntesis de la proteasa de Adenovirus (AVP), la cual se sintetiza como una enzima inactiva (Graziano y col., 2012).

Los Adenovirus se caracterizan por su capacidad para suprimir la expresión del genoma de la célula hospedadora y por la importante síntesis de proteínas estructurales que tiene lugar en la misma. Esto tiene como consecuencia la acumulación de proteínas virales y subsecuente formación de cuerpos de inclusión, que interfieren en el normal funcionamiento de la célula (Mateo., 2002).

La proteína de la base del pentón (fibra) se asocia con una actividad lítica responsable del desprendimiento de monocapas celulares en cultivo. En los enterocitos llevan a una atrofia vellositaria e hiperplasia compensatoria de las criptas, con la consiguiente mala absorción y pérdida de fluidos. Por otro lado, la cápside es capaz de ejercer un efecto directo sobre la bicapa lipídica del endosoma provocando la liberación de su contenido al citosol (Mateo., 2002).

Interacciones Adenovirus – Célula Hospedadora Infección lítica: en este tipo de infección ocurre el ciclo replicativo completo. Se producen entre 10,000 y 1'000,000 partículas virales por célula, de los cuales 1-5% son infecciosas y se da en células epiteliales (Bernaola y Luque., 2001).

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Infección latente: es una infección crónica que puede reactivarse en paciente inmunocomprometidos y suele ocurrir en células linfoides. Este tipo de infección, produce la transcripción de factores que favorecen la producción de citoquinas inflamatorias (IL 8, ICAM 1, FNT alfa), y a su vez inhibir la apoptosis de las células hospedadoras en algunos casos (Bernaola y Luque., 2001).

Transformación oncogénica: ocurre únicamente al inicio de la replicación de la célula hospedadora, ya que algunos productos de los genes tempranos virales inhiben a los anti oncogenes. El ADN viral es aparentemente integrado y replicado con el ADN celular, no se producen viriones infecciosos. La proteína E1A se une a proteínas celulares alterando sus funciones (p105-RB, p53) e inhibe apoptosis por alteraciones del bcl-2 (Bernaola y Luque., 2001).

Investigaciones realizadas en el Estado Zulia por Bracho y col. en el 2008, expresan la importancia del agua en la transmisión de virus entéricos y su potencial riesgo para la salud. Explican que en Venezuela, uno de los virus ampliamente reportado como causante de gastroenteritis por consumo de agua contaminada es el Adenovirus, específicamente sus serotipos entéricos 40 y 41, los cuales han sido reconocidos como uno de los agentes etiológicos más importantes que causan diarreas en niños, y se cree que a nivel mundial es el principal responsable de los casos de gastroenteritis transmitidos por el agua en los que no se ha podido identificar el agente causal. En Maracaibo se presentan elevados índices de diarreas, hepatitis infecciosas y otras enfermedades debidas al agua y asociadas con ella.

En Maracaibo, Bracho en el 2010, reportó la presencia de Adenovirus 40 y 41 en el 100% de muestras de almejas y camarones, así como en el 90% de las aguas que analizaron, lo cual indica que las comunidades de nuestra ciudad se encuentran expuestas a la transmisión e infección por Adenovirus.

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Años atrás, la forma más eficaz de diagnosticar la presencia de virus en diferentes tipos de muestras era la microscopía electrónica; sin embargo, este método requiere mucho trabajo y gran cantidad de partículas virales intactas por mililitro de heces. En la actualidad se han desarrollado kits de detección de antígenos, como el inmunoensayo enzimático (EIA) ó la aglutinación en látex (LA), que a menudo son el método de elección para el diagnóstico de Adenovirus y Rotavirus, ya que son fáciles de utilizar, rápidos y sencillos (Logan y col., 2006).

Durante las últimas décadas se han desarrollado nuevas técnicas moleculares que permiten la detección de virus cuya replicación en cultivos celulares es nula o muy pobre, como es el caso de los Calicivirus, algunos Enterovirus y otros virus gastroenteríticos. Actualmente, el método más específico y exacto en la identificación de virus es la PCR y PCR - TR. (Wilderman y col., 2010).

Existen métodos moleculares como la Reacción en Cadena de la Polimerasa Transcripción Reversa (PCR – TR) con la que se ha podido aumentar hasta en un 48% el diagnóstico de Rotavirus y en un 200% el de Adenovirus, según lo reportado por Logan y col. en el año 2006. Esto hace que estos métodos moleculares altamente sensibles y los más utilizados para el diagnóstico de los agentes causales de diarrea (Logan y col., 2006).

Debido a la alta incidencia de diarreas en el Estado Zulia, se utilizó el método molecular de PCR para detectar la presencia de Adenovirus en muestras de heces de niños menores de 5 años con síndrome diarreico, pertenecientes a diferentes comunidades de nuestro estado, con la finalidad de proponer estrategias sanitarias acordes que permitan disminuir el número de casos de diarrea causada por este virus y mejorar la calidad de vida de nuestra población.

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OBJETIVOS

Objetivo General Determinar la presencia de Adenovirus en muestras de heces procedentes de niños con diarrea menores de cinco (5) años de diferentes comunidades de Maracaibo, Edo. Zulia, Venezuela.

Objetivos Específicos 1.- Detectar mediante Técnicas Moleculares (PCR), la presencia de Adenovirus en muestras de niños menores de cinco años con diarrea.

2.- Comparar la prevalencia de infección por Adenovirus entre los pacientes con diarrea aguda hospitalizados y no hospitalizados.

3.- Identificar factores de riesgos existentes en las comunidades a objeto de estudio y su posible asociación con la presencia de Adenovirus.

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METODOLOGÍA Recolección y almacenamiento de muestras: El material de estudio está constituido por 2 grupos que comprendieron 120 pacientes, de ambos sexos con edades comprendidas entre cero y cuatro años. El primer grupo estuvo constituido por pacientes hospitalizados pertenecen al Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo (SAHUM) y el segundo por pacientes no hospitalizados a diferentes comunidades del estado Zulia: Santa Rosa de Agua, Gibraltar y Nazareth. Se recolectaron las muestras de heces de los niños en envases de orina, bien tapadas e identificadas con un número y fecha correspondiente. Estas fueron trasladadas en una cava con hielo para su refrigeración, al Laboratorio Regional de Referencia Virológica de la Facultad de Medicina de la Universidad del Zulia y conservadas a -20 °C hasta su procesamiento.

Recolección de información: se solicitó por escrito el permiso del representante de cada menor para la toma y posterior procesamiento de la muestra de heces, siguiendo las normas del Código de Bioética y Bioseguridad del FONACIT Capítulos 1 y 2. Simultáneamente se llenó la historia clínica del paciente, la cual contiene diferentes datos que permitieron conocer los factores de riesgo presentes en la población, información necesaria para relacionarla con la presencia del virus y el síndrome diarreico (Wilderman y col., 2010).

Criterio de Inclusión: Niños menores de 5 años con proceso diarreicos agudos de diferentes comunidades del estado Zulia, hospitalizados o no.

Criterios de Exclusión: Niños mayores de 5 años sin diarreas o con procesos de diarreas agudas.

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Controles: Como controles negativos, se utilizó heces de 18 niños menores de 5 años que no presentaban diarrea (en los cuales no se detecto Adenovirus) y una muestra negativa facilitada por el Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC). Como controles positivos se utilizó una muestra positiva facilitada por el IVIC.

Metodología Diagnóstica: se realizó una suspensión de las muestras fecales al 10%, para ello, se mezcló en solución salina al 0,9% aproximadamente 0,1g de heces sólidas ó 100µL de heces líquidas. Luego la suspensión se dejó en reposo por 10 minutos a temperatura ambiente y se centrifugó a 8.000 xg por 2 minutos. Posteriormente el sobrenadante obtenido se trasvasó a un tubo eppendorf de 2mL estéril y se guardó a -10°C en un congelador hasta su posterior utilización en la extracción del ácido nucleico (Pérez y col., 2011).

Extracción de ADN viral: la extracción se llevó a cabo mediante el estuche comercial de purificación de ADN Qiagen (QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook), siguiendo las indicaciones del fabricante. Basado en una limpieza del clarificado fecal, utilizando Proteinasa K y varias centrifugaciones, lo cual permitió que el ADN fuese selectivamente separado de agentes contaminantes y restos celulares, y lavados a través del uso de soluciones tampones, que permiten remover eficientemente proteínas y otros inhibidores. Se obtuvo el ADN total para su posterior utilización en cualquier técnica molecular a desarrollar.

Para la extracción de ADN viral, se agregaron 200µL del clarificado fecal, 20µL de proteinasa K y 200µL de solución tampón AL en un tubo eppendorf estéril de 1,5mL, esto se mezcló por 15 segundos y se incubó a 56°C por 10 minutos en un baño maría. Posteriormente, se centrifugó a 6000 x g, se adicionó 200µL de etanol (10%). Se mezcló por 15 segundos y se centrifugó a 6000 x g.

De la solución obtenida, se vertieron 600µL por las paredes del tubo que contiene la columna, y se centrifugó a 800 x g durante 1 minuto. Luego se extrajo la columna, se descartó el sobrenadante y se colocó un tubo de colección nuevo.

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Posteriormente se agregaron 500µL de buffer AW1, y se centrifugó a 8000 x g durante 1 minuto. Se colocó la columna en un tubo nuevo y se añadieron 500µL de AW2, centrifugando a 13000 x g durante 3 minutos. El sobrenadante fue descartado y el tubo de colección cambiado y se centrifugó a 13000 x g por 1 minuto para eliminar los restos del buffer.

Para culminar la elución, se colocó la columna en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5mL, se agregó directamente 50µL de buffer AE en la membrana, se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos, centrifugando a 13000 x g por 1 minuto. Repitiendo en el mismo tubo este paso, se descartó la columna y se almacenó el tubo con la muestra extraída a -10°C hasta su posterior procesamiento.

Amplificación del ADN viral por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): una vez obtenido el ADN, se procedió a amplificarlo mediante PCR, empleando el kit “PCR Master Mix” (Promega), el cual contiene: dNTP’s (400µM, dATP, 400µM, dGTP, 400µM, dCTP, 400µM, dTTP), MgCl2 (3mM) y ADN Polimerasa (5 U/µL) (Promerga Corp. 2005) y el par de iniciadores; AdH 40 y AdH 41 descritos por Allard y col., (1990) para Adenovirus (Tabla 1).

Tabla 1. Iniciadores utilizados para la amplificación de Adenovirus Virus Ad 40 Ad 41

Región Ad40 (hexón) Ad41 (hexón)

Posición 1885818883 1913619158

Primer hexAA1855

Secuencia 5'GCCGCAGTGGTCTTACATGC ACATC-3' hexAA1913 5'CAGCACGCCGCGGATGTCAA AGT-3' Fuente: Allard y col., 1990.

Tamaño 300pb

Los iniciadores específicos externos para detectar adenovirus fueron seleccionados a partir de estudios previos de Allard y col., (1990). Los iniciadores externos hexAA1885 y

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hexAA1913 flanquean la región comprendida entre los nucleótidos 18858 y 19158 de Ad2, dentro del gen que codifica la proteína hexón de la cápside viral.

Para cada muestra se preparó un tubo de reacción de 25 μL, el cual contenía los volúmenes de reactivos especificados en la tabla 2.

Tabla 2. Volúmenes de Reactivos empleados para la Reacción de Amplificación por PCR. Reactivo Volumen Master Mix 12.5 μL AD 40 0.6 μL AD 41 0.6 μL Muestra 3.0 μL Agua libre de nucleasas 8.3 μL 25.0 μL Volumen Total Éstas reacciones, se llevaron a cabo en un termociclador GeneAMP PCR System 2400 (Perkin Elmer), empleando el programa de PCR estandarizado: Desnaturalización a 94°C por 4 minutos, Amplificación de la secuencia blanco (PCR) 40 ciclos a 92°C por 90 seg, 55°C por 90 seg y 72°C por 2 minutos; Extensión final: 72°C por 10 minutos. Almacenado a 4°C hasta su visualización (Bracho, 2010).

Los productos amplificados fueron analizados a través de electroforesis horizontal en gele de agarosa al 2% en buffer TBE 1X (Tris base 90 mM – EDTA 2.4 mM – Ácido bórico 90mM) y 0,5 µg/µL de bromuro de etidio. Las condiciones de corrida de la electroforesis fueron: 100V, 500 mAmp, 250 Power, durante 45 minutos (Wilderman y col., 2010). Una vez culminada la corrida, se observó las bandas electroforéticas en el gel, mediante un equipo de foto documentación UVP Digi Doc -It™ Imaging System.

Como marcador de peso molecular se empleó el marcador de 1 Kb DNA plus de Promega (Promega Corp., Madison, WI, USA). (Bracho y col., 2008). Para cada gel se empleó un pozo para dispensar el marcador, uno por cada control positivo, control negativo y muestra respectivamente, añadiendo 10 µL de cada uno de ellos.

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Factores de Riesgo: para conocer las condiciones de salubridad de la población estudiada, se aplicó el método de observación directa y encuesta por parte del investigador, donde se tomaron datos en una planilla como por ejemplo: tipo de agua consumida, lavado de manos, tipo de alimentación (Anexo 1).

Análisis Estadístico de los Resultados: Se realizó un análisis porcentual de las variables, donde los datos estadísticos obtenidos se ingresaron en una base de datos Excel 2010 para su posterior análisis en el programa SPSS versión 21.0. Se calcularon los promedios, mediana y desviación Standard, tabla de contingencia de 2x2 y Ji cuadrado y se efectuaron pruebas de significancia estadística, exigiendo una p 0,05 (no hay diferencia significativa) En una investigación realizada en Ghana en el año 2007 por Weitzel y col, se comparó la sensibilidad para el diagnóstico de AdH de la inmunocromatografía y la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR por sus siglas en inglés), donde se observó que la concordancia diagnóstica entre ambas técnicas era de un 66%. El valor predictivo positivo arrojado por la inmunocromatografía variaba en un 36% y el negativo en un 74%, concluyendo que la PCR es la metodología de elección para realizar el diagnóstico (Weitzel y col 2007).

En este estudio, se demuestra que la metodología empleada (PCR) resultó ser exitosa para la detección de Adenovirus en muestras de heces, observando las bandas electroforéticas discretas de tamaño esperado 300pb, en los casos positivos comparándose con el marcador de peso molecular de 1Kb de Promega corp (Figura 7).

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A su vez, se observan bandas inespecíficas en la parte inferior del gel, la cual corresponden a un exceso de primer o cebador.

PM + + + + + C- C+

Banda Nº9 / 300pb 

Figura 7. Electroforesis en gel de agarosa al 2% de Adenovirus 300pb. Sin embargo, es pertinente mencionar que la prueba rápida para la detección del antígeno de los Adenovirus en las heces es sencilla, económica y sensible, por lo que este recurso de diagnóstico puede favorecer a los enfermos. Por ser un recurso óptimo para reconocer de manera precoz y veraz el agente causal de la diarrea aguda para dar al enfermo el tratamiento no solo adecuado sino de excelencia (Luna y col., 2013).

En relación a la incidencia de infección por Adenovirus según edad, los resultados de este estudio demostraron que no hubo diferencia estadísticamente significativa entre estos pacientes. De igual manera la incidencia de infección por Adenovirus según sexo tampoco mostró diferencia estadísticamente significativa.

Los pacientes más afectados fueron menores de 1 año de edad con un 30,3% de positividad para el AdH, seguido por el grupo de 3 – 4 años con 21,0%, como se observa en la tabla 4, similar a lo registrado en un estudio realizado por Domínguez y col (2009), donde la incidencia del virus fue de 31,5% en niños menores de 2 años.

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Tabla 4. Frecuencia de Adenovirus según la edad en niños menores de 5 años con síndrome diarreico. Edad (Años) Total % Negativos Positividad para Adh % 33 (100%) 23 (69,7%) 10 (30,3%) 0,05 (no hay diferencia significativa) En esta investigación no hubo diferencia significativa entre el sexo femenino y masculino. El sexo femenino estuvo representado por 53 casos (51,9%), mientras que el sexo masculino tuvo 49 casos (48,1%). Con respecto a los casos positivos sólo se observaron 11 casos (20,7%) en la población femenina; mientras que en la masculina se obtuvieron 10 casos (20,4%), para un total de 21 casos. Esta investigación difiere de lo reportado por González y col (2011), los cuales manifiestan, que los varones son más susceptibles a las infecciones por AdH 40/41, pues obtuvieron un

46% de

positividad para los niños y un 30% para las niñas. Sin embargo, en esta investigación ambas poblaciones fueron afectadas de manera similar como se observa en la Figura 8.

60,00% 50,00% 40,00% 30,00% 20,00%

51,90% 20,70%

48,10% 20,40%

Negativos Positivos

10,00% 0,00%

Femenino

Masculino

Figura 8.- Frecuencia de Adenovirus según el sexo en niños menores de 5 años con diarrea aguda Se analizó la relación entre los casos positivos para Adenovirus y las manifestaciones clínicas que presentaron estos pacientes, datos que fueron obtenidos mediante la

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realización de la historia clínica. En esta investigación, se obtuvo que el síntoma más frecuente fue la diarrea con un 66,6%. En el caso de los pacientes hospitalizados el síntoma más frecuente fue la diarrea con un 42,8%, seguido por la dupla Vómito/Fiebre con un 28,6% respectivamente.

Los resultados obtenidos, llaman mucho la atención, pues se observa una diferencia estadística significativa, entre los síntomas presentados por los pacientes estudiados. En la tabla 5, se evidencia que los pacientes que presentan Adenovirus, tenían diarrea, vómito y fiebre. Mientras que los pacientes que no presentaban el virus, sólo padecían de diarrea. Los resultados del presente estudio son muy similares a los descritos por otros investigadores, como Luna y col (2013), donde las manifestaciones clínicas predominantes de una gastroenteritis por Adenovirus son diarrea, vómitos y fiebre.

Tabla 5. Relación entre la detección de Adenovirus y síntomas más frecuentes. Presencia de Adh

Si No Total

Síntomas más Frecuentes en Pacientes con Adh Diarrea Vómito - Fiebre No Total Especifica

9 (42,8%) 6 (28,5%) 6 (28,5%) 59 (72,8%) 0 (0%) 22 (27,2%) 68 (66,6%) 6 (5,8%) 28 (27,4%) x2 : 25,4; GL: 2; p < 0,05 (Si hay diferencia significativa)

21 (100%) 81 (100%) 102 (100%)

Cermeño y col., 2008 en Ciudad Bolívar, Venezuela realizaron un estudio para determinar la etiología de diarrea aguda en niños menores de 5 años que asistieron a la emergencia pediátrica del Hospital Universitario Ruiz y Páez. Investigaron la presencia de virus, bacterias y parásitos en 110 muestras de heces diarreicas, y reportaron dentro de los agentes virales (11/110) 10% positivos para Rotavirus y (3/110) 2,7% para Adenovirus; presentando (100/110) 90,9% pacientes, diarrea aguda y ninguno presento deshidratación.

Una vez realizada la comparación de la frecuencia de detección de infección por Adenovirus entre los pacientes con diarrea aguda hospitalizados y no hospitalizados; se identificó los factores de riesgo presentes en el ambiente del paciente estudiado y su

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posible relación con la presencia o ausencia del Adenovirus. Para lo cual utilizamos las variables del agua consumida, el tipo de alimentación de los pacientes y el lavado de manos por parte de los familiares de los niños estudiados.

A nivel mundial la mayoría de los brotes de enfermedades transmitidas por el agua han estado relacionados con la presencia de virus entéricos capaces de causar infección, los cuales han mostrado una alta resistencia a los tratamientos de desinfección y potabilización del agua (Bracho y col., 2008).

Se estudió la relación entre los pacientes positivos para Adenovirus y el agua que consumían. Se encontró que el 47,6% de los casos positivos (10/21) toma agua embotellada/filtrada, 28,6% de los casos (6/21) embotellada/hervida, el 4,7% de los casos (1/21) agua hervida/filtrada y el 19% (4/21) de los casos no especifica (Tabla 6). Cabe destacar que el menor porcentaje de positividad para el Adenovirus es el de los pacientes que consumen agua filtrada/hervida, por lo que se evidencia que hervir el agua disminuye en gran porcentaje la presencia de microorganismos en la misma.

En esta investigación no se encontró una diferencia estadística significativa entre el tipo de agua consumida por el paciente en estudio y la presencia o ausencia del Adenovirus. Sin embargo la significancia estadística encontrada fue de un 0,07, muy cercano a lo planteado en esta investigación (p 0,05 (no hay diferencia significativa)

Total

21 (100%) 81 (100%) 102 (100%)

La relación entre el lavado de manos de los familiares de los pacientes y la presencia de Adenovirus en los pacientes estudiados, el 85,7% (18/21) de los familiares, refieren lavarse las manos antes de preparar alimentos, luego de cambiar pañales y después de ir al baño y el 14,3% (3/21) no se lava las manos (Tabla 7).

La práctica de lavarse las manos, disminuye en gran proporción las probabilidades de la transmisión del Adenovirus, puesto que el principal mecanismo de transmisión de los virus productores de diarrea aguda (Rotavirus, Adenovirus, Astrovirus, Calicivirus) es a través de la vía fecal-oral. Otra vía de diseminación es a partir de diversos vehículos como las manos y superficies inanimadas, donde el virus puede sobrevivir horas e incluso días, lo cual se observa principalmente en el caso de Rotavirus y de Calicivirus (Wihelmi., 2001).

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Tabla 7. Relación entre la detección de Adenovirus y el lavado de manos Positividad para Adh

Lavado de Manos Si No

Total

18 (85,7%) 3 (14,3%) 21 (100%) 58 (71,6%) 23 (28,4%) 81 (100%) 76 (74,5%) 26 (25,5%) 102 (100%) X2: 1,78 ; GL: 1; p:1,74; p > 0,05; (no hay diferencia significativa) Si No Total

Los resultados obtenidos en esta investigación, difieren de lo reportados por Lacasa y col en 2012., ya que éstos concluyeron que los padres de los pacientes estudiados no se lavaban las manos con regularidad y por ello el Adenovirus podía transmitirse con mayor facilidad. Sin embargo en la presente investigación, como se observa en la tabla 9; la mayoría de los padres de los pacientes estudiados, se lava las manos al momento de atenderlos, por lo cual evidenciamos en este caso, que el virus puede transmitirse, así las manos sean lavadas y esto puede deberse a una mala técnica de lavado de manos, como lo refiere Rivero y col (2009).

En el 2013, Flores y col. realizaron una investigación en el Hospital Josefina Martínez de Ferrari, ubicado en la región Metropolitana de Chile; en pacientes con infecciones respiratorias producidas por Adenovirus, donde explican que las infecciones ocasionadas por este virus asociadas a la atención de salud ocurren por incumplimiento de las normas de control de infecciones intrahospitalarias como las medidas de aislamiento, el lavado de manos o por la inapropiada limpieza de los utensilios o instrumentos médicos que se utilizan en la atención del paciente.

Es importante señalar, que la usencia o presencia de Adenovirus y otros virus productores de gastroenteritis en los niños, depende en parte de su alimentación con leche materna, lo cual se comprueba con la investigación realizada por Rivero y col. en el 2009, donde no se encontró Adenovirus en las muestras analizadas, ya que la mayoría de la población estudiada era alimentada exclusivamente con leche materna.

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Esta investigación concuerda con lo anteriormente expuesto ya que los mayores porcentajes de con respecto a la ausencia de Adenovirus entéricos, lo presentan los pacientes que reciben lactancia materna exclusiva ó lactancia materna más alimentación complementaria 41,9% y 23,5% respectivamente. Esto puede atribuirse a que la leche materna posee oligosacáridos protectores contra la infección causada por virus Rivero y col., (2009) (Tabla 8).

Tabla 8. Relación entre la detección de Adenovirus y tipo de alimentación. Presencia de Adh

Si No Total

Tipo de Alimentación

Total

Materna Exclusiva

Destete

Materna Complementa ria

Complementa ria

No Especifica

7 (33,3%)

1 (4,7%)

9 (42,8%)

2 (9,5%)

2 (9,5%)

21 (100%) 34 (41,9%) 6 (7,4%) 19 (23,5%) 9 (11,1%) 13 (16,0%) 81 (100%) 41 (40,1%) 7 (6,8%) 28 (27,4%) 11 (10,7%) 15 (14,7%) 102 (100%) X2:: 3,28; GL: 4; p:0,51; p>0,05 (no hay diferencia significativa)

La leche materna posee otros factores capaces de proveer protección a nuevas infecciones, tales como: lactoferrina, lisozimas, complementos, factores bifidus, peroxidasa, antitripsina e interferón. La presencia de los inhibidores de la tripsina presentes en la leche materna y en el intestino, podrían ser responsables, de desencadenar la replicación viral, y su ausencia implicaría la inhibición de este proceso. Además linfocitos y macrófagos podrían jugar un papel importante en la proporción de la inmunidad (Rivero y col 2009). En el presente estudio las muestras analizadas provenían de niños alimentados casi exclusivamente con leche materna, debido a que se trata de una población de escasos recursos que difícilmente puede adquirir leche maternizada o completa para alimentar a sus niños.

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CONCLUSIONES 1. El Adenovirus fue detectado en 21 casos (20,2%) de los 120 pacientes estudiados menores de 5 años con síndrome diarreico hospitalizados y no hospitalizados.

2. El grupo etario mayormente afectado en este estudio fueron niños menores de un año. 3. Los factores evaluados no fueron determinantes en la presencia del virus en los grupos estudiados.

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RECOMENDACIONES 1. Ampliar a futuro la investigación, aumentando el número de muestras y período de muestreo, para establecer si existe variación de la presencia del Adenovirus entre hospitales, clínicas, ciudades, zonas rurales, condiciones climatológicas y de la zona geográfica en nuestro país.

2. Realizar historia clínica que incluya datos socioeconómicos como, condiciones de la vivienda, disponibilidad de agua, recolección de basura, para estudiar como estos factores pueden influir en la infección por Adenovirus.

3. Realizar mediante la reacción en cadena de la polimerasa, la serotipificación de los Adenovirus entéricos 40 y 41, y así determinar cuál de éstos serotipos es más frecuente como agente causal de síndrome diarreico en los niños.

4. Educar a la población mediante charlas, que incluyan las diferentes medidas de prevención, para evitar el contagio y propagación de los Adenovirus y otros virus causantes de síndrome diarreico, la importancia de alimentar a los niños con leche materna, ya que esta aumenta la resistencia a la infección por Adenovirus. 5. Utilizar técnicas diagnósticas más sensibles y precisas como Nested PCR o RT – PCR para la detección de virus productores de diarrea aguda.

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REPUBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE BIOANALISIS LABORATORIO REGIONAL DE REFERENCIAS VIROLOGICAS

TRABAJO DE INVESTIGACIÓN DETECCIÓN MOLECULAR MEDIANTE PCR DE ADENOVIRUS EN MUESTRAS DE HECES DE NIÑOS MENORES DE 5 AÑOS CON SÍNDROME DIARREICO Nombre y Apellido:_________________ Edad:________ Sexo:____________ Dirección:_______________________________________________________ Teléfono:_____________ Familiar de contacto:_________________________ Procedencia: _________________________________ Fecha de Reporte: ___________________________ Diarreas: Si___ No___ Fecha de inicio de la Diarrea: ____________________ Tipo: Aguda ___ Persistente ___ Crónicas ___ FACTORES DE RIESGO: Disponibilidad de Agua: Potable ___ Acueducto ___ Camión Cisterna ___ Embotellada ___ Hervida ___ Almacenamiento. Pipas____ Tapadas_____ Limpia____ otras____ Frecuencia del Lavado_____ Si el agua es almacenada usa cucharones: Si ___ No ___ Lavado de Manos: Antes de Preparar los alimentos: Si ___ No ___ Después de cambiar el Pañal al Bebe: Si ___ No ___ Después de ir al Baño: Si ___ No ___ Disposición de Excretas: Letrinas: ___ Campo Abierto: ___ Red de Cloacas: ___ Estado Nutricional: __________Lactancia Materna Actual: ________________ Antecedentes de Alimentación: Materna Exclusiva ___ complementaria ___ Destete ___ ANTECEDENTES PERSONALES: Motivo de Consulta: ______________________________________________ Enfermedad Actual: ______________________________________________ Deshidratación: Si___ No ___ Vomito: Si ___ No ___ EXAMEN FISICO: Peso:______grs Talla:_____ Temperatura: ______ Tos: _____ Rinorrea: _____ Resultado _____________________________ Observaciones________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ _____________________________________

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REPUBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD DE MEDICINA LABORATORIO REGIONAL DE REFERENCIA VIROLOGICA

CONSENTIMIENTO PREVIA INFORMACION En el laboratorio Regional de Referencia Virológica de la Facultad de Medicina, instituto Investigaciones Clínicas “Américo Negrette”, se esta realizado el proyecto de investigación titulado. “DETECCIÓN MOLECULAR MEDIANTE PCR DE ADENOVIRUS EN MUESTRAS DE HECES DE NIÑOS MENORES DE 5 AÑOS CON SÍNDROME DIARREICO”.Con el objeto de determinar la presencia de Adenovirus en muestras de heces diarreicas de niños menores de 5 años, determinar la prevalencia de infección por este virus y relacionar los factores de riesgo presentes en el ambiente con la presencia o ausencia del virus. Yo_________________________________________ C.I___________________________ Nacionalidad:__________________________ Estado Civil:_____________ Domiciliado en:_______________________________________________________________________ Representante Legal del Niño:________________________________________ Edad:____ Siendo mayor de 18 años en USO pleno de mis facultades mentales y sin que medie coacción ni violencia alguna en completo conocimiento de la naturaleza, forma, duración, propósito, inconvenientes y riesgo relacionados con el estudio que mas abajo indico. Declaro mediante la presente. 1.- Haber sido informado de manera clara y sencilla, por parte del grupo de investigadores del laboratorio regional de referencia virológica, coordinado por el MgSc. Ricardo J Atencio T. de todos los aspectos relacionado al proyecto titulado “DETECCIÓN MOLECULAR DE ADENOVIRUS EN NIÑOS MENORES DE 5 AÑOS CON SINDROME DIARREICO RESIDENTES DEL MUNICIPIO JESUS ENRIQUE LOSSADA” 2.- Tener conocimiento claro de que el objetivo fundamental del trabajo antes señalado. Es determinar la presencia del Adenovirus y su relación con las manifestaciones clínicas. Utilizando las técnicas de biología Molecular (PCR) Reacción de la Cadena de la polimerasa. 3.- Que estoy de acuerdo en el USO, para fines de investigación, de los resultados obtenidos en el presente estudio. 4.- Que mi participación en dicho estudio no implica riesgo ni inconveniente alguno para mi salud. 5.- Que bajo ningún concepto se me ha ofrecido ni pretendo recibir algún beneficio de tipo económico producto de los hallazgos que puedan producirse en el referido proyecto de investigación. 6.- que los resultados de las pruebas me serán entregados oportunamente. 7.- Que el equipo de investigadores me ha garantizado absoluta confidencialidad relacionado tanto a mi identidad como de cualquier información relativa a mi persona a la que tenga acceso por concepto de mi, participación en el proyecto antes mencionado.

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DECLARACION VOLUNTARIA Luego de haber leído, comprendido y recibido la respuesta a mis preguntas con respecto a este formato de consentimiento y por cuanto mi participación en este estudio es totalmente voluntario acuerdo: A.- Aceptar las condiciones estipuladas en el mismo y a la vez autorizar al equipo de investigadores del Laboratorio Regional de Referencia Virológica a realizar el referido estudio con las muestras de heces de mi representado. B.-Reservarme el derecho de revocar esta autorización así como mi participación en el proyecto, en cualquier momento, sin que ello conlleve algún tipo de consecuencias negativas para mi persona y mi representado.

Firma del Voluntario Responsable ________________________

Firma de Investigador __________________________

Declaración de Investigador. Luego de haber explicado detalladamente al voluntario la naturaleza del protocolo mencionado, certifico mediante la presente que, a mi leal saber, el sujeto que firma este formulario de consentimiento comprende la naturaleza, requerimiento, riesgo y beneficio de la participación en este estudio. Ningún problema de índole medico, de idioma o de instrucción ha impedido al sujeto tener una clara comprensión de su compromiso con este estudio. Esta investigación permanecerá en constante evaluación desde la facultad del manejo de los individuos bajo estudio, con el fin de preservar la integridad física y sicológica de los niños, resguardando sus derechos humanos por parte de la Comisión de bioética Medicina de la Universidad del Zulia.

Lugar y Fecha.