Atenuación natural de suelos contaminados con residuos tóxicos de origen minero. Aislamiento y caracterización microbiana

Orquidea Coto Pérez

Facultad de Biología, Universidad de La Habana, Habana, Cuba

1.- Antecedentes

En los últimos años, en varios países del mundo, se ha iniciado una nueva cruzada en la investigación y aplicación de nuevas alternativas que coadyuven como herramientas para prevenir ó restaurar los daños ocasionados por acciones antropogénicas ó desastres naturales que dañan de manera severa nuestro ambiente. Una de ellas es sin duda alguna la biorremediación, entendida esta como el uso de organismos vivos (plantas y microorganismos) para contrarrestar los efectos nocivos causados por desastres naturales u ocasionados intencionalmente. El presente trabajo

se enmarca dentro de la problemática medio ambiental

ocasionada por los residuos metálicos tóxicos y sus posibilidades de remediación a través de procesos naturales. Los vertidos industriales, particularmente los residuos mineros, contienen elementos potencialmente tóxicos y son un foco de contaminación importante de los sistemas naturales, que revierte en último término en la salud humana. La capacidad que tienen los suelos de atenuar estos fenómenos contaminantes a través de procesos naturales: biológicos, químicos y físicos, puede utilizarse como tratamiento de remediación de suelos contaminados, y se conoce con el nombre de atenuación natural. Una mina, es una excavación realizada para extraer del subsuelo, sustancias minerales útiles como carbón, hierro, cobre, estaño, oro, plata. Esta excavación causa una serie de impactos ambientales: pérdida de recursos; movimiento de tierras, sobretodo en minas a cielo abierto, que conlleva la alteración de la

topografía del terreno; ocupación de suelo explotable y alrededores para depositar escombros, materiales de desecho...; emisión de contaminantes tanto a la atmósfera (polvo y metales pesados ), como a aguas (provocando la acidez de estas, sobretodo en explotaciones de zinc y cobre), como a suelos (produciendo una transmisión de los contaminantes a los vegetales); eliminación de cobertura vegetal en la zona de explotación; desviación temporal o permanente del curso de las aguas; construcción de pistas y acceso para la explotación; impacto visual. Hay que hacer especial mención en el efecto denominado, acidificación de las aguas, que se produce por la oxidación de la pirita que se originan porque esta, se ve expuesta a condiciones atmosféricas como resultado de las labores mineras consiguiendo como resultado la acidificación del agua; como esta es un recurso indispensable para todos los seres vivos , afectará a animales(tanto a los que habitan en el río, como los que utilizan el agua de este río o depredan alguna especie de este mismo) a vegetales y como no al propio causante, el hombre. Una de las vertientes es la remediación bacteriana, se refiere al uso de microorganismos. Tradicionalmente, se ha visto a las bacterias como organismos dañinos para la vida, puesto que solamente las consideramos como causantes de enfermedades ó incluso de muertes. Así mismo como contaminantes de alimentos, sin tomar en cuenta que muchas de ellas son necesarias para nuestra vida cotidiana, tales como las levaduras, la participación bacteriana en los procesos digestivos, en los procesos de degradación de las heces, en la desintegración de la basura ó su participación en asociación con diferentes leguminosas en los procesos de fijación del nitrógeno atmosférico. No obstante, nunca se había visto la parte positiva de su accionar degradando o transformando substancias tóxicas, nocivas para nuestra existencia. La biorremediación bacteriana -ya sea mediante el uso de cepas nativas, mediante el mecanismo de la bioaumentación o el diseño de cepas modificadas genéticamente- se ha convertido en una nueva alternativa

para atacar de

manera directa muchos de los problemas que presentan la contaminación de aguas y suelos causada por diferentes contaminantes.

La capacidad mostrada por aislados bacterianos acumulando, degradando ó transformando diversos contaminantes a otros de menor nocividad y por lo mismo de menor impacto al ambiente, es lo que ha incentivado a distintas instituciones de investigación en la formación de equipos de investigadores, inter y multidisciplinarios para el diseño y aplicación de nuevas tecnologías, Hoy día, investigaciones realizadas en distintos centros han aportado múltiples opciones en el uso de bacterias nativas de los sitios que se encuentran sometidos a la influencia de la contaminación. Muchas de ellas han adquirido una capacidad sustantiva para poder sobrevivir en esas condiciones pues se han adaptando a las mismas. El impacto ambiental de los contaminantes metálicos en suelos y sedimentos es estrictamente dependiente de la capacidad de complejamiento de éstos con componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones fisicoquímicas y biológicas de su entorno. Los metales son especies químicas no degradables. Por tal motivo, una vez volcados al medio ambiente, sólo pueden distribuirse entre los entornos aire - agua - suelo, a veces cambiando su estado de oxidación, o incorporarse a los seres vivos. Los procesos de adsorción y la formación de complejos en medios naturales son responsables de que la mayor parte de los vestigios de metales pesados se acumulen en los sólidos en suspensión, incorporándose rápidamente a los sedimentos, donde se presentan los mayores niveles de concentración de estos contaminantes. El impacto ambiental de los contaminantes metálicos en suelos y sedimentos es estrictamente dependiente de la capacidad de complejamiento de éstos con componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones fisicoquímicas y biológicas de su entorno. Los metales son especies químicas no degradables. Por tal motivo, una vez volcados al medio ambiente, sólo pueden distribuirse entre los entornos aire - agua - suelo, a veces cambiando su estado de oxidación, o incorporarse a los seres vivos. Los procesos de adsorción y la formación de complejos en medios naturales son responsables de que la mayor parte de los vestigios de metales pesados se acumulen en los sólidos en

suspensión, incorporándose rápidamente a los sedimentos, donde se presentan los mayores niveles de concentración de estos contaminantes. Todas las interacciones entre los microorganismos y los metales u otros elementos como carbono, nitrógeno, azufre y fósforo son componentes fundamentales del ciclos biogeoquímicos. Las interacciones metal-microbiota son estudiadas entonces en profundidad en el contexto de la biotecnología ambiental, con el objeto de implementar métodos de remoción, recuperación o detoxificación de metales pesados y radionucléidos. Dependiendo del estado de oxidación que se presente un metal y la especie que esté conformando, un microorganismo puede realizar dos transformaciones posibles. Una correspondería a la movilización del metal, es decir el pasaje de un estado insoluble inicial (metales asociados a suelos, sulfuros u óxidos metálicos, por ejemplo) correspondiente a una fase sólida, a un estado soluble final, en fase acuosa. Este proceso se conoce con el nombre de lixiviación microbiana. El otro corresponde a la inmovilización del metal, es decir el pasaje de un estado soluble inicial en fase acuosa a uno insoluble final en fase sólida. A su vez existen en la naturaleza diferentes mecanismos por los cuales la inmovilización del metal puede llegar a ocurrir. Dentro de la amplia diversidad microbiana, existen microorganismos resistentes y microorganismos tolerantes a metales. Por todo lo anterior, el objetivo central del trabajo fue aislar y caracterizar representantes de la comunidad microbiana

presente en dos

los

muestras de

suelos procedente de Murcia, España: suelo natural (SN) y suelo I (SI)(reservorio de un residual minero de sulfuros polimetálicos).

Materiales y métodos

2.- Aislamiento y caracterización de microorganismos mediante el método convencional

2.1 Muestras de suelos

Se emplearon dos suelos diferentes de la región de Murcia, España. Estas fueron identificados como SN (suelo natural) y SI (suelo impactado por la actividad minera con un alto contenido en sulfuros metálicos donde predominan los de cobre cinc y plomo, pero especialmente la pirita).

2.2 Aislamiento por el método convencional

Se tomaron 10 gramos de cada muestra y se suspendieron en 90 mL de solución salina fisiológica estéril al 0,85 %. Los frascos erlenmeyers se colocaron en una zaranda giratoria durante 30 min, a temperatura de 30 oC. A partir de las suspensiones se realizaron diluciones seriadas desde 10

-1

hasta

-4

10 . Posteriormente, 100 µL de cada dilución fueron inoculadas por triplicado en cuatro medios de cultivo para microorganismos heterótrofos: LB, LB+extracto de suelo, Agar caseína almidón y agar sabouraud.

Las muestras

fueron

diseminadas con espátula de Drigalsky y se incubaron a 300 C durante 48 horas, hasta la aparición de colonias visibles, mientras que los medios agar sabouraud y agar almidón fueron incubados durante 7 días.

2.2.1 Medios de cultivos para el aislamiento

- Medio Luria-Bertani (LB): triptona1%,extracto de levadura 0.5%,cloruro de sodio 0.5%, pH 7,2. En caso de medio agarizado se añadio 2% de agar (Sambrook y cols,1989) . - Medio Luria-Bertani(LB) + extracto de suelo (DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany). El extracto de suelo es rico en microelementos muy necesarios para aislar microorganismos de estos medios sólidos. Por este motivo, se utilizó el medio LB con adición de extracto de suelo. Para su preparación se pesaron 400 g de suelo natural (SN). Se resuspendieron

en 960 mL de agua destilada. Esta suspensión se

autoclaveó a 121º C durante 1 hora, luego se enfrió. Se decantó y se filtró por papel. Se distribuyeron alicuoatas de 200 mL y se autoclaveó. Por último las soluciones de extracto de suelo se guardaron en refrigeración hasta su uso. Por cada 300 mL de medio LB se adicionaron 10 mL de extracto de suelo. -Medio agar sabouraud: Peptona 2%, agar-agar 2%. pH 6,5. -Agar almidón. El aislamiento de cada uno de los microorganismos contenido en las muestras SI y SN se realizó sobre la superficie de medios de cultivo sólidos siguiendo la técnica de la siembra por estrías múltiples en superficie. A cada aislado se le asignó un código que se corresponde con las iniciales del medio de cultivo de donde se aisló (LB ó LB+ES) y un subíndice numérico consecutivo.

2.3. Caracterización de los aislados representantes de la población bacteriana heterótrofa

-Tinción de Gram (Morfología, agrupación, presencia de esporas, cistos). -Prueba de la oxidasa. -Medios de cultivos selectivos y diferenciales. 1- Medio Kligler para detectar fermentación de glucosa y/o lactosa 15 g de Peptona bacteriológica; 5 g de Proteosa peptona; 3 g de Extracto de levadura; 1 g de Dextrosa; 10 g de Lactosa; 0.3 g de Tiosulfato de sodio; 0.2 g de Sulfato ferroso; 5 g de Cloruro de sodio; 0.024 g de Rojo fenol; 10.5 g de Agar en 1000 ml de agua destilada. 2- Medio King B (King.B, y col, 1954) para la detección cualitativa de sideróforos. 3- 20 g de Proteasa peptona; 1.5 g de Fosfato dibásico; 1.5 g de MgSO4 x 7H2O; 10 g de Glicerol; 15 g de Agar en 1000 mL de agua destilada. 4.- Medio Citrato: K2PO4 (10%); MgSO4 x 7 H2O (10%); NaCl (10%); CaCl 2 x H2O (10%); Fe EDTA (1.64%). 5.- Detección de microorganismos fijadores de dinitrógeno atmosférico Medio Sabih: 20 g de Manitol; 0.2 g de K2PO4, 0.2 g de MgSO4; 0.2 g de NaCl; 0.1 g de K2SO4; 5 g de CaCO3; 15 g de Agar en agua destilada. Medio Rojo Congo: 0.15 g de K2HPO4; 0.12 g de MgSO4 x 7 H2O; 0.1 g de NaCl; 0.5 g de Extracto de levadura; 0.015 g de FeCl3 x 6H2O; 5 g de Ácido málico, 4.8 g de KOH, 20 g de Agar en agua destilada. En este medio se inocularon los cultivos que crecieron en el medio Ashby. 6.- Solubilización de fósforo inorgánico El medio LB fue suplementado con fosfato tricalcico (2,5 g/L), solución de azul de bromofenol (0,4% en etanol), pH 6,7 con NaOH (0,1N) y de esta solución se añade 6 mL por 1000 mL de medio de cultivo. 7.- Determinación cualitativa de fosfatasa ácida El medio LB fue suplementado con fenolftaleina di-fosfato al 0,2% y verde de metilo al 0,005 % como indicador de pH, el cual fue esterilizado por filtración con membranas de nitrocelulosa, tamaño de poro 0,2 µm.

2.4. Identificación taxonómica

Para la identificación de los bastones o cocobacilos con respuesta positiva a la prueba de la oxidasa, se utilizó el sistema de identificación API 20 NE. Este es un sistema estandarizado que combina ocho pruebas bioquímicas y doce pruebas de asimilación, además de la prueba de oxidasa. Este sistema se aplica a bacterias no pertenecientes a la familia enterobacteriaceae.

2.5 Aislamiento y caracterización de representantes de la comunidad bacteriana del ciclo del hierro

2.5.1 Aislamiento de heterótrofas acidófilas, oxidadoras y reductoras de hierro. Medios de cultivos líquidos para enriquecer los microorganismos acidófilos: -Medio Harrison (1984) g/L (NH4)2SO4 K2HPO4 KCl MgSO4 x 7 H2O Glucosa Extracto de levadura

2,0 0,5 0,1 0.5 1,0 0,1 pH 3,0

-Medios de cultivo Fe(II) liq, Fe (III) liq . Estos contenían sales minerales como solución basal (SB), extracto de levadura (EL), elementos trazas (ET) (Christopher y col., 2005-IBS). Glicerol como fuente de carbono (10 mM) y hierro férrico o hierro ferroso (25 mM). Las soluciones de sulfato ferroso y sulfato férrico fueron preparadas como soluciones patrón 1 M (pH 1,7), esterilizadas por filtración a través de membranas con poros de 0,2 µM, al igual que la solución de glicerol (1M). En frascos estériles de 50mL, se adicionaron 5 gramos de suelo I (impactado) y 30 mL del medio de cultivo correspondiente. Los frascos se colocaron en una

zaranda giratoria a temperatura de 30o C hasta evidencia de crecimiento microbiano. El frasco conteniendo medio de cultivo con hierro férrico se llenó hasta el tope con el objetivo de reducir al máximo la presencia de oxígeno en el sistema y se colocó en la incubadora en condiciones estáticas. Con el objetivo de purificar los representantes bacterianos de la población heterótrofa acidófila del suelo impactado, se procedió a realizar diluciones cualitativas en placas multipocillos a partir de los cultivos de enriquecimientos. Para lo cual, se adicionó 2 mL del medio de cultivo a las placas multipocillos y se inoculó 1 mL del cultivo de enriquecimiento al primer pocillo; posteriormente, se realizaron diluciones seriadas. . Más tarde, se observaron al microscopio con contraste de fase, entre cubre y porta, las preparaciones alícuotas de los diferentes cultivos obtenidos en las placas multipocillo.

2.6 Aislamiento y caracterización de Shewanellae

2.6.1 Muestras En frascos estériles de 50 mL se adicionaron 5 gramos de suelo I (impactado) y en paralelo 5 g de suelo natural. Se llenaron los frascos hasta la superficie superior, con el objetivo de reducir al máximo la presencia de oxígeno.

2.6.2 Medios de cultivo Medio LB pH 7,2 + lactato (20 mM) y tiosulfato (50 mM). Los frascos se incubaron en incubadora a temperatura de 30o C en condiciones estáticas durante una semana, como mínimo. Posteriormente: - Se inoculó sobre medio LB sólido +lactato+tiosulfato (100 µL de cada cultivo (SN y SI)) con el objetivo de aislar todos los representantes microbianos del género, que estuviesen presentes. A cada colonia aislada se le realizaron pases

sucesivos, sobre medio agarizado, hasta obtener colonias aisladas. Después se realizó su identificación mediante el sistema API 20NE. -Cada colonia aislada fue inoculada sobre medio sólido M1; todas las placas se incubaron en jarra de anaerobiosis. Una vez obtenidas las colonias se le siguió dando pases sucesivos bajo esta condición de cultivo. -Se tomó una alícuota del sobrenadante de cada cultivo de enriquecimiento líquido (SN y SI) para determinar la concentración de hierro en solución mediante lecturas en absorción atómica. Además, se tomaron muestras de los precipitados de color negro para realizarles difracción de rayos X. Medio M1 Está compuesto por Buffer fosfato pH 7,0 -PB), solución de elementos trazas (MSS); solución de sales básicas ( BSS). Se le adiciona mezcla de aminoácido o extracto de levadura o extracto de suelo. Fuente de carbono (lactato) y aceptor de electrones (óxido de Fe(III)). Se pesaron 0,95 g de oxido de hierro por cada frasco a utilizar. Se taparon con tapón de algodón y se esterilizó en autoclave a 1210 C durante 15 minutos. Posteriormente, se le adicionó medio de cultivo M1 estéril hasta la parte superior del frasco. El volumen efectivo fue de 60 mL. Cada frasco se inoculó a partir de las colonias aisladas bajo condición de anaerobiosis y, por último, se cerraron herméticamente los frascos o ampolletas con la ayuda del sellador y las tapas metálicas. Por último, se incubaron bajo condiciones estáticas durante más de un mes. Posteriormente, se tomó una alícuota para observar bajo el microscopio y determinar presencia y viabilidad bacteriana.

2.6.3 Caracterización molecular Los aislados puros que cumplieron con los prerrequisitos anteriores, se enviaron a caracterizar molecularmente por técnicas de hibridación de ADN y PCR para comprobar su identificación.

2.7 Aislamiento y caracterización de representantes de la comunidad bacteriana autótrofa

2.7.1 Bacterias oxidantes del azufre 10 g de suelo se adicionaron a 90 mL del medio de cultivo estéril OK y 1 g de azufre elemental (pH 2,5). Los frascos se incubaron en agitación (150 rpm) a 30o C.

2.7.2 Bacterias oxidantes del hierro

10 g de suelo se adicionaron a 90 mL del medio de cultivo estéril 9K y solución de sulfato ferroso (pH 2,5). Los frascos se incubaron en agitación (150 rpm) a 30o C .

2.8 Conservación de los cultivos Se utilizó el método de conservación en congelación. Para lo cual 600 µL de cultivos de una noche, se inocularon en 400 µL de solución de glicerol al 50 % estéril, y por último se guardaron para su conservaron a – 20oC.

3. Resultados

3.1 . Aislamiento de los representantes de la comunidad microbiana heterótrofa “convencional”

En la tabla 1 se muestran la concentración de

la

población

bacteriana

heterótrofa convencional presente en las dos muestras objeto de estudio en este trabajo: suelo natural (SN) y suelo I (SI). Tabla 1. Poblaciones bacterianas Muestra LB SN SI

Población bacteriana heterótrofa (UFC/mL) LB+ES Agar almidón Agar sabouraud

2,2 x 105 0

2,5 x 105 2,0 x10

8,0 x 103 0

0 0

En la figura 1 se aprecia la diversidad bacteriana presente en el suelo natural. Resultados similares se obtuvieron al inocular la misma muestra (SN) en el medio de cultivo LB pero con adición de extracto de suelo. Al inocular la muestra SI sobre los medios LB, LB+ES, Agar Almidón y Sabouraud glucosa sólo se obtuvieron colonias en el medio LB+ES; el número de colonias fue mínimo (Figura 3) en comparación con las obtenidas del suelo natural.

Figura 1. Población bacteriana heterótrofa presente en el suelo natural (SN). Inóculo (100 µL), medio nutritivo (LB), Temp. 30º C durante 48 horas.

Las características físicas y químicas del suelo natural fueron favorables para el crecimiento de la microbiota heterótrofa y no así las del suelo impactado (Figura 2 y Figura 3), lo que evidencia carencia de materia orgánica en el SI lo que limita el desarrollo de microorganismos heterótrofos. El mantenimiento de las diversas poblaciones de microorganismos del suelo es un prerrequisito para un suelo “saludable”.

Figura 2. Inóculo (100 µL) de la disolución de la muestra SI, medio nutritivo (LB), Temp. de 30o C durante 48 horas.

Figura 3. Representantes de la población bacteriana heterótrofa del suelo impactado (S I), inóculo: 100 µL de la disolución, medio LB+ES, incubación a 30o C durante 48 horas.

3.2 Caracterización de los representantes de la

comunidad microbiana

heterótrofa “convencional”

3.2.1 Pruebas fisiológicas y bioquímicas

Teniendo en cuenta la actividad de los microorganismos en el suelo, se seleccionaron algunas pruebas para iniciar la caracterización de los aislados (Tabla 1). El 50 % del total de los aislados heterótrofos del suelo natural manifestaron fenotípicamente el carácter de diazotrofía (fijación biológica del dinitrógeno), lo que se evidenció por el crecimiento de las bacterias en los medios de cultivo Ashby y/o Rojo Congo (Figura 4). A estos medios de cultivo no se le adicionó fuente de nitrógeno. La diazotrofía es un carácter muy importante en las bacterias del suelo. Ninguno de los dos aislados del SI mostró este carácter. Por otro lado, se conoce que los microorganismos productores de sideróforos juegan un papel muy importante en el suelo, ya que estos compuestos reducen la población rizosférica de hongos y bacterias fitopatógenas (Buysens, y cols, 1996). Ninguno de los aislados del SN ni del SI produjeron pigmento fluorescente al cultivarlos sobre medio Agar King B, lo que evidencia la no producción de sideróforos (Tabla 2). Este resultado pudiera estar en correspondencia con las características químicas del suelo en estudio, ya que los sideróforos se producen en ambientes con bajas concentraciones de hierro (Villegas y cols, 2002), aspecto que no cumplen las muestras analizadas en este trabajo. Esto evidencia la interacción genotipo-fenotipo-medio ambiente. Los microorganismos solubilizadores de P pueden constituir hasta el 40 % de las poblaciones cultivables de los microorganismos del suelo. Estos juegan un papel importante en la mineralización del Po del suelo y su contribución a la actividad fosfatasa total del suelo es considerable (Richardson, 1994).

El fósforo inorgánico del suelo puede encontrarse como anión de fosfato que es adsorbido por los constituyentes del propio suelo mediante asociaciones relacionadas con las cargas; sales como óxidos de hierro y aluminio, silicatos de aluminio y carbonatos de calcio; o dependiendo del pH, existen como precipitados pobremente solubles de Ca-P en suelos alcalinos y Fe-P y Al-P en suelos ácidos (Sanyal y De Datta, 1991). Estas formas precipitadas de P incluyen un rango de mono-(Ca5(PO4)3OH y fluoro (Ca5(PO4)3F) apatitas y además varias formas amorfas y cristalinas de Al-P y Fe-P que incluyen a la berlinita (AlPO4). El 25 % de los aislados del suelo natural expresaron capacidad de síntesis de fosfatasa ácida (Tabla 2).

En las figuras 5A y 5B

se observa

el fenotipo

fosfatasa ácida positivo en los aislados ES3, ES5, ES6 y Es8a lo que se expresó por la coloración verde del cultivo sobre el medio agar LB suplementado con fenolftaleína difosfato y verde de metilo (Riccio y col, 1997).

Tabla 2. Pruebas fisiológicas y bioquímicas. Aislados

T.Gram

Oxidasa

M.Ashby

Rojo Congo

King B (Pigmento fluorescente)

citrato

Fosfatasa ácida

Ca3(PO)2 Crec/acidez

LB1/SN

-

-

+

-

-

´+

-

+

Gluc y Lac. (f) No gas

LB2/SN LB3/SN LB4/SN LB5/SN LB6/SN LB7/SN LB8/SN LB9/SN LB10/SN LB11/SN LB12/SN ES1/SN

-

+ + + + -

+ + + + +

+ + + + -

-

+ + + NI NI NI ´+ -

+++ NI +++ -

+ + + NI NI NI NI NI +

SI SI

ES2/SN ES3/SN ES4/SN ES5/SN ES6SN ES7/SN ES8a/SN ES9/SN ES10/SN ES11/SN ES12/SN ES1/SI ES2/SI

-

NI NI + -

+ + + + + + -

+ + + + + + -

-

´+ + + + -

+++ +++ +++ +++ -

+ + + + NI NI + -

Leyenda: + (Crecimiento), +++ (expresión fenotipica de la fosfatasa ácida), - (no crecimiento), NI (no inoculación).

Kligler

Gluc (f) Gluc y Lac. (f) No gas

NI NI

Figura 4. Crecimiento sobre medio Rojo Congo. Incubación 30o C, durante 24 -72 horas.

Figura 5. Determinación cualitativa de la actividad fosfatasa ácida. Medio LB + fenolftaleína di-fosfato (PDP) +Verde de metilo pH 7,2. Incubación 24 horas a Temp. 30o C.

3.3 Aislamiento y caracterización de representantes de la comunidad bacteriana del ciclo del hierro

3.3.1 Bacterias acidófilas La acidofilia obligada es un carácter bien definido entre las bacterias pero no está restringido a un grupo particular. En función de la fuente de carbono pueden ser agrupadas en autótrofas y heterótrofas. Teniendo en cuenta que uno de los caracteres para la clasificación fenética de las bacterias es la ecología, en esta ocasión se seleccionó sólo el SI para definir el carácter acidófilo de sus representantes. El pH del SN no se encuentra en un rango ácido. En las figura 6 se muestran los cultivos de enriquecimiento de bacterias heterótrofas acidófilas del suelo impactado. En los tres medios de cultivo selectivos se observan cambios físico-químicos. Se empleó como fuente de carbono glicerol o glucosa; por tal motivo aseveramos la presencia de bacterias

heterotrofas y como el pH de los medios se ajustó entre 2,5 y 3,0, se demuestra el carácter acidófilo de los cultivos. Al incubar con agitación (Figura 6A y Figura 6B) y anaerobiosis (Figura 6C), se produjeron cambios de coloración de transparente (medio sin inocular-no mostrado) a tonalidades de ámbar a ámbar rojizo (Figura 6A y Figura 6B). También se aprecia la formación de una biopelícula o precipitado de color negro cuando la muestra se incubó en ausencia de oxígeno (Figura 6C). Estos

cambios

evidencian

la

presencia

de

bacterias

heterótrofas

acidófilas: oxidadoras (Figuras 6A y 6B) y reductoras (Figura 6C) de hierro en el suelo impactado. En los procesos de oxidación de sulfuros, como pirita y calcopirita, se forman jarositas que son precipitados insolubles de sulfatos de hierro hidratados (figura 6A). A diferencia, del frasco correspondiente a la figura 6C (condiciones de anaerobiosis) donde no se aprecia la formación de estos compuestos insolubles de hierro (III) en la pared del frasco. En este caso, además del cambio de coloración del medio líquido también se aprecia un precipitado de color negro sobre la muestra sólida residual. De este precipitado se podría inferir la formación de un sulfuro de hierro por la acción combinada de bacterias acidófilas reductoras de hierro y reductoras de sulfato. El hierro ferroso se encuentra en bajas concentraciones en la biosfera y los compuestos que contienen hierro férrico, específicamente óxidos insolubles e hidróxidos, son más abundantes aunque el hierro ferroso puede generarse por la acción de los microorganismos en zonas anaeróbicas (Figura 6C). Algunas bacterias heterótrofas acidófilas poseen la capacidad de reducir hierro férrico (Figura 6C). Entre estas se citan a Acidiphilium organovorum, A. cryptum y A. ferrireductans (SHJ) (Jonhnson y Mc Ginness, 1991, Johnson, 1995). A.ferrireductans posee un sistema reductor de hierro constitutivo pero es también capaz de oxidar hierro ferroso bajo condiciones de aerobiosis (Bridge y Johnson, 1995).

Biopelícula

Actividad bacteriana

Biooxidación del Fe (II)

Biorreducción de Fe (III) y sulfato

A

B

C

Figura 6. Cultivo de enriquecimiento de microorganismos acidófilos al adicionar 5 g de suelo impactado (SI) en tres medios de cultivos diferentes: A: (sulfato ferroso /glicerol/Extracto de levadura 0,02%, pH 3,0 /aerobiosis)

B : Medio Harrison: Glucosa/extracto de levadura/aerobiosis

C: (sulfato férrico/glicerol/Extracto de levadura 0,02%, pH2,5/anaerobiosis). Temperatura 30o C. Aerobiosis: agitación 150 rpm Anaerobiosis: Llenado total del frasco con medio de cultivo, cierre hermético y no agitación.

Posteriormente, se procedió al aislamiento y purificación de los representantes microbianos presentes en los cultivos de enriquecimiento del SI (Figuras 7 y 8). Después, se realizaron preparaciones en fresco de los diferentes cultivos de las placas multipocillo. Estos se observaron bajo el microscopio de contraste de fase. En todos los cultivos se observaron células con diferentes morfologías, como cilindros, espirilos, vibrios, esféricas y algunos bacilos con estructuras refringentes en uno de los extremos de la célula. En todos los casos las células presentaron motilidad.

Los resultados de las Figuras 9 y 10 (FEG y SEM) demuestran la presencia de una comunidad bacteriana heterótrofa, acidófila, reductora de hierro (III) en el suelo impactado en correspondencia con las características física-química de la muestra.

CE: cultivo de enriquecimiento de BRFe (SI) en medio con Glicerol / sulfato férrico

S

S

F

F

Figura 7. Aislamiento de bacterias heterótrofas acidófilas por diluciones seriadas (1 mL de cultivo de enriquecimiento de BRFe (III) en 2 mL de medio CBM. Incubación Temp. 30o C durante 8 días. S: la alícuota para las diluciones se tomó de la superficie. F: la alícuota para las diluciones se tomó de la superficie.

Figura 8. Aislamiento de bacterias heterótrofas acidófilas mediante diluciones seriadas (1mL del cultivo de enriquecimiento de BRFe (III) en 2 mL de medio Harrison). Incubación a. 30o C durante 8 días. S: la alícuota para las diluciones se tomó de la superficie. F: la alícuota para las diluciones se tomó de la superficie.

presente en el suelo impactado (SI) al enriquecerla en medio de cultivo selectivo para bacterias En las que en el suelo impactado existe Del cultivo de enriquecimiento del SI que fue incubado bajo condiciones de anaerobiosis (Figura 6C) se tomó una alícuota y se procedió con la metodología para obtener preparaciones para observarlas al microscopio electrónico, a continuación una representación de las células observadas.

Element OK Mg K Al K Si K PK SK KK Fe K Cu K Zn K As L Pb M Totals

App Conc. 29.96 0.21 1.40 8.42 2.11 4.48 0.59 131.70 1.90 13.27 0.08 0.76

Intensity Corrn. 1.1272 0.3686 0.4834 0.6044 0.9376 0.7719 1.0728 0.9577 0.8442 0.8589 0.5599 0.7357

Weight% 12.72 0.28 1.39 6.66 1.08 2.78 0.26 65.79 1.08 7.39 0.07 0.50

Weight% Sigma 0.15 0.06 0.05 0.08 0.05 0.06 0.03 0.25 0.11 0.17 0.10 0.15

Atomic% 31.36 0.45 2.03 9.36 1.37 3.42 0.27 46.48 0.67 4.46 0.04 0.09

100.00

Figura 9. Espectro (FEG) del cultivo de enriquecimiento del SI (5 g) en medio glicerol (10 mM), sulfato férrico (25 mM, pH 2,5). Llenado del frasco con medio de cultivo hasta el tope o parte superior. Incubación en condiciones estáticas.

A

B

C Figura 10. Microfotografías de representantes bacterianos de bacterias heterótrofas acidófilas del ciclo del hierro. Cultivo de enriquecimiento del SI (5 g) en medio glicerol (1 0mM), sulfato férrico (25 mM), pH 2,5. Llenado del frasco con medio de cultivo hasta el tope o parte superior. Incubación en condiciones estáticas.

3.3.2 Bacterias neutrofilas. Enriquecimiento de representantes del género Shewanellae (BRFe)

Shewanellae, como grupo bacteriano, ha sido considerado como un sistema modelo excelente para el estudio de la biorremediación de los metales toxicos. Su capacidad para reducir U (VI) a U (IV) insoluble y Cr (VI) a Cr (III) insoluble ha dado a este grupo un gran protagonismo en sistemas contaminados, donde la adición de nutrientes y la adición de microorganismos podrían ser utilizadas para la inmovilización in situ de elementos tóxicos. En la figura 11 se visualiza la formación de pirita a causa de la acción de la comunidad bacteriana reductora de Fe (III) presente tanto en el suelo natural (Figura 11A) como en el suelo impactado (Figura 11B). Visualmente, el precipitado fue mayor en el frasco del suelo impactado (B).

A

Figura 11 . Cultivo de enriquecimiento de la población bacteriana FeR obtenida de la inoculación de SN (frasco A) y SI (frasco B) a los 8 días de incubación en condiciones estáticas. Medio LB+lactato + tiosulfato. Temperatura 30o C

B

Entre las características distintivas del género Shewanellae se citan: -

Metabolizar el lactato como fuente de carbono vía respiración anaerobia utilizando como aceptor de electrones tiosulfato, nitrato o/y óxidos de metales. Este aspecto se demuestra en la Figura 11, lo que se puso de manifiesto con ambas muestras analizadas.

-

Metabolismo anaerobio. Este aspecto también se demostró al cultivar los aislados sospechosos de BRFE,

posible Shewanellae, bajo condición

anaerobia. -

La producción de H2S durante el crecimiento anaeróbico en presencia de tiosulfato.

Esta

característica

también

se

puso

de

manifiesto

inmediatamente al destapar los cultivos de enriquecimientos de SN y SI. El mayor desprendimiento de este gas ocurrió en la muestra de suelo impactado, así como la mayor cantidad de precipitado (sulfuro de hierro) (Figura 11B). Esto podría deberse a que la concentración de hierro en el suelo impactado es casi (25 %) tres veces superior a la del suelo natural (9 %). Por otro lado, la concentración de

hierro en disolución, en los cultivos

enriquecidos, se determinó mediante lecturas en Absorción Atómica y se constató que el cultivo de SN presentó 0,8 ppm mientras que el SI fue de 105,5 ppm. De estos datos, se infiere que hubo mayor actividad reductora de Fe(III) en la muestra de SI. En la Figura 12 se muestra el análisis del cultivo SI por FEG.

Element OK Na K Al K Si K SK Ca K Fe K Totals

App Conc. 44.32 0.65 0.20 1.65 17.12 1.32 69.21

Intensity Corrn. 1.0614 0.4118 0.5472 0.6771 0.8583 1.0266 0.9054

Weight% 29.04 1.09 0.26 1.70 13.87 0.89 53.15

Weight% Sigma 0.26 0.13 0.07 0.07 0.13 0.05 0.25

Atomic% 54.36 1.42 0.29 1.81 12.95 0.67 28.50

100.00

Figura 12 . Espectro (FEG) del cultivo de enriquecimiento del SI (5 g) en medio glicerol (10 mM), sulfato férrico (25 mM), pH 2,5. Llenado del frasco con medio de cultivo hasta el tope o parte superior. Incubación en condiciones estáticas.

3.3.3 Análisis de difracción de rayos X

Se tomaron de los cultivos de enriquecimientos (suelo impactado y del suelo natural) los precipitados formados por la actividad bacteriana reductora de hierro (III) presente en las muestras bajo análisis. En las figuras 13 y 14 se muestran los difractogramas obtenidos. En el del primer caso (SI) se observaron bandas correspondientes a las fases: sílice, clorita y sulfuro de cobre (II)

C o unts 300

je s us -1

200

100

0 10

20

30

40

50

60

70

80

P o s itio n [°2 The ta ]

Figura 13. Difractograma de rayos X correspondiente al precipitado producido por el crecimiento de microorganismos reductores del hierro sobre el suelo impactado por el vertido de residuos En el caso del cultivo de enriquecimiento del suelo se observan las bandas correspondientes a: sílice, calcita, sulfuro de cobre (II) y algo de óxido férrico.

Las bacterias mesófilas que respiran Fe(III) pertenecientes a la subclase Gamma Proteobacteria, utilizan Fe (III) y O2 como aceptores finales de electrones. Entre estos se citan a los géneros Shewanellae, Ferrimonas y

Aeromonas. Utilizan H2 y sólo un rango muy limitado de ácidos orgánicos (lactato y piruvato) como dadores de electrones para reducir Fe(III) y Mn (IV).

Counts jesus-2

200

100

0 10

20

30

40

50

60

70

80

Position [°2Theta]

Figura 14. Difractograma de rayos X correspondiente al precipitado producido por el crecimiento de microorganismos reductores del hierro sobre el suelo natural

Las microfotografias que se muestran a continuación (Figuras 15 a 17) evidencian la presencia de bacterias reductoras de hierro correspondientes al género Shewanella. Esto se afirma teniendo en cuenta que tanto los cultivos de enriquecimiento como los cultivos puros aislados de SN y SI crecieron bajo las condiciones

selectivas

del

género

Shewanellae.

Estos

cultivos

fueron

codificados como BRFe y un número consecutivo más las iniciales del suelo (SN o SI). Una de las características más distintivas fue la formación del producto maloliente H2S, debido al metabolismo del tiosulfato adicionado al medio; éste fue reducido por la acción microbiana observándose el desprendimiento del citado gas que produjo el olor y burbujeo característico al destapar el frasco. Otra prueba fue la formación de sulfuros de hierro (Figuras 11A y 11B) por el

metabolismo del lactato y tiosulfato. Por último, el crecimiento bacteriano se produjo sobre medio M1 con óxido de hierro reactivo como aceptor final de electrones. Otra característica distintiva del género es la presencia de flagelos y pilis; en las microfotografías obtenidas a partir de colonias puras, se aprecia la presencia de flagelos (Figura 17) y la morfología cilíndrica de los cultivos. Ante la tinción de Gram respondieron de forma negativa.

A

B

C

D

E

Figura 15. Microfotografias de representantes microbianos del SI proveniente del cultivo de enriquecimiento obtenido de la adición de SI en medio LB+lactato + tiosulfato. Temperatura de 30o C a los 8 días de incubación en condiciones estáticas.

F

Figura 16. Microfotografias de representantes microbianos del cultivo sobre medio agar M1, temperatura 30o C a los 8 días de incubación. Inóculo (pirita formada en el fondo del cultivo de enriquecimiento del SI en medio LB+lactato + tiosulfato).

Flagelos

Figura 17. Microfotografia al FEG de una colonia aislada de posible Shewanellae, obtenida en medio agar M1 (lactato y tiosulfato). Incubada en jarra de anaerobiosis, Temperatura de 30º C durante 6 días.

3.1 Enriquecimiento de bacterias autótrofas acidófilas Las dos muestras de suelos bajo estudio fueron adicionadas a medio 0 K con azufre como fuente energética. En el frasco donde se adicionó SN (Figura 18) no se aprecia cambio de coloración del medio; dicha coloración es marrón como consecuencia de la dispersión de la muestra en el medio líquido. Mientras que en el cultivo de la muestra de SI se infiere la presencia de bacterias oxidantes de hierro(II) y azufre. Esto se constató por la disminución del pH del medio de cultivo y la formación de jarositas adheridas a las paredes del frasco que contenía los cultivos.

Sin inocular

SN

SI

Figura 18. SN y SI en medio 0 K. Agitación de 150 rpm a 30º C, durante dos meses de incubación.

4. Conclusiones 1.- Se aislaron,

conservaron

y caracterizaron

25 cultivos bacterianos

heterótrofos mesófilos del suelo natural y dos cultivos del suelo impactado (SI). La biota bacteriana del suelo natural es heterogénea y presenta una alta incidencia de bacterias transformadora de la materia orgánica; aspecto que es mínimo en el suelo impactado. 2.- En ambos suelos se detectó la presencia de bacterias heterótrofas reductoras de hierro. 3. También se detectó la presencia de una comunidad microbiana heterotrofa reductora de hierro en el suelo impactado, tanto acidófila como neutrófila. 4.- Hubo formación biogénica de sulfuro de hierro por la actividad bacteriana anaeróbica del ciclo del hierro. 5.- Se demostró la interacción ambiente-genotipo y la

incidencia de la

actividad antropogénica en los ecosistemas microbianos analizados.

Referencias - Bryan, C. G., Hallberg, K. B., Johnson, D. B.. 2005. Microbial populations of tailings spoil at the Sao Domingos former copper mine. Proceedings of the 16th International Biohydrometallurgy Symposium. Editors: STI. Harrison, De Rawlings and J. Petersen. ISBN: 1-920051-17-1.

- Buysens, S., Heungens, K., Poppe, J and M. Hofte. (1996). Involvement of pyochelin and pyoverdin in suppression of Pythium induced damping off of tomato by Pseudomonas aeruginosa 7NSK2 . Appl Environ Microbiol. 62: 865871

- Díaz de Villegas, M. E., Villa, P., Frías, A. 2002. Evaluación de la producción de sideróforos por Pseudomonas aeruginosa PSS. Rev. Latinoam. Microbiol. Vol. 44 No. 3-4, pp.112-117.

- Harrison, A.P. J (1984). The acidophilic thiobacilli and other acidophilic bacteria that share their habitat. Annu. Rev. Microbiol. 38, 265-292.

- Johnson, D.E 1995. Acidophilic microbial communities candidates for biorremediation of acidic mine effluents. Int. Biodeter. Biodegrad, 41-58.

- Jonhnson, D.B., McGinness, S. 1991. A highly efficient and universal solid medium for growing mesophilic and moderately thermophilic, iron-oxidizing, acidophilic bacteria. J. MIcrobiol. Methods 13, 113-122.

- Riccio, M.L., Rossolini, G.M., Lombardi, G., Chiesurin, A, y Satta, G (1997). Expression cloning of different bacterial phosphatase-encoding genes by histochemical screening of genomic libraries onto an indicator medium containing phenolphthalein diphosphate and methyil green. J.Appl. Bacteriol, 82:117-185.

- Richardson, A.E. 1994. S microorganisms and phospohorous avaliability. In “Soil biota management in sustainable farming systems. Eds CE Pankhurst, BM Doube. VVSR Gupta and PR Grace. Pp. 50-62. ( CSIRO Publishing Melbourne). -Sanyal, S.K., De Datta, S.K. 1991. Chemistry of phosphorus transformations in soil. Advances in Soil Science 16: 1-120.

- Sambrook, J.; Fritsch, E.F and Manniatis, T. (1989).

Molecular cloning: a

laboratory manual. 2nd ed .Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.. Cold