Detección y tratamiento de Vibrio cholerae O1 variedad rugosa presente en agua María Teresa Orta de Velásquez 1 Víctor Díaz Pérez 2 Gerardo Aparicio Ozores 1 Araceli López

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Instituto de Ingeniería, UNAM Edificio 5 de Hidráulica. Ciudad Universitaria, apartado postal 70-472, Coyoacán 04510, México, D.F. 2 Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, IPN Subdirección académica, apartado postal 4870, Casco de Santo Tomás 06400, México, D.F.

RESUMEN

Este trabajo engloba los resultados finales obtenidos después de varios años de investigación en el tema de desinfección de agua potable. El punto de partida se estableció al presentarse el problema de brotes de cólera en diferentes puntos geográficos, tanto en México como en Latinoamérica. El cólera es una enfermedad intestinal bacteriana aguda y grave causada por el Vibrio cholerae 01, biotipo clásico ó El Tor. Puesto que una fuente de propagación de dicha enfermedad es el agua, este estudio se inicio, investigando la posibilidad de adaptación de una cepa rugosa de Vibrio cholerae 01 presente en agua de manantial. Esta variedad se seleccionó porque ha sido detectada como la causante de casos clínicos y la de mayor problema por su resistencia en el ambiente. La cepa de la bacteria V. cholerae O1 se aisló de la planta de bombeo “Lago” ubicada en la Ciudad de México. La identificación se llevó a cabo desarrollando la técnica de cromatografía de gases; para ello se utilizó un estándar de ácidos grasos reportados para V. cholerae. Lo anterior se corroboró mediante el sistema miniaturizado API 20E usando como referencia una cepa tipificada de V. cholerae O1 El Tor Ogawa variedad rugosa; la tipificación la realizó el Instituto Nacional de Diagnóstico de Referencias Epidemiológicas (INDRE). La experimentación comprobó que la bacteria sufre un proceso de adaptación al cloro modificándose su comportamiento, agrupándose y secretando un polisacarido (Morris, et al, 1996). 4

A una concentración inoculada de V. cholerae de 10 , la concentración subletal de cloro residual a la cual se adaptó fue de 1.3mg/L con un tiempo de contacto de 30 minutos. Así también se comprueba que la bacteria sufre un proceso de regresión adaptativa al dejar de estar sometida a una dosis constante de cloro. Lo anterior explica, que a una concentración de cloro residual de 0.9mg/L y con 15 minutos de tiempo de contacto la cuenta viable de UFC de V cholerae O1 variedad rugosa sea cero. La alternativa con ozono se estudio en un reactor batch de 1L, alimentado con agua de manantial 4 inoculada con 10 UFC de V. cholerae. La dosis de ozono para obtener cero de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) fue de 1.7 mg/L y tiempo de contacto de 8 min.

METODOLOGIA

A continuación se describen cada uno de los pasos seguidos durante la experimentación que se llevó a cabo en el laboratorio de Ingeniería Ambiental en el Instituto de Ingeniería de la UNAM. La secuencia seguida fue: primero aislar la cepa de muestreos de agua residual del gran canal de la Ciudad de México y posteriormente favorecer su crecimiento en medios enriquecidos y subsiguientemente utilizar medios selectivos. La identificación se llevó a cabo mediante cromatografía de gases y el sistema convencional API 20E; la referencia usada fue la cepa de V. cholerae O1 El Tor Ogawa proporcionada por el Instituto Nacional de Diagnóstico de Referencias Epidemiológicas. Se realizaron pruebas desinfección con ozono utilizando una dosis de 1.7mg/L la cual se aplicó a un volumen de agua de manantial de 1L inoculada con V. cholerae O1 variedad rugosa Las pruebas de cloro se realizaron en dos etapas; la primera consistió en evaluar la capacidad de adaptación al cloro por parte de la bacteria utilizando un rango de concentración de cloro residual entre 0.1 y 0.7mg/L con un tiempo de contacto de 30 minutos. Este experimento se hizo utilizando volúmenes de 100mL de agua de manantial inoculada con V. cholerae O1 rugosa. La segunda etapa consistió en someter en un reactor batch una concentración de cloro residual de cloro y diferentes tiempos de contacto agua de manantial inoculada con V. cholerae O1 variedad rugosa. Con ello se determinó la concentración efectiva de cloro residual y el tiempo de contacto para obtener la cuenta cero de UFC. Recuperación de V. cholerae Para recuperar la cepa de las aguas negras de la planta de bombeo se utilizó la técnica de hisopo de Moore según el Standard Methods y el manual de técnicas de CETEBES. En el laboratorio se procedió a utilizar la técnica de enriquecimiento según el Standard Methods y el manual de CETEBES. (Cleceri, et al. 1992; Sánchez, 1991). Identificación de V. cholerae Para identificar la cepa de V. cholerae se utilizó la metodología de extracción y esterificación de ácidos grasos de la pared bacteriana y su posterior inyección en el cromatógrafo de gases según la técnica desarrollada por el grupo de trabajo. Para la corroborar el resultado se procedió a utilizar el sistema miniaturizado API 20E utilizando la técnica descrita en el manual de diagnóstico microbiológico (Koneman, 1983; Yañes, I. 1998). Reto microbiano Para realizar estas pruebas se diseño la siguiente metodología: Se llenaron 14 frascos de dilución con 100mL de agua de manantial estéril cada uno, posteriormente se vertió un volumen de cloro especifico a cada frasco con lo cual se tenían diversas dosis de cloro libre; a continuación a cada frasco se le inoculó 2mL de una suspensión bacteriana preparada con anterioridad se dejo un tiempo de contacto de 30 minutos, y se tomaron 10mL del agua clorada que se vertieron en 30mL de caldo BHI, subsiguientemente se incubo a 37 ºC por 24 horas de los restantes 90mL se tomó una alicuota de 10mL y se procedió a medir el cloro residual por colorimetría según la técnica descrita el manual Hach. Al término de la incubación si el caldo presentaba una turbiedad mayor a la del inicio de la incubación se determinaba que había

crecimiento bacteriano posteriormente dicho crecimiento se identificaba por medio de API 20E para corroborar que se trataba de V. cholerae. Tratamiento con ozono La cepa retada se utilizó para preparar una suspensión bacteriana de 1L en agua de manantial estéril con una turbiedad similar al tubo 0.5 del nefelómetro de McFarland. Los tratamientos se realizaron con una dosis de ozono de 1.7mg/L, los tiempos de contacto fueron a los 0, 2, 4, 6, 8 y 10 minutos en dichos tiempos se tomaron alicuotas de 1mL en viales que contenían tiosulfato de sodio al 1%; de igual manera se tomaron otras alícuotas de 40mL a los mismos tiempos con el fin usarlas para medir el ozono residual usando la técnica colorimetrica de índigo sulfónico. Las alicuotas de 1mL se utilizaron para realizar cuentas viables, empleando las técnicas de microdilución y Miles-Mirsna. Para elaborar las pruebas testigo se procedió a realizar las mismas técnicas arriba descritas pero sin ozonar la suspensión bacteriana. Tratamiento con cloro Previo a estas pruebas la cepa adaptada de V. cholerae O1 El Tor Ogawa variedad rugosa fue sembrada 5 ocasiones en agar BHI con el fin de provocarle una regresión adaptativa. Se preparó una suspensión bacteriana de 1L con la cepa retada y la turbiedad del tubo 0.5 del nefelómetro de McFarland. Esta suspensión fue tratada con una dosis de cloro de: el tiempo de contacto fue de 30 minutos, durante este lapso se tomaron alicuotas de 1mL a los 0, 15 y 30 minutos. Cada alicuota se vertió en un vial que contenía 1mL de tiosulfato de sodio al 1%;en los mismos lapsos de tiempo se tomaban otras alicuotas de 200mL las cuales se utilizaron para medir el cloro residual según la técnica descrita en el Standard Methods. A las alicuotas de 1mL se les realizó cuentas viables utilizando las técnicas de microdilución y Miles-Mirsna. Las pruebas testigo tuvieron el mismo proceso descrito arriba sin aplicar cloro a la suspensión bacteriana. Caracterización del agua Para caracterizar el agua de manantial se determinaron los siguientes parámetros: pH, turbiedad, coliformes fecales y totales, dureza, conductividad, Carbono Orgánico Total, Sólidos disueltos Totales, nitratos y nitrógeno amoniacal. para obtener los valores de estos parámetros se aplicaron las técnicas descritas en el Standard Methods (Cleceri, et al. 1992).

RESULTADOS

Identificación de Vibrio cholerae

La figura 1, muestra los 13 picos característicos obtenidos para la bacteria aislada de aguas residuales, esta respuesta se obtuvo en 25 experimentos realizados.

Fig. 1: Cromatograma de los ácidos grasos de la pared bacteriana de la cepa de Vibrio cholerae O1 variedad rugosa aislada del ambiente

Fig. 2: Cromatograma de los ácidos grasos del estándar Reto microbiano. Pruebas batch en un volumen de 100mL de agua de manantial inoculada 4 con 10 UFC de Vibrio cholerae O1

Tabla 1: Primer pase del proceso de adaptación después de 30 minutos de tiempo de contacto. cloro residual (mg/L) sobrevivencia 0.1 + 0.2 + 0.1 + 0.3 + 0.8 + + presencia de crecimiento bacteriano - ausencia de crecimiento bacteriano

Tabla 2: Segundo pase del proceso de adaptación después de 30 minutos de tiempo de contacto. cloro residual (mg/L) sobrevivencia 0.3 + 0.2 + 0.2 + 0.3 + 0.7 + 0.8 + 0.7 + 0.8 + 0.8 + 0.8 0.8 1.0 1.1 1.1 + presencia de crecimiento bacteriano - ausencia de crecimiento bacteriano

Tabla 3: Tercer pase del proceso de adaptación después de 30 minutos de tiempo de contacto. cloro residual (mg/L) sobrevivencia 0.8 + 0.7 + 0.8 + 1.0 + 1.0 + 1.1 + 1.1 1.3 1.2 + presencia de crecimiento bacteriano ausencia de crecimiento bacteriano

Tabla 4: Cuarto pase del proceso de adaptación después de 30 minutos de tiempo de contacto. cloro residual (mg/L) sobrevivencia 0.7 + 0.8 + 0.7 + 0.8 + 0.8 + 0.8 + 0.8 + 1.0 + 1.4 1.5 + presencia de crecimiento bacteriano - ausencia de crecimiento bacteriano

Tabla 5: Quinto pase del proceso de adaptación después de 30 minutos de tiempo de contacto. cloro residual (mg/L) sobrevivencia 0.3 + 0.2 + 0.2 + 0.3 + 0.7 + 0.8 + 0.7 + 0.8 + 0.8 + 0.8 + 0.8 + 1.0 + 1.1 + 1.1 + + presencia de crecimiento bacteriano - ausencia de crecimiento bacteriano

Tabla 6: Sexto pase del proceso de adaptación después de 30 minutos de tiempo de contacto. cloro residual (mg/L) sobrevivencia 1.2 + 1.0 + 1.0 + 1.3 + 1.5 1.5 1.5 1.6 1.7 + presencia de crecimiento bacteriano - ausencia de crecimiento bacteriano

Tratamientos con ozono

Pruebas testigo (reactor con agua de manantial y sin ozono)

Tabla 7: Cuentas viables en log10, de las Unidades Formadoras de Colonias en las pruebas testigo.

Tiempo Repeticiones (min.) de la prueba 1 2 0 4.60 4.68 2 4.60 4.60 4 4.60 4.00 6 4.70 4.30 8 4.78 4.78 10 4.30 4.60

4 4.60 4.30 4.70 4.48 4.70 4.00

5 4.78 4.48 4.48 4.60 4.30 4.60

6 4.00 4.00 4.30 4.30 4.30 4.00

7 4.00 4.48 4.48 4.30 4.00 4.48

8 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.30

Figura 3: Gráfica que muestra las cuentas viables en log10 de UFC en las pruebas testigo.

5.00 UFC (log10)

4.80 4.60 4.40 4.20 4.00 3.80 0

2

4

6

tiempo (min)

8

10

Desinfección con ozono a una dosis de 1.7mg/L Tabla 8: Cuentas viables en log10 de la Unidades Formadoras de Colonias en los tratamientos de ozono a una dosis de 1.7mg/L

tiempo (min.) 0 2 4 6 8 10

Repeticiones del experimento 1 2 3.85 3.90 3.70 2.30 2.00 1.60 1.70 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00

UFC (log10)

Figura 4: Gráfica que muestra las cuentas viables en log10 de UFC en los tratamientos con ozono a una dosis de 1.7mg/L.

4.00 3.00 2.00 1.00 0.00 0

2

4

6

8

10

tiempo (min) Residual de ozono (mg/L) Tabla 9: Valores de ozono residual en el agua tratada con una dosis de ozono aplicada 1.7mg/L tiempo (min.) Promedio 0 0.07 2 0.01 4 0.15 6 0.17 8 0.15 10 0.06

Tratamientos con cloro

Pruebas testigo (reactor con agua de manantial y sin cloro)

Tabla 10: Cuentas viables en log10 de las Unidades Formadoras de Colonias en las pruebas testigo.

tiempo (min.) 0 5 15 30

Repeticiones de la prueba 1 2 3.78 4.60 4.00 4.00 3.30 3.30 3.30 3.00

3 4.00 4.00 3.78 2.95

UFC (log10)

Fig. 5: Gráfica que muestra las cuentas viables en log10 de las UFC en las pruebas testigo

5.00 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00 0

5

10

15

20

25

30

tiempo (min)

Desinfección con cloro, pruebas batch. (reactor con 1L de agua de manantial inoculado con 4 10 UFC de Vibrio cholerae O1, variedad rugosa).

Tabla 11: Cuentas viables en log10 de las Unidades Formadoras de Colonias

tiempo (min.)

Repeticiones del experimento 1 3.78 2.00 0.00 0.00

0 5 15 30

2 3.95 2.00 0.00 0.00

3 3.90 2.70 0.00 0.00

4 3.00 2.90 0.00 0.00

UFC (log10)

Fig. 6: Gráfica que muestra las cuentas viables en log10 en las pruebas de desinfección con cloro.

4.50 4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 0

5

10

15

20

25

30

tiempo (min)

Residual de cloro (mg/L) Tabla 12: Valores de cloro residual tiempo (min) Promedio 0 1.8 5 1.2 15 0.9 30 0.6 Caracterización del agua de manantial utilizada en los experimentos de desinfección con cloro y con ozono

Tabla 13: Valores promedio de la caracterización del agua de manantial Parámetro promedio de los valores determinados pH 7.5 turbiedad 0.22 UTN coliformes fecales 0/100mL coliformes totales 6/100mL conductividad 0.41 ms/cm dureza 1.5mg/L sólidos disueltos totales 0.13g/L COT 2.1mg/L nitratos 3.2 mg/L NO3nitrógeno amoniacal 0.14 mg/L N NH3

CONCLUSIONES

La desinfección de agua de manantial contaminada con Vibrio cholerae O1 variedad rugosa fue lograda después de 30 minutos de tiempo de contacto con una concentración de cloro residual de 0.9mg/L. En el agua de manantial, el intervalo estudiado de 0.1 a 1.7mg/L. de concentración de cloro residual la cepa rugosa de Vibrio cholerae O1, sufre un proceso de adaptación al cloro y puede resistir hasta una concentración subletal, de cloro residual de 1.3mg/L, después de 30 minutos de contacto. Se presenta como alternativa de desinfección la ozonación obteniendo cero UFC de la bacteria a una dosis de ozono de 1.7mg/L y un tiempo de contacto 8 minutos. En este trabajo se comprueba que una cepa aislada del ambiente presenta los mismos trece picos característicos de la bacteria aislada de enfermos por lo que se puede usar la cromatografía como técnica para análisis de agua De esto no existen antecedentes en la literatura internacional. Dicha técnica fue corroborada por el método convencional miniaturizado API 20E. La ventaja de la técnica se traduce en ahorro de tiempo ya que en 30 min. se tiene la respuesta contra la duración 24 a 48 horas por el método bioquímico API 20E, otra ventaja es tener una respuesta precisa eliminando la subjetividad de la apreciación del color por el analista. Por último podemos decir que se conjuntan los aspectos ingenieriles con los científicos. Ya que además de establecer la dosis de cloro residual necesaria para desinfectar el agua con Vibrio cholerae O1 variedad rugosa y se comprueba la capacidad de adaptación de la bacteria al cloro y la regresión adaptativa de la misma. Esto quiere decir que si la bacteria se encuentra expuesta a diferentes concentraciones de cloro residual (por ejemplo plantas de bombeo o tuberías de conducción) puede adaptarse y resistir concentraciones más altas de cloro residual. La misma bacteria después de determinado tiempo puede sufrir una regresión adaptativa si se encuentra en un medio favorable de temperatura (5 a 10 ºC o de 35 a 40 ºC), pH (7.6 a 8.6), salinidad (15 a 25º/00) y sin cloro

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS • • • • • • • •

Clesceri, L., Greenberg, A., and Trussell, R. 1992. Standard Methods for the examination of water and wastewater. American Public Health Association (APHA), American Water Works th Association (AWWA) and Water Environment Federation. Washington. 18 ed. Díaz, P.V. 1996. Tratamiento avanzado de cloro-ozono para agua de suministro con presencia de Vibrio cholerae. Tesis para obtener el grado de Licenciatura en Biología. ENEP Iztacala. UNAM. Koneman, E.W. 1983. Diagnóstico microbiológico. Médica Panamericana. México. Morris, G.J. Jr., Sztein, M.B., Rice, E.W., Nataro, J.P., Geneviere, A.L., Pinaki, P. Tacket, C.O. and Johnson, J.A. 1996. “Vibrio cholerae can assume-resistant rugose survival form that is virulent for humans”. The Journal of Infectious Diseases. University of Chicago. 174:13641368. Orta, M.T., Díaz, P.V., Aparicio, G. 1996. Desinfección de agua contaminada con Vibrio cholerae adaptada a cloro. Memorias del congreso Interamericano de Ingeniería Sanitaria y Ambiental. México. pp. 180. Orta, M.T. Díaz, P.V., Monje, I. 1998. Desinfección de efluentes de agua residual procedentes del tratamiento primario con químicos. Proyecto apoyado por la DGAPA. UNAM. Sánchez, P.S. 1991. Manual de métodos de aislamiento e identificación de Vibrio cholerae en aguas. Instituto de Tecnología del Agua (IMTA), Organización Panamericana de la Salud (OPS) y Compañía de Tecnología de Saneamiento Ambiental. México. Yañes, I. 1998. Aplicación del análisis por cromatografía gas-líquido como rutina en la identificación de Vibrio cholerae aislado de agua residual cruda. Tesis para obtener el grado de Maestría en Ciencias. UNAM.