RECVET. Vol. III, Nº 5, Mayo 2008 http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508.html RECVET- Revista Electrónica de Clínica Veterinaria http://www.veterinaria.org/revistas/recvet

Diagnóstico de Ehrlichiosis en caninos en la ciudad de La Habana (Diagnosis of canine Ehrlichiosis in Havana city) León, Avelina [1]; Demedio, Jorge [2]; Márquez, Mario [2]; Castillo, Elio [2]; Perera, Anayram [3]; Zuaznaba, Oliever [3]; Caníbal, Javier [3]; Gonzalez, Barbara [1]; Reynaldo, Lázaro [4]; Vega, Natan [2]; Blanco, Diuris [1]; Ronda, Marisel [1]; Peña, Amelia [1] ; Seija, Víctor [3] [1] Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB). [2] Facultad de Medicina Veterinaria. Universidad Agraria de La Habana (UNAH). [3] Departamento Nacional de la Técnica canina (MININT). [4] Instituto de Medicina Veterinaria Contacto: [email protected]

RECVET: 2008, Vol. III, Nº 5 Recibido 05.03.08 / Referencia 050802_RECVET / Aceptado: 28.04.08 / Publicado: 01.05.08 Este artículo está disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508.html concretamente en http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050802.pdf Revista Electrónica de Clínica Veterinaria RECVET® está editada por Veterinaria Organización® Se autoriza la difusión y reenvío siempre que enlace con Veterinaria.org® http://www.veterinaria.org y con RECVET®-http://www.veterinaria.org/revistas/recvet

Resumen La ehrlichiosis canina es una enfermedad ocasionada por Ehrlichia canis que se encuentra distribuida en casi todo el mundo. La elevación sostenida del número de perros enfermos, todos con antecedentes de infestación por garrapatas y con manifestaciones hemorrágicas diversas además de una marcada trombocitopenia, hizo sospechar la presencia de la entidad, por lo que nos propusimos como objetivo establecer el diagnóstico de la enfermedad en perros de Ciudad de La Habana. Se estudiaron un total de 155 animales todos con historia anterior de infestación por garrapatas y predominio de manifestaciones hemorrágicas. A todos los animales se les tomaron muestras de sangre, se realizó

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hemocitograma y frotis de sangre. Se confrontó el suero de 109 canes con el test inmunoenzimático Inmuno-Comb® (inmunoensayo en fase sólida). Los animales enfermos se trataron con dipropionato de Imidocarb (5 mg/kg de peso) en dosis única y seguimiento con tetraciclina (25 mg/kg de peso) cada 12 horas por 30 días, y se complementó con terapia de sostén. Como resultado de las investigaciones realizadas se detectaron 90 casos seropositivos (1:160 - 1:1280), y formaciones intracitoplasmáticas monocíticas compatibles con mórulas de Ehrlichia en 13 de ellos. De los 95 animales tratados, se logró la recuperación del 92,63 %. Teniendo en cuenta los elementos epizootiológicos y clínicos, así como las determinaciones serológicas, la evidencia de mórulas monocíticas y la respuesta al tratamiento aplicado, podemos confirmar la presencia de ehrlichiosis monocítica canina (EMC) en los perros estudiados. Palabras clave: ehrlichiosis, hemoparásitos, perro, trombocitopenia.

Summary Canine monocytic ehrlichiosis is a world wide disease caused by Ehrlichia canis. The sustained raising number of sick dogs, all with tick infection antecedents and diverse bleeding manifestations, besides a marked trompocitopenia, made us suspect the illness presence. Due to this, the objective was to diagnose canine ehrlichiosis in Havana City dogs. A total of 155 animals were studied, all of them with previous history of tick infection and predominance of hemorrhagic manifestations. Blood samples were taken to all animals; hemocytogram and blood smear were done. Serums of 109 animals were tested with Inmuno-Comb® (solid phase immunoassay). The sick dogs were treated with Imidocarb (5 mg/kg) and tetracycline (25 mg/kg) every 12 hours for 30 días. Seropositive samples from 90 animals (1:160 - 1:1280) and intracitoplasmatic bodies similar to Ehrlichia morules in 13 dogs were found. The majority of animals (92.63%) were recovered with the applied treatment. According to epizootiological and clinical characteristics, as well as the serological test, the monocytic morules and treatment responses, we confirm the presence of canine ehrlichiosis in analized dogs. Keywords: dog, ehrlichiosis, hemoparasitosis, trompocitopenia.

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1. Introducción La ehrlichiosis canina, también llamada ehrlichiosis monocítica canina (EMC), pancitopenia tropical canina, tifus canino, fiebre hemorrágica, y síndrome hemorrágico idiopático, entre otras denominaciones, es una enfermedad ocasionada por Ehrlichia canis, un microorganismo perteneciente a la Tribu Ehrlichieae, situada entre las Rickettsieae y las Chlamydiales, “parásito” intracelular obligatorio de las células mononucleares del perro y otros cánidos (Hoskins, 1991; Woody y Hoskins, 1991; Ristic y Holland, 1992). Existen referencias de la presencia de la ehrlichiosis en casi todo el mundo. En Europa, Donatien y Lestoquard (1937) la reportaron en el sur de Francia; en las Antillas, Bool y Stumoller (1957) la diagnosticaron en perros de la isla de Aruba y existe comunicación de su presencia en Estados Unidos (Ewing, 1962) y en Sudamérica (Rivadeneira, 1997). Para Davoust (1993), constituye una enfermedad de actualidad por su amplia distribución y la gravedad del cuadro que provoca, requiriéndose tratamientos prolongados, sin la posibilidad actual del empleo de la vacunación. La enfermedad puede ser transmitida mediante transfusiones de sangre de un animal afectado a otro susceptible, pero la vía de transmisión más frecuente es la picadura de la garrapata parda del perro, Rhipicephalus sanguineus (Ristic y Holland, 1992). Estudios realizados en clínicas de Austin y Dallas, reportan presencia de garrapatas, fundamentalmente Rhipicephalus sanguineus aproximadamente en un 15 % de los casos que asistieron a consulta, observando que la época de mayor reproducción del ixódido comprendió el periodo mayo- agosto, meses donde se observa una elevación de la temperatura y la humedad relativa ambiental (Dykstra y col., 1997). Un examen clínico general, como el que es posible realizar en la mayoría de las clínicas asistenciales, en ocasiones no es suficiente para emitir un diagnóstico certero de la enfermedad, ya que los síntomas son con frecuencia inespecíficos y en gran medida semejantes a los presentes en otras hemoparasitosis, tales como la fiebre manchada de las montañas rocosas, la haemobartonelosis y la babesiosis, sin embargo algunos autores coinciden en afirmar que la presencia de manifestaciones hemorrágicas, unido a una disminución marcada de los recuentos plaquetarios, permiten al menos orientar el diagnóstico en áreas endémicas de la entidad. Desde el punto de vista clínico, la ehrlichiosis canina se manifiesta en forma aguda, subclínica y crónica (Kuehn y Gaunt, 1985; Codner y FarrisSmith, 1989). Los signos clínicos observados en la fase aguda no son específicos y pueden remitir sin tratamiento en una a dos semanas, para dar paso a una fase de duración variable sin signos clínicos de enfermedad. Una disminución en los mecanismos de defensa inmunológicos del animal, frecuentemente causado por situaciones de estrés, favorece el desarrollo de la forma crónica, que se caracteriza por Diagnóstico de Ehrlichiosis en caninos en la ciudad de La Habana 3 http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050802.pdf

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pérdida progresiva de peso, anorexia, mucosas pálidas y signos hemorrágicos en piel, mucosas y a través de orificios naturales (Beaufils, 1997). Una vez que llega al torrente sanguíneo, Ehrlichia canis se multiplica en células mononucleares circulantes, las células infectadas son transportadas vía sanguínea a otros órganos, especialmente pulmones, riñones y meninges produciendo una serie de alteraciones fundamentalmente en la red vascular y el cuadro hematológico. En las células infectadas se adhieren al endotelio, produciendo vasculitis e infección en el tejido subendotelial. Se presenta una trombocitopenia en los animales infectados debido a un mayor consumo, secuestro y destrucción de plaquetas. La anemia observada en algunos casos se debe a una supresión en la producción de eritrocitos y mayor destrucción de éstos, siendo el número de leucocitos variable (Pierce y col., 1977; Breitschwerdt y col., 1987). El diagnóstico de la enfermedad incluye, de forma general, el estudio de la situación epizoótica del área con la demostración de la presencia de garrapata, la observación del cuadro clínico-hematológico y la observación intracitoplasmática de cuerpos de inclusión o mórulas de la rickettsia (Hibler y col., 1986), así como estudios serológicos que permiten determinar la presencia de anticuerpos séricos específicos contra el agente, generalmente utilizando la técnica de Inmunofluorescencia indirecta(Ristic y col., 1972; Pierce y col., 1977). Estudios mas recientes señalan la Reacción en Cadena de la Polimerasa como un procedimiento específico para el diagnóstico de certeza (Anderson y col., 1991). A partir del año 1996, comenzaron a reportarse tanto en clínicas asistenciales adscritas al Instituto de Medicina Veterinaria (IMV) como en los canes de las diferentes escuadras del Departamento Nacional de la Técnica Canina (DNTC) del Ministerio del Interior (MININT), perros con una signología compatible con una hemoparasitosis, que en muchos casos ocasionaba la muerte sin que fuera posible precisar la causa, aunque la ehrlichiosis canina entró en la lista de agentes sospechosos, teniendo en cuenta que se presenta con cierta frecuencia en países del área del Caribe desde los cuales se habían realizado importaciones de animales. A pesar que E. canis no ha sido reportada en Cuba afectando a seres humanos, se conoce de su presencia produciendo la enfermedad en personas en el área de Centroamérica, donde se considera al perro como un reservorio natural del agente (Dawson y col., 1996; Breitschwerdt y col., 1998) y está considerada como una enfermedad de un alto potencial zoonósico, adquiriendo una gran importancia en términos de salud pública si tenemos en cuenta la alta prevalencia de garrapatas en los perros y el eventual traspaso de este parásito al hombre cuando hay contacto estrecho con los animales (Drugueri, 2004). Si conocemos que existe un grupo de enfermedades cuya similitud en su cuadro clínico, obliga a realizar una diferenciación diagnostica y que el éxito del tratamiento de esta entidad solo se logra mediante un Diagnóstico de Ehrlichiosis en caninos en la ciudad de La Habana 4 http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050802.pdf

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diagnostico preciso, que permita la aplicación de una terapia adecuada desde estadios iniciales de la enfermedad, cobra trascendental importancia el establecimiento de un diagnóstico de certeza de la enfermedad. Motivado por la ocurrencia de diversos casos de caninos enfermos con un síndrome que no se correspondía con ninguna de las entidades morbosas diagnosticadas hasta el presente y que frecuentemente condujeron a la muerte de los animales, este trabajo pretende reportar la presencia de Ehrlichia canis como agente causal de estos cuadros. 2. Materiales y métodos El estudio se llevó a cabo en un período de cuatro años, se evaluaron 155 canes con edades comprendidas entre uno y diez años, de ambos sexos, de diversas razas y procedentes del servicio operativo de la Técnica Canina del Misterio del Interior en Ciudad de La Habana. Las razas investigadas fueron Pastor Alemán (98), Cocker Spaniel (23), Labrador Retriever (16), mestiza (6), Beagle (3), Rottwailer (2), Boxer (2), Basset Hound (2), Stafford (1), Lebrel Afgano (1) y Pastor Checo (1). Se incluyeron aquellos con historia anterior de infestación por garrapatas y predominio de manifestaciones hemorrágicas y en ocasiones febriles, como signos más llamativos. Se excluyeron los animales con mal estado físico que mostraron síntomas de otras enfermedades sistémicas o que estaban bajo tratamiento médico. En el momento de la consulta se colectaron garrapatas de los canes afectados, un total de 47 especímenes que fueron clasificadas según la clave de Pérez Vigueras (1956) en el laboratorio de Parasitología de la Universidad Agraria de La Habana. Se realizó una encuesta a 118 personas (criadores, propietarios, profesores y estudiantes de la Universidad Agraria de La Habana) que han tenido contacto directo o trabajan con caninos, para determinar la frecuencia de picaduras por R. sanguineus en seres humanos. Se recopilaron datos de la historia de los casos que incluyeron la raza, sexo y edad de los animales y se les realizó una inspección clínica general que incluyó la observación del estado general, la medición de la temperatura corporal y la presencia o no de alteraciones hemorrágicas, como manifestaciones fundamentales. Para el estudio de las variables hematológicas, se utilizaron los Procedimientos Operacionales de Trabajo (POT) de la División de Toxicología y Experimentación Animal del CENPALAB (CENPALAB, 2003); tomándose las muestras de sangre de la vena cefálica anterior colectadas en viales con EDTA al 10 % como anticoagulante, para su examen en el micro contador automático patentado por la Roche ABX Micros, y se determinó el hematocrito (Hto), la hemoglobina (Hb), el conteo total de leucocitos (Leuc) y el conteo total de plaquetas (Plaq). Para el conteo diferencial de leucocitos se realizaron frotis con sangre venosa y donde fue posible periférica, obtenida de la vena marginal de la oreja, La Diagnóstico de Ehrlichiosis en caninos en la ciudad de La Habana http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n050508/050802.pdf

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búsqueda de los microorganismos en los leucocitos se realizó en los frotis de sangre completa, en 145 animales y diez con leucoconcentración, en los casos donde la población de células blancas fue muy escasa, utilizando para ello la capa flogística post centrifugación. La obtención de la capa blanca se obtuvo por centrifugación de las muestras en tubos Eppendorf (1,5 ml) por 5 minutos, a 3.500 rpm, para concentrar los leucocitos y las plaquetas. Se descartó el plasma y se tomó la capa blanca para elaborar los frotis en láminas portaobjetos limpios según los POT (CENPALAB, 2003). Los frotis fueron fijados y teñidos por el método de May Grünwald – Giemsa y se examinaron minuciosamente al microscopio óptico binocular (Axiolab) con lente de inmersión de 100x, acoplado a una cámara fotográfica digital y un sistema de micrometría (Digipad), con la cual se tomaron las imágenes de los leucocitos afectados. Se buscaron las estructuras compatibles con mórulas o cuerpos de inclusión, los cuales se describieron y fotografiaron para su posterior comparación con los referidos por la literatura internacional. Se investigó además la presencia de alteraciones de las diferentes células hemáticas. Para el estudio serológico de las muestras y a causa de la limitada disponibilidad del kit, se priorizaron aquellas con conteos hemocitológicos bajos. La sangre fue recolectada en viales de 1,5 ml y centrifugada, previa formación y retracción del coágulo a 3.500 rpm en una centrífuga Eppendorf según los POT (CENPALAB, 2003). Los sueros obtenidos fueron depositados en viales rotulados y confrontados con el test enzimático Inmuno-Comb® (inmunoensayo en fase sólida) de los laboratorios Biogal Galed Labs., de Israel (Figs. 2a anexa y 2b), para detectar títulos séricos de IgG contra Ehrlichia canis. La respuesta inmune positiva en este test se establece partir de títulos iguales o superiores a 1:160 por Inmunofluorescencia (I.F.I). Como tratamiento (95 animales) se utilizó dipropionato de Imidocarb (5 mg/kg de peso), en dosis única y seguimiento con tetraciclina (25 mg/kg), distribuida en dos tomas diarias, por 30 días, complementado con una terapia de sostén, según requiriera el animal. Para el procesamiento matemático de los resultados se codificaron las variables nominales y estas variables codificadas y las restantes se incluyeron en una base de datos y se procesaron mediante el programa Statgraphics versión 6 de 2001. Para la comparación de las variables se realizaron análisis de varianza de clasificación simple y la prueba de rangos múltiples de Duncan cuando existió diferencia significativa. En el caso de las variables discretas se llevó a cabo una comparación de porcentajes de las frecuencias (Comprop1 del Microstat). Para determinar la posible asociación entre pares de variables se empleó el coeficiente de correlación de Pearson. En todos los casos se utilizó el nivel de significación p0,05) entre los porcentajes de animales con fiebre, seropositivos y frotis positivos, seropositivos y frotis negativos, y los frotis negativos a los que no se les realizó serología. Como se aprecia, el 100 % de los casos presentaba alguna manifestación hemorrágica (Tabla II). Tabla II. Hallazgos serológicos y su relación con la presencia de formaciones intracitoplasmáticas y los valores de indicadores hematológicos Serología

n

Fiebre

Hemorragia

n

%

n

%

Hb

Hto

Leuc. T

Plaq

(X) 1

(X) %

(X) 2

(X) 2

Serol. + Frotis +

1 1

9

81,82

11

100

83,5 a

26,22 a

8,32

76,56 a

Serol. + Frotis -

7 9

56

70,90

79

100

95,0 b

30,72 a

9,50

78,36 a

Serol. Frotis -

1 9

8

42,10

19

100

105,1 d

34,10 b

10,55

148,16 b

Serol ¿? Frotis -

4 5

32

71,11

45

100

114,4 d

37,10 c

11,02

176,72 c

Leyenda: 1 = g/l; 2 = 109/l. Letras distintas para la misma columna indican diferencia significativa (p0,05), atribuyéndose a la alta variabilidad de los valores individuales, aunque hay una diferencia próxima a 3 x 109/l a favor de los grupos con frotis negativos, debida a un mayor porcentaje (p