XXVIII Congreso Interamericano de Ingeniería Sanitaria y Ambiental Cancún, México, 27 al 31 de octubre, 2002

USO DEL OZONO EN EL TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES PARA LA REMOCIÓN DE Vibrio cholerae FENOTIPO RUGOSO RESISTENTE AL CLORO *Orta de Velásquez Ma. Teresa Instituto de Ingeniería-UNAM. Es Doctora en Ciencias Químicas por la Universidad de Rennes, Francia. Actualmente se desempeña como Investigadora Titular en el Instituto de Ingeniería-UNAM. Ha desarrollado 38 proyectos, sobre tratamiento de agua potable, residual e industrial, además del manejo adecuado de los lixiviados y aprovechamiento de biogas de residuos sólidos. Ha publicado 39 artículos en revistas y memorias a nivel nacional e internacional, un libro y un manual. En 1992 obtuvo la repatriación de Investigadores y desde 1986 pertenece al SNI. Es profesora de asignatura en el posgrado de Ingeniería Ambiental y en la Fac. de Ingeniería de la UNAM. Yáñez Noguez Isaura Instituto de Ingeniería-UNAM Monje Ramírez Ignacio Instituto de Ingeniería-UNAM Rojas Valencia Ma. Neftalí Instituto de Ingeniería-UNAM

Instituto de Ingeniería-UNAM edificio 5, Coordinación de Ingeniería Ambiental Apdo. 70-472, Coyoacán. CP. 04510, México. D. F. E-mail [email protected] RESUMEN El uso del ozono para la eliminación de Vibrio cholerae O1 fenotipo rugoso resistente a cloro, fue investigado en aguas residuales de la Ciudad de México en donde ésta bacteria fue detectada y aislada. Las pruebas de desinfección se llevaron acabo en un efluente de tratamiento fisicoquímico avanzado inoculado con V. cholerae O1 fenotipo rugoso, la densidad bacteriana inicial fue del orden de 109 UFC/100 ml. Los resultados del estudio muestran un claro efecto desinfectante del ozono para eliminar bacterias patógenas como V. cholerae O1 fenotipo rugoso, además de otros indicadores como coliformes fecales alcanzando niveles por debajo de la norma de aguas residuales para riego agrícola (1000 UFC/100 mL; NOM-001-ECOL/1996). Con una dosis de ozono aplicada en fase gas de 117.3 mg O3/L de agua residual tratada, el fenotipo rugoso de V. cholerae O1 fue eliminado en su totalidad después de 12 minutos de ozonación. Con las condiciones experimentales utilizadas en el estudio, para alcanzar la dosis de ozono requerida en el proceso de desinfección, se necesita de una producción de ozono de 0.492 g O3/h. La calidad del efluente a ozonar fue de primordial importancia en la demanda ozono, por lo que es importante mejorar la calidad del agua, con la finalidad de reducir la dosis requerida de ozono. El uso del ozono como desinfectante es una alternativa al método tradicional de cloración, que de acuerdo con los resultados de esta investigación, puede garantizar una calidad de agua residual tratada libre de patógenos, por lo que puede ser reutilizada en forma segura en el riego agrícola. Palabras clave: Vibrio cholerae rugosa, ozono, desinfección, agua residual. INTRODUCCIÓN En México el reuso de aguas residuales de origen municipal en el riego agrícola se ha convertido en una práctica común, el uso más frecuente es la irrigación de hortalizas. No obstante de acuerdo con Jiménez et al., (1999), de los 48 m3/s que se producen aproximadamente en el Valle de México sólo la décima parte se somete a algún tipo de tratamiento. Las aguas residuales municipales son un reservorio importante de bacterias entéricas (cuadro 1). Entre ellas se encuentra V. cholerae, bacteria causal del cólera, una infección gastrointestinal grave que se transmite principalmente por vía hídrica y por el consumo de hortalizas irrigadas con aguas residuales no tratadas. La presencia de bacterias entéricas en efluentes municipales puede ser trascendente en la salud pública, aunque esto depende del estado fisiológico que presente la comunidad bacteriana en el agua residual (Rockabrand et al., 1999). Por

ejemplo, V. cholerae puede adoptar una forma de sobrevivencia conocida como el fenotipo rugoso. Representa una de las formas más virulentas y se caracteriza por la rugosidad de las colonias, morfología que se asocia a la secreción de polisacáridos extracelulares. La rugosidad puede representar una adaptación biológica normal de especies como V. cholerae que habitan ambientes estuarinos o marinos (Wai et al., 1998), aunque su presencia en otros ambientes acuaticos no ha sido confirmada (Afsar et al., 2000). Algunos estudios indican que el fenotipo rugoso de V. cholerae sobrevive a dósis de cloro de 1.3 mg/L (Orta et al., 1998) y 2.0 mg/L (Morris et al., 1996). Cuadro 1. Bacterias patógenas presentes en agua residual. Bacterias patógenas Enfermedad Sobrevivencia Dosis Densidad (días) Infectiva en agua (20-30°C) (NMP/100 mL) Coliformes fecales Gastroenteritis 60 8.8 X 108 (México) 4 7 Salmonella typhi Fiebre tifoidea 10 -10 Salmonella (1700 Salmonelosis 60 104-107 6.1 X 108 (México) serotipos) Vibrio cholerae Cólera 30 103-107 3 X 106 (México) Shigella flexneri 180 Shigelosis 30 (disentería) Shigella (4 spp) 10-180 Yersinia Yersiniosis enterocolitica Gastroenteritis Clostridium perfirgens Diarrea 1X1010 Streptococcos fecales Gastroenteritis Campylobacter jejuni Gastroenteritis

Fuente

Jiménez et al., 2000 Jiménez et al., 2000 Orta et al., 2000

Los cambios que sufren las bacterias patógenas para adaptarse a condiciones ambientales adversas demanda la evaluación y aplicación de métodos más efectivos para su tratamiento. Estudios recientes demostraron que el ozono es una alternativa prometedora para la eliminación de cepas de V. cholerae O1 fenotipo rugoso resistentes al cloro (Orta et al., 1998). Actualmente existe un interés creciente para su aplicación en el tratamiento de aguas residuales; como agente oxidante para la remoción de compuestos recalcitrantes ó como desinfectante en la eliminación de microorganismos patógenos, entre otras aplicaciones. El ozono es un fuerte oxidante que ha sido utilizado con éxito en plantas potabilizadoras de agua, en países como Italia (Collivignarelli et al., 2000), Francia (Lazarova et al., 1999) y Estados Unidos (Lee y Deinninger, 2000). En este contexto, el presente trabajo describe los resultados de una investigación orientada a: 1) Determinar la presencia de V. cholerae O1 fenotipo rugoso en agua residual del Gran Canal de la Ciudad de México y 2) Evaluar el proceso de ozonación como alternativa de tratamiento para la eliminación de V. cholerae O1 fenotipo rugoso en agua residual para reuso en el riego agrícola. METODOLOGÍA Aislamiento de V. cholerae O1 fenotipo rugoso en agua residual - V. cholerae (variedad lisa y rugosa) se aisló de agua cruda residual en el transcurso de 8 muestreos durante los meses de junio-julio-agosto en el Gran Canal de la Ciudad de México. La recuperación de la bacteria se obtuvo mediante la técnica de hisopo de Moore en medio Cary Blair, a partir del cual se promovió el crecimiento bacteriano en Agua Peptonada Alcalina doble concentración (APA [2]) durante 24 h. a 37°C. La selección del microorganismo se hizo en agar de Tiosulfato Citrato Bilis Sacarosa (TCBS) por siembra en estría cruzada a 37°C de temperatura durante 24 h. Las posibles colonias de V. cholerae elegidas, se resembraron en Agar Soya Tripticasa (TSA) a una temperatura de incubación de 28°C durante 24 h, se practicó la prueba de oxidasa a los cultivos y se conservaron aquellos con una reacción citocromo oxidasa positiva. Después de este procedimiento, se llevó a cabo una observación meticulosa de la morfología colonial para seleccionar los cultivos con características de rugosidad.

1

Todos los cultivos sospechosos se identificaron mediante el análisis de ésteres metílicos de los ácidos grasos celulares por cromatografía de gases con la técnica modificada por Yáñez, 2000 del Sistema de Identificación Microbiana (Microbial Identification System (MIS); Microbial ID INC. [MIDI]. Newark, Del.) (Sasser, 1990). Las bacterias aisladas mediante los pasos descritos anteriormente se usaron en las pruebas siguientes de desinfección con ozono. Análisis cuantitativo de V. cholerae - la estimación de la densidad bacteriana se hizo en la muestra cruda, en la muestra despues de un Tratamiento Primario Avanzado (TPA) y a intervalos de 2 minutos durante la oxidación química. Para determinar la cantidad de bacterias en el agua se utilizó la técnica de Número Más Probable descrita por Sánchez et al., (1991). Paralelamente, se verificó la densidad de coliformes fecales como indicadores de referencia (NOM-001-ECOL1996) utilizando la técnica de membrana filtrante según el procedimiento de la Norma Mexicana NMX-AA-102-1987. Desinfección con ozono - previo al tratamiento con ozono el agua residual cruda fue sometida a un Tratamiento Primario Avanzado (TPA) simulado a través de una prueba de jarras Phipps and Bird modelo 7790.400 utilizando 40 mg/L cloruro férrico (coagulante) y 0.4 mg/L de Prosifloc A-252 (floculante). Para evaluar la eficiencia del ozono como desinfectante en la eliminación de V. cholerae O1 fenotipo rugoso, esta bacteria se inoculó en el agua residual tratada alcanzando una densidad bacteriana en el orden de 106 a 109 UFC/100 mL, esta se determinó con la escala nefelométrica de Mac Farland conforme a la densidad encontrada por Orta et al., 2000 de 3 X 106 UFC/100 mL para V. cholerae en agua residual y a los índices reportados para coliformes fecales (Jiménez y Chavez 2000) en México. En la figura 1 se muestra el arreglo experimental utilizando en las pruebas de desinfección. El ozono se obtuvo a partir de un generador EMERGY TRAILIGAZ LABO 76 con capacidad de producción de 19 g O3/h, usando aire enriquecido con oxígeno como gas de alimentación. O3

AIRE KI 2% G4

H = 110 cm Dp = 0.5 mm Dc = 5 cm G1 = 0 cm G2 = 30 cm G3 = 60 cm G4 = 90 cm Dp = 10 - 15 mm

G3

G2 Difusor Q

G1 O3

L

Efluente

Rotámetro

O2

Generador de ozono

air e

Separador de aire

Figura 1. Arreglo experimental utilizado en la prueba de desinfección.

2

Con el objeto de simular un proceso de desinfección, las pruebas se llevaron a cabo en una columna de burbujeo de vidrio (55 mm de diámetro y 1.1 m de altura), la cual se operó en forma semi-continua con un volumen de trabajo de 1.8 L aplicando el ozono mediante un difusor de vidrio con diámetro de poro de 10 - 15 µm. Se manejo una concentración de ozono en fase gas a la entrada del reactor de 35.2 mg O3/L y un flujo de 0.5 L/min, por lo que la cantidad de ozono aplicada al sistema de reacción en fase gas fue de 17.6 mg O3/min. La densidad de V. cholerae O1 fenotipo rugoso se valoró en cada una de las etapas del proceso: influente (cruda), efluente (TPA) y desinfección (ozonada). Con el objeto de evaluar la eficiencia de eliminación de la bacteria en el proceso de desinfección, el efluente tratado fue ozonado durante 14 minutos en modo semicontínuo y se valoró la densidad bacteriana cada 2 minutos durante el proceso. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Aislamiento de V. cholerae O1 fenotipo rugoso en agua residual - dentro de los logros más relevantes de esta investigación reportamos por primera vez el aislamiento de V. cholerae O1 fenotipo rugoso en agua residual. La detección de V. cholerae O1fenotipo rugoso en agua residual del Gran Canal de la Ciudad de México confirma que este fenotipo puede encontrarse en diferentes ambiente acuaticos. Los procedimientos rutinarios de aislamiento en agares selectivos pueden confundir una colonia rugosa con una contaminación del cultivo, sin embargo la observación meticulosa de las colonias y la confirmación de su identidad mediante cromatografía de gases, permitieron vislumbrar la presencia de este fenotipo en el agua residual. Por otra parte, tambien se detectó la presencia de V. cholerae variedad lisa, la cual se presentó de forma recurrente durante los 8 muestreos realizados en los meses de junio, julio y agosto. La detección de esta bacteria en cualquiera de sus formas, es significativa debido a lo que puede representar la propagación del cólera en la población, dada la reutilización del agua residual tratada o no tratada en el riego de hortalizas. Sin embargo es muy importante considerar la presencia de esta forma rugosa, ya que representa una forma de sobrevivencia muy virulenta al organismo, la cual puede persistir en la presencia de cloro libre de acuerdo a lo que refiere Orta et al., (1998) y Morris et al., (1996), este fenotipo fuede limitar el uso de la cloración en la prevención de propagación del cólera. Efecto desinfectante del ozono - con respecto al uso del ozono en la desinfección de agua residual tratada, los resultados indican un claro efecto desinfectante del ozono para eliminar bacterias patógenas resistentes como V. cholerae O1 fenotipo rugoso, además de bacterias indicadoras de contaminación (coliformes fecales) detectadas en el agua residual. El comportamiento de eliminación es muy similar entre V. cholerae O1 fenotipo rugoso y coliformes fecales, respecto al tiempo de ozonación y la dosis requerida. En la figura 2 se observa que V. cholerae O1 fenotipo rugoso fue eliminado totalmente después de 12 minutos de ozonación con una dosis de ozono aplicada en fase gas de 117.3 mg O3/L. La ocurrencia y la sobrevivencia del grupo coliforme en agua potable que ha sido sometida a estándares de cloro residual se ha reportado por algunos autores (McFeters et al., 1986 y Lippy and Waltrip (1984), así como el resurgimiento de coliformes fecales en aguas residuales municipales que han sido cloradas (Rockabrand et al., 1999). Esto incrementa la inquietud de buscar opciones de desinfección, sobre todo por lo que implica la utilización del grupo coliforme como indicadores de contaminación. En este estudio, la población de coliformes fecales fue reducida a niveles por debajo de lo permitido por la Norma Oficial Mexicana de agua residuales para riego agrícola (NOM-001ECOL/1996), la cual refiere 1000 UFC/100 mL, administrando la misma dósis de ozono aplicada en fase gas, a los 8 minutos de ozonación.

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1.00E+10

BACTERIAS REMANENTES ( NMP/100 ML )

1.00E+09 1.00E+08 V. cholerae

1.00E+07

Coliformes fecales

1.00E+06 1.00E+05 1.00E+04 1.00E+03

______________________________________________________NOM-ECOL-001-1996

1.00E+02 1.00E+01 1.00E+00 0

16.4

32.9

49.3

65.7

82.1

98.6

115

DÓSIS DE OZONO (MG/L)

Fig 1. Efecto del ozono en la remoción de V. cholerae O1 fenotipo rugoso y coliformes fecales presentes en agua residual.

Cabe hacer mención que al igual que para otros procesos de desinfección, la dósis requerida de ozono es altamente influenciada por la calidad del agua residual (cuadro 2). Entre otros parámetros destaca el contenido de materia orgánica, lo cual depende del tipo de proceso que se utiliza en el tratamiento del agua. La dósis de ozono puede disminuirse mejorando la calidad del efluente, por lo que en este estudio inferimos que además de aplicar un tratamiento primario es necesario llevar acabo un tratamiento secundario o terciario antes de la ozonación, sobre todo para eliminar materia orgánica que incremente la demanda de ozono. Cuadro 2. Evaluación de variables fisicoquímicas durante el proceso. Agua residual TPA Cruda pH 7.0 6.8 Turbiedad (UTN) 164 53 SDT (g/L) 0.83 0.83 Conductividad (ms/cm) 1.0 1.64 Color ( U- Pt-Co) 872 433 DQO (mg/L) 605 270 * Los datos corresponden al promedio de 8 muestreos.

O3 6.8 25 0.9 1.96 169 265

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En este contexto coincidimos con Xu et al., 2002, en el aspecto de que el diseño y especificación de las dosis y tiempos de transferencia del ozono, para la inactivación de coliformes fecales y otro tipo de microorganismos en agua residual, no pueden fundamentarse en los parámetros estándar de ozono residual o los tiempos de contacto determinados en estudios previos, quien reporta una demanda de ozono entre valores de 7.4–9.6 mg/L utilizada en agua residual tratada y filtrada para eliminar coliformes fecales, aunque es preciso indicar que esto es posible si se lleva a cabo una eficiente filtración antes de la desinfección con ozono. Otro aspecto importante que debe considerarse es que en esta investigación, la densidad bacteriana inicial de V. cholerae O1 fenotipo rugoso es de 2 - 6 unidades logaritmicas (109 UFC/100 mL) más alta comparada con los niveles normales que se reportan en agua (103 - 107 UFC/100 mL), por lo que se esperaría que los requerimientos de ozono en cuanto a dosis fueran menores. Los resultados obtenidos en este estudio demuestran que el ozono con su alto poder oxidante, es una alternativa efectiva como desinfectante en el tratamiento de aguas residuales para eliminar patógenos de interés en la salud pública como V. cholerae O1 fenotipo rugoso. La ozonación como tecnología alternativa permite vislumbrar una mejor opción, ante la utilización del cloro, ya que el ozono puede garantizar una calidad microbiológica adecuada de aguas tratadas que se destinan al reuso. A pesar de que el cloro es el desinfectante más utilizado por su bajo costo, es importante reflexionar acerca de la formación de subproductos de desinfección como los trialometanos, y recientemente de la resistencia que empiezan a manifestar bacterias patógenas como V. cholerae O1 fenotipo rugoso. En este contexto, se debe profundizar la investigación científica referente al riesgo asociado a desinfectantes alternativos y los subproductos de desinfección alternativa, además de tomar en cuenta las características de cada desinfectante como se muestra en el cuadro 3, en donde se aprecia además de la desinfección, la acción oxidante del ozono. Cuadro 3. Características de los desinfectantes utilizados en los procesos de desinfección. Desinfectantes Eficacia Remoción de color Remoción de olor Cloro Bueno Bueno Bueno Cloraminas Pobre Inadmisible Pobre Dioxido de cloro Bueno Bueno Bueno Ozono Excelente Excelente Excelente Radiación Ultravioleta Acertado N/A N/A Fuente: Trussell, (1991). CONCLUSIONES V. cholerae O1 fenotipo rugoso se aisló de agua residual del Gran Canal de la Ciudad de México, por lo que se reporta por primera vez la detección de este fenotipo en este tipo de agua. Este es un hecho relevante ya que la capacidad de este microorganismo para desarrollar cambios morfológicos y adaptarse a condiciones ambientales adversas, tiene como consecuencia el resurgimiento potencial del cólera, enfermedad que continúa siendo un serio problema de salud pública. El proceso de desinfección con ozono permite la eliminación total de V. cholerae O1 fenotipo rugoso (109 UFC/100 mL) presente en agua residual después de 12 minutos de ozonación con una dósis aplicada de ozono de 117.3 mg O3/L de agua. Esta dosis se encuentra dentro de los niveles reportados para aguas residuales tratadas, si tomamos en cuenta que para reducir en 2-log la densidad de coliformes fecales se requiere de: 2 mgO3/L para efluentes terciarios, de 6-17 mgO3/L para efluentes secundarios, y arriba de 25-30 mgO3/L para aguas residuales pretratadas (Janex, et al., 2000). La ozonación como método de desinfección es una alternativa a la cloración tradicional, que de acuerdo con los resultados de esta investigación, puede garantizar un tipo de agua residual libre de patógenos resistentes a la cloración como V. cholerae O1 fenotipo rugoso, para que pueda ser utilizada en el riego agrícola en forma segura. Consideramos importante tomar en cuenta el resurgimiento del grupo coliforme en agua clorada, sobre todo cuando es utilizado como procedimiento estándar para el análisis bacteriológico de agua residual.

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