DOCUMENTO INFORMATIVO 6 ¿QUE ES ESTA “ACTIVIDAD” QUE SE MIDE? ¿COMO SE PUEDE MEDIR EN MICROGRAMOS?, Y ¿COMO SE RELACIONA CON LO QUE PASA AL INTERIOR DE NUESTROS TANQUES? Lo que No es En primer lugar, permítanos confirmarles lo que esta Actividad definitivamente no es – ésta no es el peso del Hormoconis resinae en la muestra. La Actividad que se mide es, de hecho, el peso de un compuesto que se encuentra en el hongo cuando crece en combustible, tal como explicaremos más adelante. Actividad Hemos identificado y aislado anticuerpos para un compuesto en particular (tan solo le llamamos “Compuesto”) que aparece naturalmente en pequeñas cantidades en el H. resinae sin importar dónde crezca. Cuando el H. resinae crece en combustible, sin embargo, produce grandes cantidades de este “Compuesto”. La cantidad de “Compuesto” que es generado depende de la cantidad de crecimiento del hongo – de ahí la medición de la Actividad. El “Compuesto” es liberado tanto en la fase de combustible como en la fase acuosa. Para ilustrar esto presentamos varias fotos de un microscopio electrónico realizadas para nosotros por una importante universidad en el Reino Unido. Para mostrar la Actividad, la Universidad marcó con oro a nuestros anticuerpos (solo para efectos de que la cámara los detecte) y los introdujo en el hongo. Cuando los anticuerpos entran en contacto con el “Compuesto” se adhieren a él y pueden ser observados como pequeños puntos negros en las fotos. Cualquier anticuerpo no adherido fue desechado antes de tomar las fotos. Como se puede observar por la posición de los diferentes puntos, el “Compuesto” está presente no solo en las paredes celulares, sino también dentro de la célula y en el ambiente circundante. (Vea foto 1). También queda claro en la Foto 2 que, aunque el “Compuesto” está presente en ambas muestras de H. resinae, se encuentra como fondo en el hongo cultivado, pero es mucho más visible en la muestra que ha crecido en el combustible. Foto 1 – Micrografías electrónicas de H. resinae que ha crecido en combustible. Dilución del anticuerpo de 1:1000 (5.4µg/ml), mostrando una alta densidad de partículas doradas a través de la sección completa del hongo. El área expandida muestra detalles del marcado de la pared y del citoplasma

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Foto 2 – Micrografías electrónicas de H. resinae que ha crecido en cultivo de laboratorio. Muestra de cultivo marcada con dilución de 1:100.000 de anticuerpo policlonal de H. resinae y anticuerpo dorado anti-inmunoglobulina de oveja de 10nm mostrando el marcado a través de las paredes celulares de la hifa, así como algún grado de manchado de citoplasma.

El aspecto importante que debe ser notado es que el “Compuesto” se esparce por toda la pared celular, el citoplasma y el ambiente circundante cuando crece en combustible. Normalmente en este tipo de test de inmunoensayo el anticuerpo busca un químico en particular en la parte externa de la pared celular (llamado epítope) al cuál se adherirá. Si nuestro test hiciera eso correríamos el riesgo de detectar H. resinae aun si fuera apenas viable (es decir, no en crecimiento), o estuviese muerto (una falla común en este tipo de test) o aún si hubiese estado creciendo pero no en el combustible (arrastrado hacia dentro por acción del viento). Pero como el “Compuesto” se encuentra presente en la totalidad del hongo y en sus alrededores (agua y/o combustible) podemos detectarlo testeando una muestra de combustible extraída de un tanque. También se degrada rápidamente y, por lo tanto, si es detectado, debe provenir de un organismo vivo, en crecimiento. Peso Hemos probado por medio de experimentación que un nivel conocido de actividad de crecimiento tiene como resultado la producción de una cantidad determinada de “Compuesto”. En pocas palabras, los microgramos (µg) de “Compuesto” se relacionan directamente con un nivel de “Actividad” de crecimiento. Para registrar esto gráficamente preparamos una cantidad de muestras de combustible a las que se les agregó cantidades conocidas de “Actividad”, según lo medido por el ELISA (test de inmunoensayo enzimático). Esto nos entregó una curva de calibración. El próximo paso fue tomar un gran número de muestras reales de combustible contaminado y compararlas con la tabla de calibración. La tarea final del laboratorio fue contrastarlas contra los niveles de contaminación Moderada y Alta aceptados por las aerolíneas, y fijar nuestros Dispositivos Laterales de Flujo en esos niveles. En primera instancia fijamos los niveles de acuerdo a nuestra calibración. Sin embargo, información proveniente de nuestros primeros clientes nos sugería que el Dispositivo Alto

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estaba fijado en un nivel demasiado alto y lo hemos bajado. Esto permite a los ingenieros una detección temprana de contaminaciones importantes. Un problema que tuvimos con el proceso de calibración tuvo relación con las medidas de peso en microgramos para los conteos de UFC. Nuestro problema es que el sistema de UFC es inherentemente impreciso cuando se debe determinar conteos de hongos filamentosos. Este problema surge del hecho que los métodos tradicionales de cultivo se basan en capturar un elemento vivo y creciente del organismo en la muestra y luego cultivarlo. Si usted captura una parte de la hifa (la raíz/ tallo del hongo), todo bien – cultivará una colonia. Pero si usted capturase un cuerpo de propagación (la conidia) entonces podría cultivar 20, 30 o quizás más colonias – una de cada semilla – y todas de la misma y única cepa fúngica. Para ilustrar ese hecho hemos incluido en el Anexo A un test IP 385 realizado por nuestros laboratorios acreditados por ISO 17025 y por la UKAS en CAB International, aquí en Egham. Las pruebas fueron realizadas en gasóleo marítimo en vez de kerosene puro aeronáutico. Los tanques de combustible marítimo son más susceptibles a contaminantes sueltos, pero el principio aplica para ambos tipos de combustible. En esta prueba se usaron tres muestras diferentes entregadas por el cliente (más una botella de muestra Fuelstat usada). Cada muestra fue testeada en duplicado, (llamándolas i. e ii. para una consulta más fácil). Ambas muestras duplicadas fueron testeadas al mismo tiempo usando el método tradicional IP385. El resultado para el primer duplicado fue TNTC en hongos (es decir, demasiado alto para contar), lo cual significa un alto nivel de contaminación. El resultado para el otro duplicado fue 1380 ufc/l, lo cual representa un resultado de contaminación no significativa. ¿Cuál de los dos resultados es el correcto? ¡Quién sabe! Otra porción de la muestra, mientras tanto, fue inyectada en un matraz que contenía combustible esterilizado y fue dejada para incubar por diez días. Al final de los diez días se inspeccionó la muestra en un microscopio. El resultado fue que no había un crecimiento fúngico o bacteriano evidente, de lo cual se puede desprender que el crecimiento fúngico en el test IP 385 provenía de hongos que no podían crecer en el combustible– debían esperar hasta ser sacados del combustible (al medio de crecimiento de IP 385) antes de que pudieran volverse activos. ¿Qué significa esto para el cliente? Si el cliente hubiese abierto los tanques de combustible aeronáutico en concordancia con los resultados de la sub-muestra 1 no habría encontrado nada. Ninguna contaminación. ¡Una pérdida de tiempo y dinero! ¿Cómo se relacionan los dos límites con lo que está ocurriendo en nuestros tanques de combustible? Habiendo alcanzado nuestros niveles para las Líneas de Test de nuestro dispositivo Bajo y Alto, era un ejercicio matemático relativamente simple relacionar eso con los niveles de Actividad tanto en la fase acuosa como en la fase de combustible de una muestra, basados en el peso en vez del conteo de UFC. El punto más importante aquí, sin embargo, es recordar que los límites están establecidos basados en los años de experiencia de OEM y de los ingenieros de las aerolíneas respecto de este problema. Los límites para la medición de Actividad realizada por Fuelstat, según lo establecen las Directrices de IATA, son cifras exactas, matemáticas, pero para todo efecto práctico, ellas debieran considerarse como una decisión basada en la experiencia de un gran número de ingenieros de las aerolíneas.

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Anexo A al Documento Informativo 7 EIB/23100 página 1 de 5 Ref. EIB/23100 Conidia Bioscience Bakeham Lane, Egham Surrey TW20 9TY At: Sr. George Tippett 1o de Diciembre de 2003 Informe Confidencial sobre Contrato EIB/23100 Fecha Recepción: 14/11/03 Fecha Comienzo: 14/11/03 Fecha Término: 01/12/03 1. Introducción Cuatro muestras fueron recibidas para aislar contaminantes fúngicos y bacterianos. Se realizaron tests Fuelstat en tres de las muestras. 2. Muestra Ref. EIB

Ref. Cliente/Descripción

23100/1

500ml de combustible gasóleo – [borrado intencional] Filtro de motor babor 13 de Noviembre de 2003, 10:30. 500ml de combustible gasóleo – [borrado intencional] Filtro de motor estribor13 de Noviembre de 2003 10:30 500ml de combustible gasóleo – [borrado intencional Sistema transferencia 13 de Noviembre de 2003 10:30. Muestra Fuelstat [borrado intencional] Reserva con 50ml de combustible. Lote N°. HR020-44103 Fecha vencimiento 27 de abril de 2005

23100/2 23100/3 23100/4

3. Métodos i.

Inspección Visual Cada muestra fue examinada para detectar desechos o decoloración. También cada una fue observada bajo aumento para detectar presencia de hongos y/o bacterias.

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EIB/23100 página 2 de 5 ii.

Filtrado Para las muestras 23100/1,2, y 3, cuatro alícuotas de 50ml de cada muestra se filtraron en filtros pre-esterilizados de membrana de poros de 0.45 µm. Los filtros fueron puestos directamente sobre dos placas de Agar con Extracto de Malta que contenían antibióticos (MA + AB) y dos Agar Nutrientes (NA). Las placas fueron incubadas a 25 ˚C y evaluadas a los 3 y 7 días.

iii.

Tests Fuelstat Este test fue realizado en la muestras 23100/1,2 y 3.

iv.

Test en jarro Este test fue realizado en las muestras 23100/1, 2 y 3. Para cada muestra, dos jarros de boca ancha de 250ml de capacidad fueron llenados hasta aproximadamente un tercio de su capacidad con una solución Bushnell-Haas de sales minerales y fueron esterilizados en autoclave. 15ml de la muestra fueron puestos en cada uno de los jarros. Los jarros inoculados fueron incubados a la temperatura del laboratorio por diez días.

v.

Directo en Placa (23100/4) Dos alícuotas de 0.1 ml de la capa azul en el fondo de la botella Fuelstat fueron esparcidas directamente sobre placas de Agar con Extracto de Malta que contenían antibióticos (MA + AB). Las placas fueron incubadas a 25˚ C y evaluadas a los 3 y 7 días.

4. Resultados i.

Inspección Visual 23100/1 La muestra era rosada, con algún pequeño desecho ocasional visible a simple vista. No se encontró desechos microbianos bajo aumento.

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EIB/23100 página 3 de 5 23100/2 La muestra era rosada y limpia sin desechos visibles a simple vista o bajo aumento. 23100/3 La muestra era rosada oscura y limpia sin desechos visibles a simple vista o bajo aumento. ii.

Filtrado

Muestra Filtrado de ufc/50ml 23100/1 MA + AB

i ii

NA 23100/2

MA + AB

NA 23100/3

i ii i

i ii

MA + AB

i ii NA i ii

Conteo de colonias

Ufc / l

TNTC* Colonias fúngicas 5 Levadura 69 Colonias fúngicas 2 Levadura

TNTC Colonias fúngicas 100 Levadura 1380 Colonias fúngicas 40 Levadura

>138 Colonias fúngicas >134 Colonias fúngicas 14 Colonias fúngicas 40 Levadura 20 Colonias fúngicas 34 Levadura 136 Colonias fúngicas 160 Colonias fúngicas 4 Colonias fúngicas 6 Colonias fúngicas 1 Colonia fúngica 11 Colonias fúngicas

>2760 Colonias fúngicas >2680 Colonias fúngicas 280 Colonias fúngicas 800 Levadura 400 Colonias fúngicas 680 Levadura 2720 Colonias fúngicas 3200 Colonias fúngicas 80 Colonias fúngicas 120 Colonias fúngicas 20 Colonias fúngicas 220 Colonias fúngicas

TNTC* = Demasiado alto para contar El H. resinae no fue aislado de ninguna de las muestras.

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4. Resultados (continuación) iii.

Tests Fuelstat 23100/1 resultado de Fuelstat = Negativo 23100/2 resultado de Fuelstat = Negativo 23100/3 resultado de Fuelstat = Negativo

iv.

Test en jarros Después de 10 días, al examinarlos, ninguno de los jarros presentó decoloración de la solución de sales minerales. No había rastros de crecimiento fúngico o bacteriano visible a simple vista o bajo aumento.

v.

Directo en placa 23100/4 No se detectaron organismos luego de 7 días de incubación.

5. Comentarios Los resultados de las muestras 1 y 2 usando métodos de cultivo 'tradicionales' causarían preocupación; sin embargo, como los organismos no fueron capaces de crecer en los tests, ellos eran en realidad contaminantes sueltos y los resultados de Fuelstat fueron precisos.

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Informe preparado por:

Transcripción revisada por:

Debra Atkin Funcionario Científico

Sharon Livingstone Gerente de Calidad

Firmado (por CAB International) por

Dr. Joan Kelley Líder de Sección, Biología Ambiental e Industrial

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