1. Gaseosa líquida (CGL) o sólida (CGS) 2. Líquida de Alta Resolución (HPLC/CLAR)
HPLC-AFO
Introducción Aplicabilidad
La muestra debe disolverse en la FM
Amplio espectro de compuestos
Ventajas
- Alta resolución, eficiencia y reproducibilidad - Análisis rápidos, analíticos y preparativos -Resultados cuantitativos buenos δstd < 5% - Automatización -Límites de detección buenos UV-Vis (depende de λ) 10-10 g Fluorescencia 10-12 g
Desventajas
-Costo inicial alto y operacional medio -Muestra debe ser soluble -Requiere uso de patrones -Difícil resolución en muestras complejas -Detectores universales Índice de refracción poco sensible 10-6 g EM inversión inicial alta
HPLC-AFO
Introducción Teoría: Conceptos básicos
Respuesta del Detector
1. Eficiencia (N° platos teóricos)
HPLC-AFO
tR Tiempo de retención Wt Ancho de pico en la base W1/2 Ancho de pico a media altura A mayor valor de N mayor eficiencia Parámetros que afectan la eficiencia: • Flujo • Longitud de la columna • Diámetro de partícula (relleno) • Distrución del diámetro partícula
Introducción Teoría: Conceptos básicos 2. Factor de retención (factor de capacidad)
Respuesta del Detector
Mide el período de tiempo que la muestra reside en la fase estacionaria relativo al tiempo que lo hace en la fase móvil. Se calcula en función tR y t0. Parámetros que afectan a k: • • • •
Fase móvil (tipo de solvente de elución) Composición de la fase móvil Fase estacionaria Naturaleza del analito
HPLC-AFO
Introducción Teoría: Conceptos básicos 3. Selectividad o factor de separación
Respuesta del Detector
α= selectividad k2= Factor de retención de 2 K1= Factor de retención de 1 Parámetros que afectan la selectividad: • • • • •
α=1 los analitos eluyen juntos HPLC-AFO
Fase estacionaria Naturaleza del analito Aditivos del solvente de elución Temperatura de trabajo Composición fase móvil (analitos ionizables)
Parámetros que afectan la resolución: El valor de α es el más influyente en el cambio de la resolución. Los parámetros que influencian a α lo hacen sobre Rs Valores de Rs 0,6 valle entre picos. Muy bajo. 1,0 mínimo valor para cuantificar. 1,2 valor práctico de trabajo. 1,6 valor ideal.
HPLC-AFO
Introducción Teoría: Conceptos básicos Ecuación de Van Deemter
Valores de H menores hacen el proceso más eficiente Partícula chica
Altura de plato teórico
Partícula grande
Suma: Curva de Van Deemter Resistencia a la transferencia de masa FM y FE Difusión longitudinal
Proceso multipaso o difusión Eddy
Velocidad Lineal
HPLC-AFO
H disminuye al reducir el tamaño de partícula
Introducción Componentes del equipo
4. Inyector
1. Reservorio de Fase móvil 3. Mezclador
2. Bombas
5, Columna
3. Mezclador
6. Control Temparatura
4. Inyector 2. Bombas
5. Columna
2. Bombas
6. Control de temperatura 7. Detector
7. Detector 1. FM
8. Sistema de adquisición y procesado de datos 1. Solventes 8. Adquisición y Procesado de datos HPLC-AFO
1. Fase móvil Requisitos
• Pureza grado HPLC/UV • Compatible con el detector • Solubilice el analito • Baja viscosidad • Libre de impurezas sólidas •Precio accesible • Fase normal: principalmente no polar • Fase reversa: água + otro solvente orgánico (metanol, acetonitrilo, THF)
Preparación
HPLC-AFO
• Filtración al vacío. • Desgasificación
1. Fase móvil Mezclas de solventes Generalmente se usan mezclas de solventes. En modo isocrático dependiendo de la complejidad no se utiliza el sistema de mezclado del equipo. Siempre consultar tablas de propiedades y miscibilidades para evitar inconvenientes
HPLC-AFO
1. Fase móvil Longitud de onda de corte (cut off) Es la longitud de onda a la que la absorbancia del solvente es igual a 1 UA (unidades de absorbancia) usando agua en la celda de referencia (1 cm longitud de camino óptico)
Solvente
λ de corte
Solvente
λ de corte
Acetonitrilo
190
Tetrahidrofurano
212
Pentano
190
Diclorometano
233
Agua
190
Cloroformo
245
Hexano
195
Acetato de etilo
256
Metanol
205
Iso-Octane
215
Etil alcohol
210
Isobutyl Alcohol
220
Ácido trifluoroacético
210
HPLC-AFO
1. Fase móvil
Para compuestos ionizables, como los ácidos o bases orgánicas, se recomienda controlar el pH y la fuerza iónica. El rango de pH recomendado es de pH 2-4 El pH de trabajo es +/- 1 unidad de pH con respecto al pKa o pKb de los analitos. Se trabaja generalmente con un predominio de la especie no ionizada. El pH se ajusta siempre en el componente acuoso
HPLC-AFO
1. Fase móvil Preparación
Membrana de Nylon
La fase móvil no debe tener partículas en suspensión filtrarla cuidadosamente cada vez que se usa Importancia desgasificación
Equipo para filtrar solventes de HPLC
Métodos 1. 2. 3. 4. HPLC-AFO
Ultrasonido Vacío Saturación con He o N2 Desgasificación ¨on-line¨
2. Bombas y tuberías Tipos de bomba
Tuberías
A. Reciprocante Bomba a diafragma B. Bomba jeringa
Modos de utilización A. Isocrático B. Gradiente
HPLC-AFO
4. Inyector A. Flujo normal
B. Agregado de muestra bomba
Jeringa punta roma
Manual y automático bomba
loop columna columna C. Ingreso al sistema bomba
columna HPLC-AFO
5. Columna Tipos Analítica: Interesa saber cuántos componentes hay, cuánto hay de cada uno (cuantificar), pero no me interesa colectarlos por separado. Cantidad de muestra < 0.1 mg Preparativa: Interesa separar todos los componentes y colectarlos por separado para después analizarlos individualmente. Cantidad de muestra desde 1 mg hasta 100-200 mg
UHPLC (Ultra high pressure liquid chromatography): Para reducir los tiempos de análisis y con resolución mejorada. Columnas de 1,82 µm de tamaño de partícula, columnas cortas (5 cm). Mejor resolución y eficiencia. La presión aumenta a 600-1200 bar.