BIO MÉTODOS DE ESTUDIO DE LA CÉLULA TÉCNICAS DE ESTUDIO DE LA CELULA El desarrollo de la biología celular y molecular se produce en forma paralela a la invención de instrumentos y técnicas biofísicas y bioquímicas que extienden los sentidos a nuevos límites y acrecientan el conocimiento de la estructura y funcionamiento de la célula. El acceso a este tipo de conocimiento resulta dificultoso pues las células son pequeñas y transparentes. El ojo humano sólo puede discriminar dos puntos separados por más de 0,1 mm ó 100 micrómetros (mm). La mayoría de las células son mucho más pequeñas y se necesita del microscopio óptico cuyo límite de resolución es de 0,2 mm. Para estructuras más pequeñas, que midan entre 0,4 y 200 nanómetros (nm), se requiere del microscopio electrónico. Para mayores detalles, consulte la Tabla 1a.2 Como se aprecia, las principales unidades de medida que se emplean corrientemente en microscopia no son las de uso cotidiano. En la siguiente tabla se expresan aquellas unidades y sus equivalencias: Medidas utilizadas en microscopia Unidad

Símbolo

Equivalencia en metro (m)

Utilización principal en citología

Centímetro

cm

0,01 metro

Objetos macroscópicos a simple vista. Huevos grandes.

Milímetro

mm

0,001m

Objetos macroscópicos a simple vista. Células muy grandes.

Micrómetro

mm

10-6 m

Microscopia de luz (óptica) Casi todas las células y orgánulos grandes.

Nanómetro

nm

10-9 m

Microscopia electrónica. Orgánulos pequeñas, macromoléculas grandes.

Angstrom

Å

10-10 m

Microscopia electrónica. Métodos de difracción de rayos X. Moléculas y átomos.

Por lo tanto: 1m=102 cm=102 mm=103 mm=106 nm=109 Por otra parte, la mayoría de los componentes de la célula viva son transparentes debido a su alto contenido de agua. Al disecarla no presenta un significativo contraste. Entonces la tinción selectiva de ciertos componentes celulares resuelve el problema del contraste. Sin embargo la mayoría de estas técnicas conduce a la muerte de la célula y aún más, a cambios químicos y morfológicos que no se encuentran en las células activas y en la matriz extracelular. Cabe destacar que algunos pigmentos del citoplasma y de orgánulos vegetales pueden absorber

determinadas longitudes de onda y no necesitan de previo tratamiento para su observación al microscopio óptico. Para el estudio de la célula viva se emplean técnicas ópticas especiales como, por ejemplo, la microscopia de contraste de fase o la de interferencia.

Imagen 1. Principales medidas En el nivel macromolecular, la difracción de rayos X resulta ser la técnica más adecuada para estudiar la configuración molecular de proteínas, de ácidos nucleicos y de algunos entes prebióticos tales como los virus. Los compuestos químicos que constituyen la célula pueden ser detectados, descriptos y localizados dentro y fuera de la célula mediante métodos adaptados de la Química Analítica. Las técnicas aislamiento y separación específica de células, orgánulos y macromoléculas y el preparado de cultivos celulares para el estudio detallado son herramientas invalorables para el avance de la biología celular y molecular. El descubrimiento y estudio temprano progresó con la invención y mejora de los microscopios en el siglo XVII. Los microscopios de varios tipos son aún herramientas indispensables para el estudio de las células. Los microscopios primeramente usados en el Renacimiento tanto como los que son utilizados en los laboratorios hoy, son microscopios ópticos. La luz visible pasa a través de la muestra y de las lentes de vidrio por donde la luz es refractada (“doblada”) de tal manera, que la imagen del espécimen es amplificada cuando se proyecta en el ojo.

Imagen 2. Partes del microscopio óptico Dos valores importantes en microscopia son el aumento y el poder de resolución. Entendemos por aumento a las dimensiones aparentes de los objetos comparados con su tamaño real. El poder de resolución es la medida de la nitidez de la imagen; es la capacidad del instrumento para brindar imágenes distintas de dos puntos cercanos. El microscopio óptico nunca puede resolver detalles menores a 0,2mm, la medida de una pequeña bacteria. Esta resolución es limitada por la longitud de onda de la luz visible usada para iluminar la muestra. Los microscopios ópticos o de luz pueden aumentar efectivamente alrededor de 1000 a 1500 veces el tamaño de la muestra real; si se incrementase el aumento la imagen proyectada sería borrosa. La mayoría de las mejoras en microscopia de luz del comienzo de este siglo ha involucrado nuevos métodos para aumentar el contraste. Sin estas técnicas sería imposible para el ojo humano el conocimiento del mundo celular. La mayoría de las orgánulos son demasiado pequeños para ser visualizadas por la microscopia de luz. La Biología Celular avanzó rápidamente hace un poco más de cincuenta años con la introducción del microscopio electrónico. En lugar de luz visible, el microscopio electrónico utilizó un haz de electrones a través de la muestra. El poder de resolución está inversamente relacionado con la longitud de onda (l) de la radiación que un microscopio usa y un haz de electrones tiene longitudes de onda mucho más cortas que la luz visible. Para mayores precisiones al respecto, consulte el cuadro.

Imagen 3. Diferencias entre el microscopio óptico y electrónico La mayoría de los microscopios electrónicos modernos pueden lograr una resolución de 0,2 nm, unas 1000 veces mejor que la obtenida con el microscopio óptico. Los biólogos usan el término ultraestructura celular para referirse a la anatomía celular cuando se resuelve por un microscopio electrónico. Hay dos tipos de microscopio electrónico: el microscopio electrónico de transmisión (MET) y el microscopio electrónico de barrido (MEB): • El MET permite develar la ultraestructura de las células y de la matriz extracelular. El haz de electrones es desviado por un campo electromagnético (que actuaría como lente). En este tipo de microscopia se requiere que las muestras tengan un grosor de 100 nm. • El MEB es especialmente útil para estudios de superficie del espécimen. El haz de electrones explora la superficie de la muestra la que usualmente se recubre con una película de oro. El haz excita a los electrones sobre la superficie de la misma muestra y estos electrones secundarios se recolectan y enfocan sobre una pantalla. Esto forma una imagen de la topografía del espécimen. Un importante atributo del MEB es su gran profundidad de campo, la cual resulta en una imagen tridimensional. El ME revela muchos orgánulos que son imposibles de resolver con MO. Pero el MO ofrece muchas ventajas especialmente para el estudio de la célula viva. Una desventaja de ME es que los métodos químicos y físicos usados para preparar la muestra, no sólo matan a las células sino que puedan introducir artefactos, estructuras peculiares vistas en micrografías que no existe en una célula viva. La preparación de la muestra para el MO y el ME resulta similar si se trabaja con las células muertas. En la tabla se comparan los pasos a seguir en ambos tipos de microscopia para la preparación de la muestra: Técnicas para Preparar una Muestra en Microscopia Óptica y Electrónica

Paso

Microscopia Óptica

Microscopia Electrónica

Pueden usarse fijadores químicos (formol, etanol, metanol o mezclas fijadoras). También se utilizan métodos físicos como la desecación, el calor seco, el frío o la congelación.

Se realiza con paraformaldehido, con tetróxido de osmio o, últimamente, con glutaraldehido, en soluciones acuosas de pH neutro y concentración salina semejante al medio. Luego se lava la pieza y se post-fija con tetróxido de osmio durante una hora; el osmio se une a estructuras lipoproteicas (membranas celulares) ofreciendo mayor contraste en la imagen. Esto se conoce como coloración o contrastado.

Obtención: Se hace cuidadosamente con instrumental adecuado. Fijación: se destina a impedir la autodegradación enzimática (autólisis)de las células tratando de evitar, en lo posible, la alteración de las estructuras originales y su autodigestión.

Deshidratación: retira el agua Pasajes sucesivos por alcoholes Baños con alcohol o acetona. de las piezas fijadas, para que de concentración creciente. luego puedan ser incluidas en un elemento que es insolubles en solventes acuosos. Aclaración

Se realiza para eliminar de la No requiere muestra restos de alcohol y toda sustancia hidrosoluble. Se impregna la muestra con un solvente no acuoso, orgánico y soluble en parafina, como xileno, tolueno o benceno.

Inclusión

Se incluye el material en parafina o celoidina previamente calentada, la que al solidificarse sirve de sostén de la muestra y posibilita su corte. Se forma el taco.

Corte

Es lo suficientemente delgado Debe obtenerse un corte de la como para ser atravesado por la muestra tal que el haz de luz. Esto se logra utilizando electrones logre atravesarla. el micrótomo con el que se El ultramicrótomorealiza cortes realiza cortes uniformes del de 20 a 100 nm de espesor con cuchillas de vidrio o diamante. tejido a un dado espesor.

Se utilizan resinas sintéticas tipo epoxi que luego de secarse se transforman en un material muy duro, apto para que se le efectúen cortes extremadamente delgados.

Rehidratación

Se retira la parafina con xilol y se lava con alcoholes de concentración creciente. Al ser los colorantes solubles en agua resulta indispensable rehidratar

Coloración

Las células y los tejidos son coloreados para lograr mayores contrastes facilitando la observación. La coloración de hematoxilina-eosina es una de las más comúnmente utilizadas. Tiñe el núcleo de azul y el citoplasma de rosa.

Montaje

El corte se monta sobre un Estas muestras se montan en portaobjetos. El cubreobjetos pequeñas grillas de cobre El corte se coloca sobre ciertas puede colocarse por encima clases de estructuras. para proteger el preparado. Este puede conservarse durante décadas si el cubreobjetos se sella. Contrastado

La pieza se impregna en acetato de uranilo, citrato de plomo u otras sustancias.

Las diferencias más notables de los principales componentes del MO y del ME y sus características singulares se especifican en la siguiente tabla. Diferencias entre el MO y ME Microscopio Óptico

CARACTERÍSTICA

Microscopio Electrónico

De interferencia de rayos luminosos

1) IMAGEN DADA POR MECANISMO:

De dispersión de electrones

Simple con aire

2) TUBO

Al vacío con gran diferencia de potencial

Luz (fotones)

3) FUENTE

Filamento de tungsteno (electrones)

Lentes: Ocular, objetivo y 4) ELEMENTOS condensador

Bobinas electromagnéticas

Células vivas o muertas

Células muertas

5) ESTUDIAN

Coloreadas o no

6) OBSERVACIÓN DE LA IMAGEN

Distintas tonalidades de gris. En la actualidad se ven imágenes "sombreadas" electrónicamente.

0,25m

7) LIMITE DE RESOLUCIÓN

3 Å a 5 Å (teórico) 10 Å (en la práctica)

5.500 Å (término medio)

8) LONGITUD DE ONDA

0,056 Å

500 X a 1500 X

9) AUMENTO (el signo X significa aumento)

30.000 X a 1.000.000 X

Carnoy u otros fijadores

10) FIJACIÓN

Bicromato de potasio, tetróxido de osmio, formaldehído.

Parafina o coloidina

11) INCLUSIÓN

Acrílicos o resinas de epoxi.

Con el micrótomo. 12) CORTES (cuchilla de acero). Cortes de 10m

Con ultramicrótomo. (cuchilla de diamante o vidrio) Cortes de 100 a 500 Å.

De vidrio

13) PORTAOBJETO

Placas de Colodion, aluminio o berilio.

Nivel microscópico:

14) NIVEL DE OBSERVACIÓN Nivel submicroscópico:

Estructura

ULTRAESTRUCTURA

Las células vivas pueden ser observadas a través del microscopio Se pueden utilizar ingeniosamente las propiedades ondulatorias de la luz aumentando el contraste de las estructuras transparentes. Así surgieron varias clases de microscopios ópticos convirtiéndose en herramientas destacadas en el estudio de la célula. Más aún, si se considera la posibilidad de que algunos componentes de la célula puedan perderse o distorsionarse durante la preparación de la muestra. En consecuencia, el examen de la célula viva (sin fijación ni congelación) resulta útil. Los microscopio de contraste de fase y de interferencia son sistemas ópticos especiales que logran intensificar la escasa interferencia y proporcionan mayor contraste que el obtenido con un MO común. En el microscopio de campo oscuro, el haz luminoso se proyecta oblicuamente y los sistemas de lentes detectan la luz reflejada por la muestra que se ve como un objeto brillante contra un fondo oscuro, lográndose un gran relieve de rasgos de la célula que son invisibles en el MO. El microscopio de luz polarizada puede proveer datos sobre la estructura a nivel molecular de las células y los tejidos no sólo en las células vivas sino en preparados post-mortem. Ciertos componentes celulares y tisulares se comportan peculiarmente cuando la luz polarizada (luz que

gira únicamente en un plano) los atraviesa.

Las orgánulos pueden aislarse para estudiarlos más profundamente La descripción de los diversos orgánulos dentro de la célula revela poco acerca de su función. La Biología Celular actual desarrolla la integración de la Citología con la Bioquímica, es decir el estudio de la estructura celular junto con el análisis de los procesos químicos de la vida (metabolismo). El fraccionamiento celular ha sido particularmente importante en esta ciencia. El objetivo del fraccionamiento celular es disgregar las células separando las orgánulos principales de modo que, sus funciones individuales puedan ser estudiadas. El instrumento usado para fraccionar las células es la centrífuga capaz de girar a diversas velocidades. La más poderosa, llamada ultracentrífuga puede dar vueltas tan rápidamente como 80000 revoluciones por minuto (RPM) y aplicar fuerzas sobre las partículas de 500000 veces mayores que la fuerza de la gravedad (500000g).

El fraccionamiento celular comienza con la homogeneización, o sea la ruptura de la célula. El objetivo es romper las células sin dañar severamente sus orgánulos. El homogenato se centrifuga lográndose la separación de las partes de la célula en dos fracciones: el pellet que consiste en las estructuras más grandes depositadas en el fondo del tubo y el sobrenadante constituido de partes más pequeñas suspendidas en el líquido por encima del pellet. El sobrenadante es transvasado a otro tubo y centrifugado otra vez. El proceso es repetido incrementando la velocidad en cada paso. De esta manera se consigue recolectar componentes más pequeños de los sucesivos pellets. El fraccionamiento celular permite preparar los componentes específicos de la célula tanto cualitativa como cuantitativamente. Las poblaciones celulares pueden ser separadas por el citómetro de flujo Este instrumento posee un tubo muy delgado por donde se hacen pasar a las células una tras otra. Un determinado tipo celular emitirá fluorescencia, previo tratamiento con fluorocromo (pigmento fluorescente). Esto permite la discriminación y, por lo tanto, la separación de las células así tratadas de acuerdo a la fluorescencia que emitan.

Imagen 4. Fraccionamiento celular

Las células vivas pueden ser estudiadas mediante el cultivo celular Con el objetivo de preservar toda la información que sea posible sobre todos los tipos celulares, se han desarrollado técnicas de disociación de las células. En los primeros tiempos, la técnica consistía en colocar un explante de un pequeño trozo de tejido en un medio compuesto por suero sanguíneo, extracto de embriones y solución salina. Hoy se conocen los requerimientos nutricios de las células eucariontes. Se las mantienen y hacen crecer en un medio sintético enriquecido de suero. Se distinguen tres tipos de cultivos: • Cultivos Primarios se obtienen de los animales o vegetales. El tejido se separa en condiciones asépticas y se corta en pequeños trozos y se los trata con tripsina (enzima proteolítica) que disocia los agregados celulares y genera una suspensión de células libres que se cultivan en un medio apropiado. • Cultivos Secundarios se obtienen mediante el tratamiento con tripsina de un cultivo primario, seguido de un nuevo cultivo en una caja de Petri. • Cultivos de líneas establecidas cuyo crecimiento se prolonga debido a las condiciones cancerosas de las células. Entre las más usadas se encuentran las células HeLa. A pesar de tales anomalías son muy útiles para el estudio del cáncer.

Las moléculas orgánicas son estudiadas dentro y fuera de la célula

A nivel molecular, los organismos están formados por relativamente pocos tipos de compuestos. El agua constituye alrededor del 70% de la mayoría de los seres vivos. De los demás compuestos, los principales son los glúcidos, los lípidos, las proteínas y los nucleótidos, muchos de ellos combinados para formar los ácidos nucleicos, ácido ribonucleicos (ARN) y ácido desoxirribonucleico (ADN). Aunque hay muchos otros compuestos presentes, estas cuatro categorías constituyen la mayoría de las moléculas orgánicas de los seres vivos y son los actores de los procesos metabólicos. Por lo tanto, su localización y función dentro de la célula como un estudio más detallado fuera de ella se hace necesario. Algunos ejemplos de técnicas para el estudio, la ubicación y la cuantificación de moléculas orgánicas se mencionan a continuación:

Reconstrucción de imágenes a partir de electromicrografías Las microfotografías electrónicas poco claras de cristales de moléculas o estructuras supramoleculares se colocan en la trayectoria de un haz de rayos láser para obtener un diagrama de difracción óptica. Este diagrama es procesado por un programa de computación consiguiendo la reconstrucción de las moléculas individuales en las fases y amplitudes correspondientes a un área de la microfotografía.

Difracción de rayos X Este método consiste en el bombardeo de la molécula por un delgado haz de rayos X y provoca la dispersión (difracción) de la radiación a través de los electrones de los átomos de la muestra. Este haz disperso debe alcanzar una placa fotográfica. La estructura molecular tridimensional se deduce de las posiciones y las intensidades de las manchas registradas en la placa fotográfica.

Los métodos citoquímicos Los compuestos químicos se identifican "in situ" por medio de métodos citoquímicos. Este objetivo es cualitativo y cuantitativo y muchas veces persigue el estudio de los cambios dinámicos producidos en el contenido químico celular en las distintas etapas del metabolismo. Para ello, el compuesto químico debe ser: a) inmovilizado en posición original e, b) identificado por un procedimiento específico para el compuesto o para un grupo químico característico que posea.