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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS ˜ ESPANA

k ES 2 033 590 kN´umero de solicitud: 9101004 kInt. Cl. : C12P 37/02

11 N.◦ de publicaci´ on: 21

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C12N 9/00 C12N 9/10 //A61K 31/43

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ADICION A LA PATENTE DE INVENCION

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73 Titular/es: Antibioticos, S.A.

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72 Inventor/es: Mart´ınez Blanco, Honorina;

22 Fecha de presentaci´ on: 19.04.91

45 Fecha de anuncio de la concesi´ on: 16.03.93

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Antonio L´ opez, 111 28026 Madrid, ES

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Reglero Chill´ on, Angel y Luengo Rodr´ıguez, Jos´ e Mar´ıa

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45 Fecha de publicaci´ on del folleto de patente:

16.03.93

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61 N´ umero de solicitud de patente principal :

8902421

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74 Agente: Elzaburu M´ arquez, Alberto

k kResumen:

54 T´ıtulo: Procedimientos para sintetizar fenilacetil-CoA y para producir bencilpenicilina. 57

Procedimiento para la producci´ on enzim´atica de diferentes penicilinas seg´un la patente principal N◦ 8902421, solicitada el 10 de julio de 1989. Comprende incubar, empleando la misma reacci´on que en la patente principal, un sistema enzim´atico acoplado constituido por las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de Pseudomonas putida y la enzima acilCoA: 6-APA aciltransferasa de Penicillium chrysogenum y, como sustratos, los siguientes compuestos: ´acido 6-amino-penicil´anico, ATP, CoA, Cl2 Mg, DTT y distintos precursores de la cadena lateral de diferentes penicilinas. La invenci´on es aplicable a la preparaci´ on bioqu´ımica de antibi´ oticos derivados de la bencilpenicilina obtenida en dicha patente principal.

Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

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DESCRIPCION El objeto de esta solicitud de Certificado de Adici´on a la patente espa˜ nola N◦ 2.016.476 es la producci´ on de antibi´ oticos β-lact´amicos utilizando t´ecnicas de Bioqu´ımica y, concretamente, se refiere al acoplamiento de enzimas de distinto origen microbiano con el objeto de obtener “in vitro” diferentes penicilinas. La utilizaci´on de enzimas purificadas a partir de organismos productores de antibi´ oticos βlact´ amicos y se empleo para la s´ıntesis “in vitro” de estos compuestos ha permitido reproducir las reacciones que conducen a la s´ıntesis de esas mol´eculas. La mayor´ıa de esos estudios se han realizado con una sola enzima y s´olo en algunas ocasiones se han podido acoplar dos o m´ as prote´ınas enzim´aticas produciendo un determinado antibi´ otico. Un ejemplo reciente sobre la aplicaci´on de este tipo de sistema es el descrito por nosotros en la patente espa˜ nola principal N◦ 2.016.476 concedida el 8 de Agosto de 1990 correspondiente a la solicitud 8902421 presentada el 10 de Julio de 1989, y que mediante la utilizaci´ on de las enzimas acil-CoA: 6-APA aciltransferasa de Penicillium chrysogenum y la fenilacetil-CoA ligasa de Pseudomonas putida ha permitido sintetizar penicilina G (bencilpenicilina) a partir de 6-APa, PAA y CoA. La presente invenci´on trata de la producci´on enzim´atica de diferentes penicilinas utilizando el sistema compuesto por las enzimas fenilacetil-CoA ligasa purificada de Pseudomonas putida y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa obtenida P. chrysogenum cuando se incuban conjuntamente en un medio de reacci´on que contiene: a´cido 6-aminopenicil´ anico (6-APA), ATP, CoA, Cl2 Mg, DTT y distintos precursores de la cadena lateral de penicilinas (indicados como R). La mezcla de reacci´on se incub´ o con cada una de las mol´eculas expresadas como R a 30◦ C en soluci´on acuosa tamponada en un intervalo de pH comprendido entre 7,5 - 8,4 durante un per´ıodo de tiempo comprendido entre 20 y 200 min. Ejemplo 1 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido pentanoico esterificando el grupo NH2 del a´cido 6aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa P. putida y acil-CoA: 6APa aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2, 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido pentanoico, 0,2 M 30 µl, a´cido 6-aminopenicil´anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetilCoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´ on se ajust´ oa 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦ C durante 120 min. La reacci´on se par´o mediante la adici´on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente Micrococcus luteus ATCC 9341. 2

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En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido pentanoico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 2 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de a´cido 4-acetilbut´ırico esterificando el grupo NH2 del a´cido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acilCoA: 6-APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; a´cido acetilbut´ırico, 0,2 M 30 µl, ´acido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦C durante 60 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 4-acetilbut´ırico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 3 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido 3,3dimetilbut´ırico esterificando el grupo NH2 del a´cido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido 3,3-dimetilbut´ırico, 0,2 M 30 µl, ´acido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦C durante 60 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 3,3-dimetilbut´ırico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 4 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido 2-metil-pent-4 -enoico esterificando el grupo NH2 del ´acido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2, 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; a´cido 2-metil-pent-4-enoico, 0,2 M 30 µl, ´acido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM,

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10 µl; fenilacetil-CoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦ C durante 60 min. La reacci´on se par´ o mediante la adici´on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 2-metilpent-4-enoico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 5 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de a´cido hexanoico esterificando el grupo NH2 del a´cido 6aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2, 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido hexanoico, 0,2 M 30 µl, a´cido 6-aminopenicil´anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetilCoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´ on se ajust´ oa 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no teron mostatizado a 30◦C durante 30 min. La reacci´ se par´o mediante la adici´on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido hexanoico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 6 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido ad´ıpico esterificando el grupo NH2 del a´cido 6aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2, 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido ad´ıpico, 0,2 M 30 µl, a´cido 6-aminopenicil´anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetilCoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´ on se ajust´ oa 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦ C durante 120 min. La reacci´on se par´o mediante la adici´on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido ad´ıpico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 7 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido trans2-hexenoico esterificando el grupo NH2 del a´cido

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6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido trans-2-hexenoico, 0,2 M 30 µl, ´acido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦ C durante 180 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido trans-2hexenoico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 8 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido trans3-hexenoico esterificando el grupo NH2 del a´cido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido trans-3-hexenoico, 0,2 M 30 µl, ´acido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦ C durante 60 min. La reacci´on se par´ o mediante la adici´on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido trans-3hexenoico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 9 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido 5-acetil-pentanoico esterificando el grupo NH2 del a´cido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido 5-acetilpentanoico, 0,2 M 30 µl, a´cido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦C durante 60 min. La reacci´ on se par´ o mediante 3

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la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 5-acetilpentanoico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 10 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido 2-meacido til-hexanoico esterificando el grupo NH2 del ´ 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido 2-metil-hexanoico, 0,2 M 30 µl, ´acido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil -CoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6 -APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦ C durante 60 min. La reacci´on se par´ o mediante la adici´on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido pentanoico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 11 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido heptanoico esterificando el grupo NH2 del a´cido 6aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2, 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido heptanoico, 0,2 M 30 µl, a´cido 6-aminopenicil´anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetilCoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´ on se ajust´ oa 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no teron mostatizado a 30◦C durante 60 min. La reacci´ se par´o mediante la adici´on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de ´acido heptanoico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 12 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido pim´elico esterificando el grupo NH2 del a´cido 6aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil -CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mez4

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cla de reacci´on conten´ıa: MgCl2, 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido pim´elico, 0,2 M 30 µl, ´acido 6-aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetilCoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´ on se ajust´ oa 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦ C durante 120 min. La reacci´on se par´o mediante la adici´on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de ´acido pim´elico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 13 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido trans2-heptenoico esterificando el grupo NH2 del ´acido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido trans-2-heptenoico, 0,2 M 30 µl, ´acido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦ C durante 180 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido trans-2heptenoico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 14 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido trans3-heptenoico esterificando el grupo NH2 del ´acido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil -CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido trans-3-heptenoico, 0,2 M 30 µl, ´acido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦ C durante 60 min. La reacci´on se par´ o mediante la adici´on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido trans-3-

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heptenoico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 15 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de a´cido octanoico esterificando el grupo NH2 del a´cido 6aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2, 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido octonoico, 0,2 M 30 µl, ´acido 6-aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´ on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostation se par´ o zado a 30◦ C durante 30 min. La reacci´ mediante la adici´on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido octanoico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 16 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido trans2-octenoico esterificando el grupo NH2 del a´cido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido trans-2-octenoico, 0,2 M 30 µl, a´cido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦ C durante 180 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido trans-2octenoico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 17 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido trans3-octenoico esterificando el grupo NH2 del a´cido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido trans-3-octenoico, 0,2 M 30 µl, ´acido 6 aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil -CoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa

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100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦ C durante 60 min. La reacci´on se par´ o mediante la adici´on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido trans-3octenoico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 18 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de a´cido nonanoico esterificando el grupo NH2 del a´cido 6aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil -CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido nonanoico, 0,2 M 30 µl, a´cido 6-aminopenicil´anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetilCoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´ on se ajust´ oa 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦ C durante 120 min. La reacci´on se par´o mediante la adici´on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2, 6-APA o de a´cido nonanoico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 19 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de a´cido 2-hidroxifenilac´etico esterificando el grupo NH2 del a´cido 6-aminopenicil´anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil -CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido 2-hidroxifenilac´etico, 0,2 M 30 µl, a´cido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA-ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦C durante 60 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 2-hidroxifenilac´etico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 20 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de a´cido 3-hidroxifenilac´etico esterificando el grupo NH2 del a´cido 6-aminopenicil´anico. 5

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Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido 3-hidroxifenilac´etico, 0,2 M 30 µl, a´cido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA-ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦C durante 60 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 3-hidroxifenilac´etico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 21 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido 4-hidroxifenilac´etico esterificando el grupo NH2 del a´cido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido 4-hidrofenilac´etico, 0,2 M 30 µl, a´cido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦C durante 60 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 4-hidroxifenilac´etico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 22 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido 3-metilfenilc´etico esterificando el grupo NH2 del ´acido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido 3-metilfenilac´etico, 0,2 M 30 µl, ´acido 6 aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil -CoA-ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦C durante 60 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de meta6

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nol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 3-metilfenilac´etico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 23 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de a´cido 4-metilfenilac´etico esterificando el grupo NH2 del ´acido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil -CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido 4-metilfenilac´etico, 0,2 M 30 µl, ´acido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA-ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦C durante 60 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 4-metilfenilac´etico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 24 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido 3metoxifenilac´etico esterificando el grupo NH2 del ´acido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido 3-metoxifenilac´etico, 0,2 M 30 µl, ´acido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA-ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦C durante 60 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 3-metoxifenilac´etico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 25 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido 4metoxifenilac´etico esterificando el grupo NH2 del ´acido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mez-

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cla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido 4-metoxifenilac´etico, 0,2 M 30 µl, a´cido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA-ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦C durante 60 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 4-metoxifenilac´etico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 26 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido 3-aminofenilc´etico esterificando el grupo NH2 del ´acido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2, 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; a´cido 3-aminofenilac´etico, 0,2 M 30 µl, ´acido 6 aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil -CoA-ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦C durante 60 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 3-aminofenilac´etico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 27 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido 4aminofenilac´etico esterificando el grupo NH2 del ´acido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil -CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido 4-aminofenilac´etico, 0,2 M 30 µl, ´acido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA-ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦C durante 60 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En au-

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sencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 4-aminofenilac´etico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 28 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de a´cido 2-fluorofenilac´etico esterificando el grupo NH2 del ´acido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido 2-fluorofenilac´etico, 0,2 M 30 µl, ´acido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA-ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦C durante 60 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 2-fluorofenilac´etico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 29 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de a´cido 3-fluorofenilac´etico esterificando el grupo NH2 del ´acido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido 3-fluorofenilac´etico, 0,2 M 30 µl, ´acido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦C durante 60 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 3-fluorofenilac´etico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 30 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de a´cido 4-fluorofenilc´etico esterificando el grupo NH2 del ´acido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido 4-fluorofenilac´etico, 0,2 M 30 µl, ´acido 6 aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 7

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10 µl; fenilacetil -CoA-ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦C durante 60 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 4-fluorofenilac´etico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 31 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido 2,4difluorofenilac´etico esterificando el grupo NH2 del ´acido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil -CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2, 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; a´cido 2,4-difluorofenilac´etico, 0,2 M 30 µl, a´cido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA-ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦C durante 60 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 2,4-difluorofenilac´etico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 32 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido 2,5difluorofenilac´etico esterificando el grupo NH2 del ´acido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2, 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; a´cido 2,5-difluorofenilac´etico, 0,2 M 30 µl, a´cido 6 -6-aminopenicil´anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA-ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦C durante 60 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 2,5-difluorofenilac´etico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 33 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee 8

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como cadena lateral una mol´ecula de ´acido 2,6difluorofenilac´etico esterificando el grupo NH2 del ´acido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2, 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; a´cido 2,6-difluorofenilac´etico, 0,2 M 30 µl, a´cido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA-ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦C durante 60 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 2,6-difluorofenilac´etico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 34 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido 3,4difluorofenilc´etico esterificando el grupo NH2 del ´acido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido 3,4-difluorofenilac´etico, 0,2 M 30 µl, ´acido 6 -aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil -CoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦C durante 60 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 3,4-difluorofenilac´etico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 35 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido αmetilfenilac´etico esterificando el grupo NH2 del ´acido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil -CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido α-metilfenilac´etico, 0,2 M 30 µl, ´acido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA-ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o

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a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦ C durante 180 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido α-metilfenilac´etico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 36 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido α-etilfenilac´etico esterificando el grupo NH2 del ´acido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido α-etilfenilac´etico, 0,2 M 30 µl, a´cido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA-ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦C durante 60 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido α-etilfenilac´etico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 37 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido α-hidroxifenilac´etico esterificando el grupo NH2 del a´cido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2, 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; a´cido α-hidroxifenilac´etico, 0,2 M 30 µl, ´acido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA-ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦C durante 60 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido α-hidroxifenilac´etico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 38 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido fenoxiac´etico esterificando el grupo NH2 del a´cido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta pe-

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nicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido fenoxiac´etico, 0,2 M 30 µl, ´acido 6 -aminopenicil´anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil -CoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´ on se ajust´ oa 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no teron mostatizado a 30◦C durante 60 min. La reacci´ se par´o mediante la adici´on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2, 6-APA o de a´cido fenoxiac´etico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 39 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de a´cido ciclopentilac´etico esterificando el grupo NH2 del ´acido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil -CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido 4-aminofenilac´etico, 0,2 M 30 µl, ´acido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦ C durante 180 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 4-aminofenilac´etico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 40 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido 2ciclopenten-1 -ac´etico esterificando el grupo NH2 del a´cido 6-aminopenicil´anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; a´cido 2-ciclopenten-1-ac´etico, 0,2 M 30 µl, a´cido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA-ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦ C durante 180 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con 9

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actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 2-ciclopenten-1-ac´etico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 41 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido ciclohexilac´etico esterificando el grupo NH2 del a´cido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil -CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido ciclohexilac´etico, 0,2 M 30 µl, a´cido 6aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil -CoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦ C durante 180 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido ciclohexilac´etico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 42 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido 2-tiofenoac´etico esterificando el grupo NH2 del a´cido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido 2-tiofenoac´etico, 0,2 M 30 µl, ´acido 6 aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil -CoA-ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦C durante 30 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 2-tiofenoac´etico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 43 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido 3-tiofenoac´etico esterificando el grupo NH2 del a´cido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil -CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; 10

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´acido 3-tiofenoac´etico, 0,2 M 30 µl, a´cido 6 aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil -CoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦C durante 30 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 3-tiofenoac´etico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 44 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de a´cido 3-tiofenomal´onico esterificando el grupo NH2 del ´acido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil -CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido 3-tiofenomal´ onico, 0,2 M 30 µl, ´acido 6 aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil -CoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦C durante 60 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 3-tiofenomal´onico no se obtuvo penicilina. Ejemplo 45 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de a´cido 2-piridilac´etico esterificando el grupo NH2 del a´cido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil -CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido 2-piridilac´etico, 0,2 M 30 µl, a´cido 6 aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil -CoA-ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦ C durante 120 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 2-piridilac´etico no se obtuvo penicilina.

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Ejemplo 46 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de ´acido 3-piridilac´etico esterificando el grupo NH2 del a´cido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil -CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido 3-piridilac´etico, 0,2 M 30 µl, a´cido 6 aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil -CoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦ C durante 120 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 3-piridilac´etico no se obtuvo penicilina.

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Ejemplo 47 S´ıntesis enzim´atica de la penicilina que posee como cadena lateral una mol´ecula de a´cido 4-piridilac´etico esterificando el grupo NH2 del a´cido 6-aminopenicil´ anico. Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de esta penicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetil -CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 , 0,2 M, 12,5 µl; ATP, 0,1 M, 50 µl; CoA, 20 mM, 30 µl; ´acido 4-piridilac´etico, 0,2 M 30 µl, a´cido 6 aminopenicil´ anico, 0,3 mM, 30 µl; DTT, 20 mM, 10 µl; fenilacetil -CoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ınas y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ınas puras). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 30◦ C durante 120 min. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de la penicilina generada se determin´ o por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente a Micrococcus luteus ATCC 9341. En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 , 6-APA o de a´cido 4-piridilac´etico no se obtuvo penicilina.

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REIVINDICACIONES 1. Procedimiento para la producci´ on enzim´atica de diferentes penicilinas seg´ un la patente principal No. 8902421, solicitada el 10 de julio de 1989, caracterizado porque comprende incubar un sistema enzim´ atico acoplado constituido por las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de Pseudomonas putida y la enzima acil-CoA: 6APA aciltransferasa de Penicillium chrysogenum y, como substratos, los siguientes compuestos: ´acido 6-aminopenicil´ anico, ATP, CoA, Cl2 Mg, DTT y distintos precursores de la cadena lateral de diferentes penicilinas (indicados como R), llev´andose a cabo la incubaci´ on de toda la mezcla con cada uno de los precursores a una temperatura comprendida entre 10 y 40◦ C en soluci´on acuosa tamponada en un intervalo de pH que oscila entre 5,5 y 9,0 durante un perioso de tiempo comprendido entre 30 y 200 min, seleccion´ andose la mol´ecula indicada como R de modo que corresponde a: a´cido pentanoico, a´cido 4-acetilbut´ırico, ´acido 3,3-dimetilbut´ırico, ´acido 2-metil-pent-4-

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enoico, ´acido hexanoico, a´cido ad´ıpico, ´acido trans-2 -hexenoico, a´cido trans-3-hexenoico, ´acido 5-acetilpentanoico, a´cido 2-metilhexanoico, ´acido heptanoico, a´cido pim´elico, ´acido trans-2heptenoico, ´acido trans-3-heptanoico, a´cido octanoico, a´cido trans-2-octenoico, ´acido trans-3octenoico, ´acido nonanoico, a´cido 2-hidroxifenilac´etico, ´acido 3-hidroxifenilac´etico, ´acido 4-hidroxifenilac´etico, ´acido 3-metilfenilac´etico, ´acido 4metilfenilac´etico, ´acido 3 -metoxifenilac´etico, ´acido 4-metoxifenilac´etico, ´acido 3 -aminofenilac´etico, ´acido 4-aminofenilac´etico, ´acido 2 -fluorfenilac´etico, ´acido 3-fluorfenilac´etico, ´acido 4fluorfenilac´etico, ´acido 2,4-difluorfenilac´etico, ´acido 2,5-difluorfenilac´etico, ´acido 2,6-difluorfenilac´etico, ´acido 3,4-difluorfenilac´etico, ´acido α-metilfenilac´etico, ´acido α-etilfenilac´etico, ´acido αhidroxifenilac´etico, ´acido fenoxiac´etico, ´acido ciclopentilac´etico, ´acido 2-ciclopenten -1-ac´etico, ´acido ciclohexilac´etico, ´acido 2-tiofenoac´etico, ´acido 3-tiofenoac´etico, ´acido 3-tiofenomal´ onico, a´cido 2-piridilac´etico, ´acido 3-piridilac´etico o ´acido 4 -pridilac´etico.