“El Biorreactor de Imersión Temporal

(BIT®) en la Micropropagación de plantas y su aplicación a las ornamentales”.

Dra. Maritza M. Escalona Morgado Laboratory for Plant Cell and Tissue Culture Centro de Bioplantas Universidad de Ciego de Ávila, Cuba

Limitaciones de la micropropagación de plantas • Requiere gran número de envases pequeños.

• Transferencia periódica del material vegetal. • Generalmente se emplea medio semi-sólido lo cual dificulta la semi-automatización. • La manipulación (selección, corte y trasplante) representa 40-60% de los costos de producción (Chu,

1995).

• Aunque la manipulación es la principal parte del trabajo y la más técnica, la limpieza, llenado y manipulación de un gran número de envases es engorrosa (Maene y Debergh, 1985) • Pérdidas durante la aclimatización (Reuther, 1985).

LA APLICACIÓN COMERCIAL DE LA MICROPROPAGACIÓN ESTA LIMITADA A CULTIVOS CON ALTO VALOR AÑADIDO

LAS TÉCNICAS DE LA MICROPROPAGACIÓN CONVENCIONAL NO SON SIEMPRE ESCALABLES

Para su aplicación comercial se necesita disponer de nuevas tecnologías para la semiautomatización y mejorar los protocolos de aclimatización (Kitto, 1997).

Ventajas del medio líquido para la micropropagación de plantas. • Reduce los costos de producción y permite la semi-automatización del proceso. • Mayor facilidad de toma de los nutrientes por los explantes ya que se evita la difusión a través del agar

• Suministra condiciones de cultivo más uniformes. • El medio puede ser fácilmente renovado sin cambio de envase. • Se reduce el tiempo de transferencia.

HIPERHIDRICIDAD: Principal desventaja del medio líquido. ¿CÓMO CONTROLARLA ? • Empleo de soportes (puentes de papel, bloques de celulosa o esponjas (Etienne et al., 1991; Smith y Spomer, 1995; Wataad et al., 1997).

• Raft para soportar los explantes sobre un medio líquido estacionario (Connor y Meredith, 1984; Hamilton et al., 1985).

• Adición de medio líquido a cultivos establecidos en agar (doble capa) (Maene y Debergh 1985).

• El empleo de biorreactores de niebla (Weathers y Giles, 1988). • El uso de medio de cultivo con bajas concentraciones de sales y sacarosa e incremento de la luz (Takayama y Akita, 2005). • El Cultivo en Inmersión Temporal (Teisson et al., 1995).

Sistemas de Inmersión Temporal: contacto parcial o total entre los explantes y el medio de cultivo líquido. Inmersión completa y renovación del medio líquido

Inmersión parcial y renovación del medio líquido

Inmersión completa con transferencia neumática del medio de cultivo sin renovación del medio líquido

RITA®

BIT®

Etienne & Berthouly, 2002, Plant Cell Tiss. Org. Cult.

OPERACIONES DEL BIT® (Twin Flasks System):

1

3

2

Air pump Regulator valve Solenoid valve Hydrophobic air filter







1- Dos frascos de cultivo conectados entre sí, uno para los explantes y otro para el medio de cultivo. 2. Inicio de la inmersión, el medio de cultivo es impulsado por el aire del compresor al frasco que contiene los explantes. 3. Fin de la inmersión, la segunda válvula solenoide se abre y el medio de cultivo regresa al frasco que lo contiene. Escalona et al., 1999. Plant Cell Reports.

Ventajas del cultivo en inmersión temporal 



 



 

Evita la inmersión continua de los explantes en el medio líquido. Garantiza el intercambio gaseoso. Limita los cortes. Facilita cambios secuenciales del medio. Permite la semi-automatización del proceso. Reduce la contaminación. Bajos costos.

BIT® : Primera Generación para la producción masiva de plantas.

Producción masiva de piña y caña de azúcar. Centro de Bioplantas

BIT®: Segunda Generación

Propagación masiva de caña de azúcar

BIT®: Tercera Generación 





Inyección de CO2 mejora cultivo fotomixotrófico. Utilización de ventilación forzada. Mayor calidad de plantas.

Rotámetro

CO2

Compresor

Controlador

BIT® para la investigación.

Laboratorio de Inmersión Temporal. Centro de Bioplantas Laboratorio de Inmersión Temporal. Universidad Gent, Bélgica

BIT®: Cuarta Generación. SMART-BIT

SMART- BIT en VITROALMA, México

BIT®: Tipos de Frascos 5L

1L

10 L

250 mL

250 mL

Efecto del BIT en el rendimiento biológico de la micropropagación. PROLIFERACIÓN DE BROTES, SEGMENTOS NODALES Y MICROBULBOS MICROTUBERIZACIÓN

EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA

Propagación de la piña (Ananas comosus L. (Mer) ) en BIT® Variedad Cayena Lisa MD2

Micropropagación convencional

BIT

8.0 5,8

68,8 26,8

®

14 12 10 8

Multiplication rate x10 pH value

6 4 2 0 0

4

6

7

8

w eeks

Escalona et al., 1999. Plant Cell Reports.

Propagación de Musa sp en BIT® Variedad

Micropropagación convencional

BIT

FHIA-18 FHIA-01 G. Nine

3.6 3.4 4.0

7.4 10.4 16.6

PLATANO CEMSA 3/4

Roels et al., 2005. Plant Cell Tiss. Org. Culture. Noceda et al., 2012. HortScince

®

Propagación de caña de azúcar en BIT®

Variedad

Micropropagación convencional

BIT

C 91-301 C1051-73 C120-78 C323-68 CP-5243

3.7 4.1 3.9 4.3 4.0

34.1 58.0 30.2 39.5 32.5

®

Lorenzo et al., 2001. Plant Cell Tiss Org. Culture.

Propagación in vitro del guayabo (Psidium guajava L.) cv. EEA 18- 40 en BIT® No. de Nudos del BP

a

20.0 15.0 10.0

b

b

5.0 0.0

Coeficiente de Multiplicación

40.0

25.0

a

35.0 30.0 25.0 20.0

b

15.0 10.0 5.0 0.0

PBZ 0 mg/L

PBZ 0.5 mg/L

PBZ 1 mg/L

Tratamientos

Nápoles et al., Biotecnología Vegetal (2010)

Con refrescamiento

Sin refrescamiento Tratamientos

Coeficiente de Multiplicación

Propagación de Stevia rebaudiana en BIT®

35

a

30 25

b

20

Convencional BIT

c

15

a 10

b

c 5 0 MS

MS + 0,25 PB MS + 0,5 PB

Tratamientos

Propagación de prunus (GF677) en BIT® 9 a

Tasa de Multiplicación

8 7

a b

6

b

b

b

5 4 3 2 1 0 Control/2F Control/3F PB 0,5/2F

PB 0,5/3F

PB 1,0/2F

PB 1,0/3F

Tratamientos

7 6 5 4 3 2 1 0 10/600

15/600 TE

TMP

10/400 Longitud (cm)

Agregados de brotes de GF677 después de 30 días en medio de enraizamiento en el propio BIT

15/400

Empleo del BIT® en la microtuberización de variedades de papa. a

Número de semilla/planta

14 12 10 8

microtubérculo

b c

6

bc

c

minitubérculo c

4 2 0 Capiro

Canchan

Papa-3

Percentage of tubers < 4 mm 4-6 mm > 6 mm

cv Desiree Solid culture TIS 33.3 a 51.7 a 15.0 b

21.8 a 16.2 b 62.0 a

cv Atlantic Solid culture TIS 25.7 a 32.4 a 41.9 b

Jiménez et al., 1999. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 59: 19–23.

3.1 b 24.9 a 72.0 a

Masa fresca de la semilla (g)

Genotipo 12

a

10

a

8 microtubérculos

6

minitubérculos 4 2

b

b

b

b

0 Capiro

Canchan

Papa-3

Genotipo

Microtuberización de tres genotipos de papa en BIT y procedentes de planta in vitro. (Obtención de semilla prebásica). Laboratorio de Biotecnología Universidad Nacional Agraria La Molina, Perú (2012)

Empleo del BIT® en la microtuberización de ñame (Dioscorea sp)

Etapa de formación de microtubérculos

A

Seis semanas de cultivo MS+sacarosa (30gL-1) Luz

18 semanas de cultivo MS+sacarosa. Oscuridad

B

C

A: Microtubérculos MF ≤ 1,0 g B: Microtubérculos MF 1,0 - 2,9 g C: Microtubérculos con una MF≥ 3,0 g

Cabrera et al., 2005. Plant. Cell. Tiss. Org. Cult., 83: 103-107.

Eficiencia del BIT® en la germinación de embriones somáticos de Pinus radiata (Proyecto Neiker-Tecnalia, España, 2010-2012). control

1 V/día 400

2 V/día

a

350 b

300

c

250 200

Incremento MF

150

Rango Crecimiento

100 50

5,6

5

5,6

0 3 Inm/día

3 Inm/día/1V

3 Inm/día/2V

Eficiencia del BIT® la germinación de embriones somáticos de Quercus suber (Proyecto , UNIOVI, España, 2010-2012). Volumen de medio (mL)

NECA pregerminados

NECA germinados/gMF

150

6,05 ± 1,38

0,25 ± 0,02

300

16, 5 ± 9,90

2,50 ± 0,28

A

B

D

E

Escalona et al., 2014 Trees Forest (in press)

C

A: Agregados pre-germinados, B: Embriones pre-germinados con recurrencia, C: Embriones sin recurrencia en distintos estadios de la diferenciación radicular, D: embrión somático germinado. E: ES germinado espontáneamente en proliferación en SS.

Experiencias en la comercialización de plantas ornamentales

Plantas ornamentales propagadas in vitro en el Centro de Bioplantas.

Familia Botánica Moraceae

Araceae

Araliaceae

Especie

Variedad

Ficus elástica

Decora, Decora variegado, Burgundy, Melany

Ficus benjamina

Natasja, Golden King, Starlight, Exótica.

Ficus binnendijkii

Allii

Syngonium podophyllum

Infra red, White Butterfly, Pixie

Caladium sp

Más de 10 variedades

A. andreanum.

Tropical, Merengue, Sonate, Pasión, Lambada, Fantasía.

Spathiphyllium sp.

Sensation, Starlight, Petite.

Philodendron sp.

Xanadu, Silver Grey.

Brassaia actinophylla

Schefflera amate.

Radermachia sp.

Kaprima.

Plantas ornamentales propagadas in vitro en el Centro de Bioplantas.

Rubiaceae

Ixora coccinea

Guillermina.

Rosaceae

Rosa sp.

Miniatura.

Nyctaginaceae

Bougainvillea spectabilis

Morado, Blanco.

Orchidaceae

Spathoglottis plicata

Morado.

Plumbaginaceae

Limonium sinuatum

Morado, Amarillo.

Droceraceae

Dionea muscipula

Venus Fly Trap.

Polypodiaceae

Cyathea arborea

Helecho arborescente

Nephrolepis exaltata

Helecho encaje

Rhapis excelsa

Palma Dama

Chamaedorea seifrizii

Palma Bambú.

Arecaceae

Cambios tecnológicos en la micropropagación de plantas ornamentales en Cuba. • Empleo de medios de cultivo simples y económicos. • Uso de la luz solar. • Utilización de medios de cultivo líquidos • Introducción del vitrofural. • Empleo de normas de producción y un personal calificado. • Riguroso sistema de control de la calidad. • Utilización de los Sistemas de Inmersión Temporal.

Propagación de plantas ornamentales en BIT® Cultivo

Variedad

Micropropagación convencional

Syngonium

W. Butterfly Pixie

7.3 2.2

28.0 18.4

Philodendron

Xanadu

3.0

103

Anthurium

Tropical

3.5

79.8

Spathyphyllum

Sensation Starlight

3.7 3.0

61.5 56.5

BIT

®

Araceaes

Proliferación de brotes de Paeonia sp en BIT®. Coeficiente de Multiplicación

(Contrato Plantek, Canadá)

12 10

a a

8 6

b

4

bc

c

2 0 0

1

2

3

4

Número de cambios de medio

Variedad

Micropropagación Convencional

BIT

SeSu

2.1

6.8

®

Lezcano et al., 2012 Actualidades Biológicas

Proliferación de brotes de Bromelias en BIT® Micropropagación convencional

BIT

Vriesea Aechmea fasciata Neoregelia carolina Cryptanthus bromeloides

2.0 2.2 2.1 1.8

10.6 24.6 32.4 22.9

Multiplication rate

Variedad

®

12 10 8 6 4 2 0 cluster

shoot divided

Brote seccionado

BROMELIA ORNAMENAL Vriesea. Contrato Empresa SBW, Holanda

Brote no seccionado

Daquinta et al., 2001. J Bromeliad Soc 51(2): 80-85 Capote et al., Biotecnología Vegetal .

Proliferación de brotes de Alstroemeria en BIT® Efecto de la frecuencia de inmersión en variables fisiológicas de los brotes en el BIT. Variables

Cada 3h

Cada 5 horas

Número de brotes.

3.2 b

5.5 a

Número de hojas

6

8.3

Número de raíces

8.0

11.0

Altura de las plantas (cm)

2.0

4.22

Masa Fresca (mg)

396

471

Brotes (Estado III)

2.8 (87.5%)

3.5 (63.6%)

Brotes (Estado IV)

0.4 (12.5%)

2.0 (36.3%)

Daquinta et al., 2010, Biotecnología Vegetal.

Contrato Laboratorio Comercial SBW, Holanda

Proliferación de brotes de Zantesdechias sp en BIT® Variedad

SS

Líquido

BIT

Treasure

3.63 b

3.96 b

7.93 a

Golden Affair 6.50 b

3.70 c

10.7 a

Magister Red 7.23 b

4.26 c

11.3 a

Frecuencia de Inmersión

Coeficiente de Multiplicación

3h 4h 6h

11.3 b 12.5 a 9.3 c Sánchez et al., Ciencia y Tecnología. 3 (1): 1-5. 2010 M. Daquinta et al., Floriculture and Ornamental Biotechnology ©2009

Propagación in vitro de Caladium × hortulanum en BIT® Semi-sólido

BIT

CM en BIT: 43.5

Aclimatización

12 veces en comparación con el SS Daquinta et al. Floriculture and Ornamental Biotechnology 1(1), 2007 Global Science Books

Proliferación de brotes de rosa miniatura en BIT®

Proyecto: Obtención de una producción sostenible de bulbos de Lilium con resistencia a Fusarium oxysporum mediante un método compatible con el ambiente (CB- VITROALMA). ESTABLECIMIENTO IN VITRO

1.0 BA + 0.3 ANA, 30 g/l sacarosa, luz 0,2 ANA 80g/L sacarosa Oscuridad 42 días MULTIPLICACION

Número de microbulbos/explante

Formación de microbulbos de Lilium a partir de escamas en BIT® 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

a b

c

c c

c

escamas/4F- escamas/2F- bulbos/4F-día bulbos/2F-día 1/2 bulbo/4F- 1/2 bulbo/2Fdía día día día

Tipo de explante

Desarrollo de microbulbos de Lilium a partir de escamas en BIT®

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

a b

b

a

a

b

Naranja

Santander Blanco Variedades mb/escama

MF (g)

Circunferencia (cm)

Concador

Factores que determinan la eficiencia biológica del BIT® Tiempo de inmersión  Frecuencia de Inmersión  Volumen de medio de cultivo  Capacidad del frasco de cultivo  Número de Subcultivos en el BIT  Duración de la fase de proliferación  Empleo de retardantes del crecimiento  Tipo de explante a inocular.  Manejo del explante. 

Principales características que determinan la eficiencia biológica del BIT® INTERCAMBIO GASEOSO

• MAYOR TASA DE MULTIPLICACIÓN • MAYOR CALIDAD MORFOLÓGICA

ALTOS PORCENTAJE DE SUPERVIVENCIA EN LA ACLIMATIZACION

CONTACTO INTERMITENTE ENTRE LA SUPERFICIE DE LOS TEJIDOS Y EL MEDIO LÍQUIDO

La Fisiología de las plantas micropropagadas en el BIT® Fotosíntesis in vitro y en el tránsito ex vitro de las plantas

Metabolismo del Carbono

Caracterización del espacio gaseoso interno del BIT®

Asimilación de nutrientes

Fotosíntesis de las plantas in vitro en el BIT® 10 5

Pn

0 0

7

14

21

-5

SS BIT®

-10

Plátano

-15

Days before acclimatization

Aragón et al., 2006. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant.

Condiciones crecimiento piña Medio Líquido BIT®

Producción O2 (µmol. m-2. s-1)

PNmax (µmol O2. m-2. s-1)

Fv/Fm

5.9316

0.71

Bajo FFF

0.211c

Allto FFF

0.270c

5.7783

0.75

Bajo FFF

0.480b

6.3166

0.77

Alto FFF

0.910a

5.3933

0.79

Escalona et al., 2003. (39) : 661-666 . In Vitro Cell Dev Plant

Contenido de azúcares en los brotes en la fase de crecimiento en el BIT y durante la aclimatización SACAROSA

3,0 b

2,0

b

1,5

Starch concentration (mg/g FW)

2,5

c

1,0 a

0,5

a

b

0,0

c

0

ALMIDÓN

200

a

ab

c

7

b

b

c

c

14 21 28 35 42 49 56 63 70

a

150 100 50

b

0

c IC

a

0

days

b

b

b

b

7

14

t (days) suc. Media

suc. Leaves

PLÁTANO

Aragón et al. (2006). In Vitro. Cell. Dev. Biol. Plant.

leaves

Stem

b ab 35

Cambios en la fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC) y piruvato quinasa (PK) de los brotes de plátano durante la fase de crecimiento en el BIT® a

18 16

a

b

14 12

120

c c

10 8 6 4

d

2 0

e

d

EA PK (U/g FW)(h)

EA PEPC (U/g FW)(h

20

a 90

a

60

a b

30 b

b

0

7

21

14

time (days) EA SS

EA TIB

b

a

0 0

7

14

21 time (days)

*5 EA SS

EA TIB

• En el cultivo en SS se muestra una mayor actividad catabólica. La actividad PK fue mayor en SS (5 veces) y 28 veces mayor que la actividad PEPC. • En el SS (sistema cerrado) presenta mayor condiciones estresantes que en el BIT la

mayor actividad respiratoria como una conecuencia de procesos oxidativos.

Composición del volumen gaseoso interno del frasco durante la proliferación y previo a la aclimatización en los brotes de plátano en el BIT® y el cultivo SS. Grandes diferencias en la concentración de gases entre BIT® y SS.

La renovación del volumen gaseoso resulta en un suministro de O2 y la retención de CO2 y acumulación de C2H4

Los niveles de etileno fueron indetectables en el BIT® Roels et al., 2006. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 84 (2): 138-146.

Fisiología y Morfología de los brotes de plátanos cultivados en el BIT® previo a la aclimatización. Días

Método Cultivo

Pn

Transp.

Long. (cm)

Diam. Número (cm) hojas/ brote

-7.63 c

1.33 b

3.02 c

0.41 c

SS

-10.9 c

0.81 c

3.23 c

TIB

-12.5 c

2.17 a

SS

1.92 b

TIB

MF (g)

Núemro raíces

1.40 c

0.67 b

0.00

0.51 b

2.07 b

0.60 b

0.00

3.17 c

0.53 b

2.27 b

0.49 c

0.00

1.34 b

3.63 b

0.57 b

2.33 b

0.71 b

0.00

8.86 a

1.56 a

4.19 a

0.56 b

2.73 a

0.86 a

1.80 b

SS

2.12 b

1.29 b

3.85 b

0.73 a

2.07 b

0.77 b

1.60 b

TIB

6.04 a

1.90 a

4.18 a

0.71 a

2.80 a

0.86 a

2.93 a

0 7 14 21

• •

BIT® mejora la calidad morfológica de los brotes. BIT®, se encontró mejor relación Fotosintésis/Transpiración. Esta relación permitió mayor asimilación de nutrientes preparando a los brotes para la aclimatización. Aragon et al., 2006. In Vitro Cell Dev Plant. Biol.

Tecnología BIT® y la variación somaclonal. EVALUACIÓN EN EL CAMPO

Plantas de plátano CEMSA ¾ en el campo. Plantas fueras de tipo.

REVERSION A DOMINICO HARTOON (UNA PLANTA)

PLANTAS ELONGADAS (2.7%)

PLANTAS ENANAS (2.7%)

Plantas plátano CEMSA ¾ en el campo TRATAMIENTOS

PLANTAS NORMALES (%)

BIT

94.6

SS

86.1

Treatments

PLANTAS NORMALES CULTIVADAS EN ÁREA DE CORBANA, Costa Rica, (2004-2006)

MET-BIT

Weight of bunches (kg) 12.1 ± 0.3

Number of fruits 40.8 ± 0.8

BA -BIT

11.6 ± 0.1

40.2 ± 0.0

MET-SS

12.2 ± 0.0

40.0 ± 0.1

BA-SS

12.3 ± 0.1

40.5 ± 0.3

Aplicación comercial BIT®

Centro de Bioplantas. BioPlant Export. Producción de semilla de alta calidad de la variedad de piña MD2

Aplicación comercial BIT®

Producción de semilla de alta calidad de Bananos.

AGROGENESIS SA, Lima, PERÚ

Aplicación comercial BIT®

Producción de semilla de alta calidad de Bananos.

EMPRESA ROICA S.A, PANAMA

Aplicación comercial BIT®

Producción semilla variedades de caña de azúcar. Ingenio La Estrella, CALESA, PANAMÁ

Aplicación comercial BIT®

Producción semilla caña de azúcar, SYNGENTA, BRASIL

Aplicación comercial BIT®

Producción Stevia rebaudiana, Empresa STEVIGRAN, Granada, España.

Aplicación comercial BIT®

Producción patrones de Prunus, Empresa INVITROTEK, Bibao, España.

Aplicación comercial BIT®

Propagación de piña, SBW, HOLANDA EN GHANA

PRODUCCIÓN IN VITRO DE PLANTAS “ UN PROCESO QUE TERMINA CUANDO EL AGRICULTOR

TIENE SUS GANANCIAS EN UNA CUENTA BANCARIA”

RETOS...

• Desarrollo de protocolos eficientes.

• Producción a partir de genotipos seleccionados. • Producción de plantas a bajo costo. LA PRINCIPAL DIFICULTAD EN EL USO DE LOS BIORREACTORES ESTÁ EN LA BIOLOGÍA Y NO EN LA INGENIERÍA. (Vasil et al., 1999).

Efecto beneficioso del BIT® en la producción de metabolitos secundarios.

D. purpurea, M. royoc, C. citratus, H. perforatum. Wilken et al., 2005. In vitro Liquid systems for plant mass propagation. Yvos Eide, Preil (Eds)

PRODUCCIÓN DE ANTHRAQUINONAS

RENDIMIENTO (mg anthraquinones/g m. f)

Nordamnacantal (F1.1 y F2.3.1)

0.672

Morindone (F.2.3.4)

0.616

Efecto beneficioso del BIT® en reducir la acción de sustancias tóxicas o inhibidores del crecimiento producidos por el propio cultivo.

Lorenzo et al., 2001. Plant. Cell. Tiss. Org. Cult.

Efecto beneficioso del BIT® en la producción de bromelina, una proteasa importante de la piña.

Pérez et al., 2003, 2004. In Vitro Cell. Dev. Biol.Plant.

BIT® MODELO PARA ESTUDIAR PROCESOS FISIOLÓGICOS. HIPERHIDRICIDAD

ESTRÉS OXIDATIVO

ESTRÉS BIÓTICO Y ABIÓTICO

CONCLUSIONES •

El Biorreactor de Inmersión Temporal es una técnica eficiente para la propagación masiva de plantas porque incrementa el coeficiente de multiplicación, la calidad de los brotes, permite la semi-automatización del proceso y la reducción de los costos de producción.

•

Varios son los factores que determinan la eficiciencia de la técnica de inmersión temporal en la propagación de planta. La determinación de los mismos está en dependencia de la especie de planta y de su capacidad morfogenética.

•

El Biorreactor de Inmersión Temporal puede ser empleado para la obtención de metabolitos secundarios y como modelo experimental para estudiar procesos fisiológicos.

PARA REFLEXIONAR EL BIORREACTOR PARA LA PROPAGACION MASIVA DE PLANTAS CONTINUARÁ EVOCANDO DIFERENTES DISEÑOS EN FUNCIÓN DE LA FISIOLOGÍA DE LOS CULTIVOS, LOS COSTOS DE PRODUCCIÓN, LOS RETOS RELATIVOS A LA MANO DE OBRA IMPUESTOS POR EL SISTEMA DE CULTIVO Y LA ECONOMÍA GLOBAL.