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Estudios sobre el biocontrol y bioprotección de la madera frente a organismos xilófagos y cromógenos

TROYA, M.T.1, PRIETO, M.J.1, RUBIO, F.2, FERNÁNDEZ-GOLFÍN, J.I.1, CONDE, M.3, FERNÁNDEZ ROSA, L.2 1

Centro de Investigación Forestal, Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria, Ctra. Coruña km. 7, 28040-Madrid 2 Universidad San Pablo, Urbanización Montepríncipe, Boadilla del Monte, Madrid 3 E.T.S.I. Montes, Universidad de Córdoba, Campus de Rabanales, Ctra. Madrid N IV km 396, 14071-Córdoba

Resumen Los importantes daños causados en la industria española de la madera por organismos xilófagos y cromógenos, y las exigencias de la Directiva Europea de Biocidas, hacen necesaria la búsqueda de nuevos productos para protegerla. La utilización de controladores biológicos puede constituir una buena alternativa a los biocidas clásicos, por sus ventajas económicas y ecológicas. El objetivo de este trabajo ha sido la búsqueda de organismos como controladores biológicos (bioprotección), así como el estudio de sus metabolitos (biocontrol), contra hongos xilófagos y cromógenos, y contra termitas. En los ensayos de bioprotección contra hongos se ha estudiado la eficacia protectora de la madera de cepas albinas de Ophiostoma spp, mientras que contra las termitas se ha valorado el efecto que causaban especies entomopatógenas como Bacillus thuringiensis y Beauvaria bassiana. Se han utilizado diversas metodologías basadas en ensayos acelerados, para posteriormente aplicar ensayos de eficacia, inspirados en la normativa española y europea vigente. En los ensayos de biocontrol se ha evaluado la eficacia de productos ya comercializados en los sistemas agrícolas a base de estrobilurinas, así como investigado la capacidad de diversas especies de Mycena para producir metabolitos inhibidores contra los hongos xilófagos. No se ha contemplado el uso de sustancias semejantes para las termitas, ya que no se han encontrado en el mercado productos derivados de origen natural con propiedades insecticidas. Los resultados obtenidos han sido muy positivos en ambos casos, por lo que se abre un esperanzador camino en el uso de este tipo de productos, que serviría para solucionar la problemática que se plantea en las industrias del sector de la madera, y cubrir el vacío existente en el mercado de productos protectores, puesto que al ser los productos estudiados de origen natural, podrían cumplir con las exigencias de la Directiva de Biocidas. Palabras clave Tratamiento de maderas, bioprotección, biocontrol, hongos, insectos, xilófagos, cromógenos.

1. Introducción La climatología española propicia el desarrollo de organismos tanto xilófagos como cromógenos, entre los que cabe destacar los hongos del azulado, los de pudrición y las termitas. Las maderas europeas son de baja durabilidad natural, por lo que hay que aplicarles algún tipo de tratamiento protector que aumente su vida en servicio. Por otro lado, los protectores tradicionales de la madera, están siendo sometidos a escrutinio por la Directiva de

3/15 Biocidas de la Unión Europea (98/8/CE). Esta Directiva es sumamente restrictiva en cuanto al aspecto ecotoxicológico de los productos a que hace referencia, al mismo tiempo que demanda una comprobación de su eficacia. El control biológico se presenta como una alternativa eficaz, esperanzadora y de menor riesgo frente a los numerosos y crecientes problemas derivados del uso de los productos químicos tradicionales. La idea del uso de biocidas biológicos contra organismos xilófagos y cromógenos no es nueva (MESSNER, 2000). Estos procedimientos han tenido éxito en los sistemas agrícolas, y en los últimos 10 ó 15 años ha aumentado el interés por los mismos como productos para uso forestal (BLANCHETTE et al, 2000; GARCÍA y PERODO, 2000; KLEPZIG, 1999; SCHIRP et al, 2000). Como agentes bioprotectores antifúngicos se utilizan organismos vivos, hongos filamentosos, levaduras y bacterias, que actúan a nivel de competencia por los nutrientes y/o competencia poblacional (FREITAG & MORRELL, 1992; STEFANOVA et al, 1999; LEE PARK y NAVARRO, 1999; BEHRENDT et al, 1995; ISAAC & MORGAN, 1998); mientras que en el biocontrol se utilizan sus metabolitos (BERDY, 1989; ANKE, 1989; TOYOTA & HOSFETTMANN, 1990). Este es el caso de las estrobilurinas (antifúngico producido por Strobilurus spp), o los fungicidas similares generados por especies del género Mycena (BUCHANAN et al, 1999; HARTIG et al, 1990; WEBER et al, 1990). Estos productos actúan alterando la cadena respiratoria, o afectando a la ruta metabólica de la síntesis del ergosterol (componente necesario en la membrana fúngica). Tal y como se ha mencionado anteriormente, también las termitas son causantes de graves daños en nuestro patrimonio, tanto mueble, como inmueble. En España se han descrito cuatro especies, dos de la familia Kalotermitidae, y dos subterráneas pertenecientes a la familia Rhinotermitidae (Reticulitermes grassei y R. banyulensis) (CLEMENT et al, 2001; KUTNIK et al, 2004; LEMAIRE & CLEMENT, 1987), siendo estas últimas las que producen mayores problemas. Todas las técnicas de erradicación de las termitas subterráneas se basan en el conocimiento de su biología y forma de vida. Hasta hace pocos años el tratamiento se centraba exclusivamente en la madera de los edificios atacados con productos químicos de propiedades insecticidas y gran persistencia en el medio (NUNES, 1997; NUNES & NOBRE, 2003). Este sistema únicamente aislaba a los edificios de las colonias de termitas, pero no las eliminaba. Las medidas que se toman actualmente consisten en sanear el inmueble para, posteriormente desinsectar el suelo mediante inyecciones múltiples de productos químicos termiticidas, con el fin de crear una barrera tóxica que impida el paso de las termes al maderamen de las edificaciones. Recientemente, debido a la inquietud por preservar el medio ambiente y la salud humana, se han desarrollado numerosas líneas de investigación, encaminadas a encontrar métodos de lucha contra estos insectos, eficaces y menos agresivos con el entorno. Los sistemas de tratamientos actualmente utilizados específicos contra termitas subterráneas, están basados en expulsar a las termitas que están actuando sobre un inmueble y, mediante una barrera físico-química, crear un perímetro alrededor de la zona a proteger con materiales que no dejen pasar físicamente a las termitas o impregnados con sustancias que las repela (NUNES et al, 2004; SHOREY, 1976). Con este sistema se protege un edificio determinado

4/15 pero, debido a la complejidad de la propia biología y ciclo de vida de estos insectos; no se eliminan las colonias originarias de la plaga. Otro método alternativo a la lucha convencional, consiste en la colocación de puntos cebo. Este tratamiento se basa en la colocación, en los puntos de paso de las termitas, de celulosa impregnada con sustancias que, de alguna manera, afecten al desarrollo natural de las colonias. Los más destacados son los inhibidores de quitina, o los venenos del estómago. La ventaja de estos sistemas frente al resto es que efectivamente erradica las colonias de termitas, no limitándose solo a expulsarlas de las zonas protegidas. Por otro lado, si bien el uso de insecticidas biológicos es común en los sistemas agrícolas (FERNÁNDEZ-LARREA, 2001; LEUCONA, 1996), hasta el momento no se ha descrito su utilización como protectores de la madera, razón por la cual en este trabajo se ha buscado su aplicación en este campo. Por otro lado, cabe destacar que no existen normas que permitan determinar la eficacia de los sistemas y productos de nueva generación. 2. Objetivos Por todo lo expuesto anteriormente, el objetivo de este trabajo ha sido la utilización de organismos vivos que actúen como bioprotectores de la madera contra hongos xilófagos y cromógenos, y contra termitas, así como el estudio de productos de origen biológico utilizados en sistemas agrícolas como biocontroladores, frente a hongos de pudrición y de azulado en las serrerías y carpintería de exteriores, con el fin de reducir los daños producidos en la madera, minimizando el impacto sobre el medio natural. 3. Metodología Debido a que los ensayos encaminados a determinar la eficacia de los productos contra los hongos y las termitas son diferentes, se han descrito en la metodología en dos apartados. 3.1. Contra hongos xilófagos y cromógenos En todos los ensayos se han utilizado las especies de hongos de obligado cumplimiento en la normativa europea (EN-113, 1996; ENV-807, 1993). Las especies han sido: Postia placenta, Coniophora puteana y Gloeophyllum trabeum, como representantes de pudrición cúbica; Trametes versicolor como representante de pudrición fibrosa; y Chaetomium globosum, como causante de pudrición blanda. Como especies productoras de azulado se han ensayado: Pullularia pullulans y Sclerophoma pityophila, cepas exigidas en la norma correspondiente, y Ophiostoma ips, O. pluriannuatum, O. piceae, O. minus y O. canum, como aislados productores de un azulado especialmente intenso en las serrerías de nuestro país. 3.1.1.- Ensayos de bioprotección Se ha estudiado la eficacia protectora sobre la madera de cepas fúngicas comercializadas (cepas albinas de Ophiostoma piliferum), en comparación con aislados albinos españoles, contra hongos xilófagos y cromógenos. Para ello, se inocularon probetas de madera de Pinus sylvestris de 30 x 7 x 5 mm, con las cepas albinas bioprotectoras, y tras 15 días de incubación, una vez instalado el micelio en la madera, se pasaron a cultivos puros de los hongos cromógenos y xilófagos, para observar si realmente existía competencia

5/15 poblacional. La eficacia se determinó por la pérdida de peso de las probetas frente a los hongos xilófagos, o por la intensidad de azulado frente a los cromógenos. 3.1.2.- Ensayos de biocontrol Como productos biocontroladores se seleccionaron tres tipos de estrobilurina (E-1, E-2 y E-3), productos de origen biológico de uso corriente y eficaz en el campo agrícola, para estudiar su aplicación y uso en la madera recién apeada y seca. Los ensayos se realizaron en varias etapas. En un principio se aplicaron métodos acelerados para seleccionar los productos y dosis más eficaces, y una vez evaluada su utilidad, se impregnó la madera con ellos, a la mínima concentración inhibitoria, para comprobar si mantenían su actividad dentro de la madera. Igualmente se analizó la existencia y producción de metabolitos antifúngicos eficaces procedentes de aislados de hongos antagonistas del género Mycena. 3.1.2.1. Ensayo acelerado sobre agar-malta.- La valoración de la eficacia se llevó a cabo mezclando cada producto comercializado, a diferentes concentraciones, con el medio de cultivo (agar 1,2 %, malta 3 %), utilizando placas de agar-malta sin producto, como control. Una vez sembrados los hongos, se dejaron incubar en cámara acondicionada a 22ºC y 70% de humedad relativa hasta observar en las placas control el desarrollo total del hongo en la superficie del medio. La eficacia se determinó por el desarrollo miceliar del hongo o por su ausencia. 3.1.2.2. Ensayo de laboratorio con probetas de madera.- Una vez evaluada la eficacia de los productos mencionados en el apartado anterior a una determinada concentración, se impregnaron probetas, de dimensiones 50 x 25 x 15 mm, de Pinus sylvestris o Fagus sylvatica, en función del tipo de daño. El tratamiento se realizó mediante vacío presión atmosférica, y una vez tratadas, acondicionadas y esterilizadas las probetas, se pusieron en contacto con cultivos puros de las cepas de los hongos xilófagos y cromógenos en agarmalta. En cada frasco de cultivo se colocó una probeta sin tratar que sirviera como testigo de referencia. Los recipientes de cultivo se dejaron en incubación durante 16 semanas a 22ºC y 70 % de humedad relativa. Una vez transcurrido este periodo se evaluó la eficacia mediante gravimetría para los hongos xilófagos, e intensidad del azulado en las probetas de madera en contacto con los cromógenos. 3.1.2.3.- Estudio de metabolitos antifúngicos de origen biológico.- En esta parte del trabajo, se buscaron nuevos metabolitos con efecto inhibidor del crecimiento de los hongos xilófagos y cromógenos, de cara en un futuro a aislarlos e identificarlos, para poder ser utilizados como protectores de madera. La producción de metabolitos se evaluó en función de los tamaños de los halos de inhibición generados en los enfrentamientos, en placas de agar-malta, de los hongos xilófagos y cromógenos frente a distintas especies del género Mycena (M 33 – Mycena niveipes; M 73 – Mycena stipata; M 81 – Mycena seynii; M 90 – Mycena epipterygia ; M 100 – Mycena olivaceomarginata ; M 108 – Mycena leucogala ; M 110 – Mycena clavicularis ; M 123 – Mycena acicula; M 124 – Mycena speirea ). Como control de producción de estrolilurinas se utilizó la especie Strobilurus tenacellus.

6/15 Tras dos semanas de incubación, y una vez comprobada la existencia de halos de inhibición, se seleccionaron las especies más productoras, procediéndose a determinar el medio más adecuado para la generación de antimicrobiano. Para ello, se prepararon distintos medios de uso frecuente en la producción de metabolitos secundarios, volviéndose a realizar los enfrentamientos frente a Postia placenta, ya que fue la especie más sensible. La composición de los medios utilizados fue la siguiente: (1) Corn- steep liquor, K2HPO4, MgSO4 (CKM): Corn-steep liquor 20g, Sacarosa 30g, K2HPO4 1g, MgSO4 0.5g, agar 15g, H2O destilada 1l;(2) glucosa, MgSO4, FeCl3 (GMF): Glucosa 5g, (NH4)2HPO4 0.5g, KH2PO4 0.5g, MgSO4.7H2O 150mg, CaCl2 50mg, FeCl3 10mg, agar 15g, H2O destilada 1l; (3): Sacarosa 5g, KH2PO4 1g, MgSO4.7H2O 0,5g, caseína hidrolizada 4,6g, agar 15g, H2O 1l. Hay que añadir 2ml de una solución compuesta por: FeSO4.7H2O 26mg, ZnSO4.7H2O 22mg, CuSO4.5H2O 4mg, MnSO4.4H2O 2mg, en 100ml de agua; (4) levadura, sacarosa (YES): extracto de levadura 1g, Sacarosa 50g, agar 15g, H2O destilada 1l; (5) Cz: Czapek (lab. CONDA, Madrid); (6) extracto de malta (MEA): Extracto de malta 20g, agar 15g, H2O destilada 1l; (7) levadura, harina de maíz, azúcar (CYS-80): Extracto de levadura 1g, Harina de maíz 50g, Azúcar 80g, agar 15g, H2O destilada 1l; (8) PDB: Potato dextrose agar (lab. CONDA, Madrid). Los cultivos, de nuevo, se dejaron en incubación durante dos semanas, y se valoró la producción de metabolito antagonista mediante el tamaño del halo de inhibición contra los hongos xilófagos y cromógenos. 3.2. Contra termitas La eficacia de productos bioprotectores frente a estos insectos se evaluó mediante ensayos acelerados y ensayos a mayores dimensiones, más complejos, con el fin de desarrollar una metodología básica que permita determinar la eficacia de los sistemas y productos de nueva generación, ya que no existe ninguna norma UNE o EN para este tipo de tratamientos. En los ensayos se utilizaron probetas de madera de Pinus sylvestris, de 50 x 25 x 15 mm. La especie de termitas ensayada fue Reticulitermes grassei procedente del criadero del Laboratorio de Protección de Maderas del CIFOR. Los productos bioprotectores ensayados fueron el I-1 (al 10 %), insecticida biológico constituido por esporas y cristales de delta-endotoxinas de Bacillus thuringiensis var. Israelensis, y que actúa de forma que las endotoxinas se activan por la acción de los jugos intestinales, atacando la pared intestinal del insecto, provocando su muerte. El otro bioprotector fue el I-2 (al 10 %). Este producto está formado por esporas de Beauvaria bassiana, deuteromiceto entomopatógeno que, al entrar en contacto con el insecto, germina, se desarrolla por el hemocele, y forma compuestos capaces de destruir la quitina. 3.2.1.- Ensayos acelerados Estos ensayos se realizaron aplicando la metodología descrita en TROYA et al (2007), donde se utilizan placas Petri de pequeñas dimensiones en las que se colocan cilindros de vidrio rellenos de vermiculita, y un número reducido de termitas (15 obreros).

7/15 3.2.1.1. Ensayo de barreras activas.- En este ensayo se utilizó vermiculita impregnada con los productos objeto de las pruebas, y como control vermiculita humedecida solo con agua. 3.2.1.2- Ensayo de cebos.- Se aplicó el mismo diseño, pero colocando sobre el cilindro de vidrio el cebo de celulosa impregnado con cada producto de ensayo, o solo humedecido con agua para los cebos control. 3.2.1.3- Ensayo con papel impregnado. Esta parte del ensayo se ha basado en el método diseñado por Nunes (NUNES, 1997), y ha servido como ensayo eficaz de referencia. En todos los casos se hicieron tres repeticiones por cada variable, que se dejaron durante dos semanas en el criadero acondicionado a 28ºC y 80% de humedad relativa. Posteriormente, la eficacia de cada uno de los productos se analizó de forma independiente contabilizando el número de supervivientes y el grado de ataque del papel sustrato, o del cebo, según el caso. 3.2.2. Ensayos de laboratorio a mayores dimensiones Una vez valorados los productos en el apartado anterior, para comprobar la eficacia real del método, se repitieron los ensayos a mayores dimensiones. 3.2.2.1. Ensayos de barreras activas no repelentes.- Para determinar el efecto barrera de cada producto se utilizaron recipientes de vidrio transparente de 15 cm de diámetro y 30 cm de altura. En cada recipiente se introdujo espuma de poliuretano troceada y humedecida, que sirvió como soporte inerte, simulando la tierra donde viven en la naturaleza las termitas, y donde se agregó una colonia consistente en 250 obreros, más un número de soldados y de ninfas correspondiente a la proporción de los encontrados en las colonias del criadero (1-5 %). Una vez instalados los termes, se situó la barrera de espuma de poliuretano impregnada con los productos a ensayar, y se volvió a añadir otra capa de espuma sin impregnar, sobre la que se colocó una probeta sin tratar de madera de pino silvestre de tamaño 50 x 25 x 15 mm. Los recipientes de ensayo se dejaron durante 8 semanas en el criadero acondicionado a 28ºC y 80% de humedad relativa. Transcurrido dicho tiempo se procedió a evaluar el estado de las probetas de madera, y el número de termitas supervivientes. 3.2.2.2. Ensayos de cebos.- Se ha estudiado el efecto que causaban cebos impregnados con los productos bioprotectores, en las colonias de termitas; utilizándose como controles, cebos de celulosa y probetas de madera sin impregnar. Para la realización del ensayo, se usaron recipientes con espuma de poliuretano en las mismas condiciones que en el apartado anterior, y donde se añadió una colonia de termitas. Una vez instaladas, se introdujo la madera testigo sin tratar y /o el cebo impregnado con cada producto de ensayo, dejándose en incubación durante 8 semanas. Transcurrido el tiempo de contacto, se procedió al examen final de cada frasco de ensayo, el cual constó de dos partes, examen visual de la madera o cebo, y recuento del número de termes supervivientes en cada recipiente. 3.2.2.3. Ensayos sobre madera.- Finalmente, para ver el efecto termiticida de los productos en la madera, se aplicó una modificación de la norma europea en vigor (EN-117, 2005), utilizándose una sola concentración de cada producto de ensayo. El examen final se procedió de la misma forma que en apartados anteriores.

8/15 4. Resultados 4.1. Contra hongos xilófagos y cromógenos 4.1.1.- Ensayos de bioprotección La eficacia de los bioprotectores contra los hongos xilófagos, fue evaluada calculando el porcentaje de pérdida de peso sufrida por las probetas (Tabla 1), mientras que la eficacia contra las cepas cromógenas se determinó por la presencia o ausencia de azulado en la madera (Tabla 2). Tabla 1. Pérdidas de peso (%) de las probetas pretratadas con las cepas albinas.

Bioprotectores Cepa comercial Ophiostoma sp. Control

P. placenta 0,02 8,20 >20

Pérdidas de Peso (%) C. puteana 10,50 6,70 >20

Gl. trabeum 0,00 2,15 >20

Tabla 2.- Presencia (+) o ausencia (-) de azulado en las probetas pretratadas con las cepas albinas.

Hongos Ophiostoma ips O. pluriannulatum O. piceae O. minus O. piliferum O.canum Ophiostoma sp. P. pullulans S. pityophila

Cepa comercial -

Bioprotectores Ophiostoma sp. -

Controles + + + + + + + + +

4.1.2.- Ensayos de biocontrol Los resultados obtenidos con los productos comercializados con posible uso biocontrolador mezclados con el agar-malta se recogen en la Tabla 3, donde se observa la resistencia o susceptibilidad de las especies de hongos a las concentraciones estudiadas, valorándose de forma cualitativa por el desarrollo del hongo (+) o ausencia de éste (-), sobre el medio de cultivo.

9/15 Tabla 3.- Crecimiento de los hongos de ensayo con los diferentes productos ensayados*.

Hongos Ch. globosum P. placenta C. puteana Gl. trabeum T. versicolor P. pullulans S. pityophila O. ips O. pluriannulatum O. piceae O. minus O. piliferum O.canum Ophiostoma sp.

E-1

E-2

E-3

0,5%

1%

2%

4%

8%

1%

2%

4%

2%

4%

6%

+ -

-

-

-

-

+ + + R R R + -

R +

R

R R -

R R -

L L

L

L

L

L

L

+ + R R + + R R + L -

-

-

Control 0%

+ + + + + + + + + + + + + +

* += crecimiento normal, -= no crecimiento, L=forma levaduriforme, R= retraso del crecimiento

En los ensayos de laboratorio con probetas de madera, los criterios de valoración seguidos fueron diferentes para los hongos de pudrición o los causantes de azulado. En los primeros, se evaluó la eficacia de los productos por gravimetría, es decir, por los porcentajes de pérdida de peso de las probetas después de su exposición a los hongos (Tabla 4); mientras que para determinar si el producto era o no eficaz contra el azulado, se anotó la intensidad del mismo en cada probeta (0: no azulado, 1: indicios de azulado, 2: medianamente azulado, 3: totalmente azulado) (Tabla 5). Tabla 4: Pérdida de peso (%) de las probetas tratadas con los diferentes productos a las concentraciones estudiadas, tras la incubación con los hongos xilófagos.

Pérdida de peso (%) Producto

E-1 E-2 E-3 Control

Madera y concentración del producto Pino (2%) Haya (4%) Pino (4%) Haya (4%) Pino (6%) Haya (6%) Pino Haya

Retención (kg/m3) 15,76 31,12 30,90 22,80 45,37 37,20 -

C. puteana

P. placenta

G. trabeum

T. versicolor

0,001 5,591 3,592

3,313 4,636 3,304

1,837 1,519 3,661

37,90 -

26,51 -

27,07 -

0,008 0,775 0,823 35,25

10/15 Tabla 5.- Intensidad de azulado de las probetas tratadas con los diferentes productos a las concentraciones estudiadas, tras la incubación con los hongos de ensayo.

Hongos P. pullulans S. pityophila O. pluriannulatum O. piceae O. minus O. piliferum Ophiostoma sp.

E-1 1% 1,0 0 0 0 1,0 1,0 2,5

E-2 4% 1,0 0 0 0 1,8 1,5 3,0

E-3 6% 0,8 0 0 0 1,0 1,5 3,0

Control 0% 2,0 2,3 2,3 2,2 3,0 3,0 3,0

En la tabla 6 se recogen los halos de inhibición de las distintas especies de Mycena frente a cada especie representativa de cada tipo de daño. Tabla 6.- Halos de inhibición tras los enfrentamientos en agar malta entre los hongos cromógenos y xilófagos y las especies estudiadas de Mycena*.

Mycena spp M-33 M-100 M-108 M-110

Ch. globosum H1 H1 H1 H2

T. versicolor H1 H3 H1 H2

P. placenta H1 H3 H1 H2

P. pullulans 0 H3 H1 H2

Ophiostoma sp. H1 H3 0 -

* - No hay crecimiento, 0-No existe halo, H1 Halo menor de 1 cm, H2 Halo entre 1 y 2 cm, H3 Halo mayor de 2 cm

4.2. Contra termitas 4.2.1.- Ensayos acelerados Los resultados obtenidos en los ensayos acelerados, tanto de barreras activas, como cebos y papel impregnado con los productos, se muestran en la tabla 8, aplicando los siguientes criterios: El grado de ataque del papel sustrato se evaluó como: 0 no ataque, 1 ataque ligero (arañazos, o pequeños orificios), 2 ataque medio (papel perforado aproximadamente en la mitad de su superficie), 3 ataque intenso (papel perforado en más de tres cuartas partes de su superficie). El grado de ataque de los cebos se evaluó como: 0 no ataque, 1 ataque ligero (ligeros arañazos), 2 ataque medio (arañazos claramente visibles), 3 ataque intenso (arañazos profundos). Tabla 7.- Resultados del número de supervivientes y grado de ataque de los productos ensayados en los ensayos acelerados frente a termitas.

Producto I-1 I-2 Control

Barreras activas Supervivientes Ataque 0 0 0 0 8 2,6

Cebos Supervivientes Ataque 2 0 0 1 10 3

Papel impregnado Supervivientes Ataque 0 0 11 3 12 3

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4.2.2. Ensayos a mayores dimensiones En todos los ensayos a mayores dimensiones en el examen final se valoró el número de termitas supervivientes, así como la extensión y profundidad del posible ataque en el sustrato (madera o celulosa), según el baremo siguiente: 0 no ataque, 1 arañazos o roeduras superficiales (< 0,5mm de profundidad), 2 ataque ligero (< 1mm de profundidad), 3 ataque medio (1-3 mm de profundidad) y 4 ataque intenso (> 3 mm de profundidad). Los resultados obtenidos, donde se exponen el grado de ataque y el número de termes supervivientes, en los ensayos de barreras activas no repelentes para impedir el paso de las termitas a la madera, vienen recogidos en la Tabla 8. Los correspondientes a los ensayos de cebos vienen reflejados en la tabla 9. Finalmente, los resultados de los ensayos realizados sobre madera se muestran en la tabla 10. Tabla 8.- Resultados obtenidos cuando se utilizan los bioprotectores como barreras activas, en comparación con las testigos sin producto.

Producto I-1 I-2 Control

Examen visual 0 1 4

Obreros 0 0 124

Supervivientes Soldados Ninfas 0 0 0 0 6 0

% 0 0 52

Tabla 9.- Resultados obtenidos cuando se utilizan los bioprotectores como cebos, en comparación con las testigos sin producto.

Producto I-1 I-2 Control

Examen visual 0 0,5 4

Obreros 0 35 213

Supervivientes Soldados Ninfas 0 0 0 0 4 2

% 0 14 87,6

Tabla 10: Resultados obtenidos en las probetas tratadas con los productos de ensayo aplicandouna modificación de la norma europea EN-117.

Supervivientes Producto Absorción Retención Ataque Obreros Soldados Ninfas % (g) (Kg/m3) I-1 3,675 19,600 1 36 0 1 14,4 I-2 4,504 24,021 0 0 0 0 0 Control 4 193 0 2 77,2 5. Discusión Los resultados obtenidos con las cepas albinas comercializadas (ISAAC & MORGAN, 1998; KLEPZIG, 1999; GARCÍA y PERODO, 2000) en comparación con el aislado español de Ophiostoma sp., confirman que estos organismos podrían ser utilizados como bioprotectores y constituir una alternativa a los tratamientos químicos clásicos utilizados para la protección temporal de la madera, ya que muestran un alto nivel de competencia poblacional en lo que se refiere a la inhibición del desarrollo de hongos causantes de azulado

12/15 (Tabla 2), mientras que presentan menor nivel de competencia frente a los hongos xilófagos (Tabla 1). El uso de estrobilurinas solo ha sido aplicado en el manejo y control de las enfermedades en cultivos agrícolas (BUCHANAN et al, 1999; CHRISTENSEN & GRANBY, 2001; WEBER et al, 1990), y tras los resultados que se han obtenido a lo largo de este trabajo, puede observarse que los productos comerciales a base de estrobilurinas son bastante eficaces, a las concentraciones estudiadas en la madera, tanto contra hongos xilófagos (Tabla 4) como cromógenos (Tabla 5), si se comparan con las probetas testigo. Por todo ello, se abre una línea de investigación para el desarrollo de este tipo de productos, tanto con organismos vivos, como con productos de origen biológico, que pueden ser modificados para garantizar tiempos mayores de permanencia en a madera, y así poder ser aplicados en clases de riesgo 2, 3, e incluso 4. En la literatura, hay numerosas investigaciones encaminadas a la búsqueda de nuevos metabolitos de origen biológico contra patógenos (ANKE, 1989; BERDY, 1989; HARTIG et al, 1990; TOYOTA & HOSFETTMANN, 1990), pero no se ha encontrado ninguna que se utilice para proteger la madera, excepto con organismos vivos como Trichoderma (FREITAG & MORRELL, 2000; STEFANOVA et al, 1999). En este trabajo, respecto a la búsqueda de nuevos metabolitos producidos por el género Mycena, los datos de la tabla 6 demuestran que hay producción de sustancias inhibidoras del crecimiento de los hongos xilófagos y cromógenos por todas las especies de Mycena, como se puede ver por la existencia de halos en todos los enfrentamientos. Por otra parte, la producción de estas sustancias, aunque se da en todas las especies, no es homogénea en todas ellas, lo que lleva a seleccionar las más activas que, ordenadas de mayor a menor índice de producción, son las siguientes: M 100 › M 110 var. M › M 33 › M 108. Analizando el medio de cultivo y el tamaño del halo, se observó que el medio óptimo era el 5, y después, en orden decreciente, 2 › 4 › 8 › 1 › 6 › 7. Hay que destacar que los medios donde se generaba mayor cantidad de antifúngico son medios mínimos y fáciles de obtener en laboratorio, lo que favorecería en un futuro su fabricación industrial. Igualmente, este ensayo sirvió para descartar tanto la especie M 73 como la M 110 var. F ya que no producen halo de inhibición en los nuevos medios. Estos resultados abren una vía de investigación, desarrollo e innovación de productos alternativos a los tradicionalmente utilizados en este campo, que cumplirían con las exigencias marcadas en la Directiva Europea de Biocidas. De igual modo que sucede con los hongos, la bibliografía existente sobre bioprotección se basa fundamentalmente en el control de plagas agrícolas (FERNÁNDEZ-LARREA, 2001; LEUCONA, 1996; SHOREY, 1976); mientras que son escasas las publicaciones sobre el uso de organismos vivos para el control y desarrollo de las termitas (TROYA et al, 2007). Por ello, los resultados obtenidos de bioprotección contra termitas muestran que los productos I-1 e I-2, funcionan bien como barreras activas no repelentes, ya que no existen supervivientes, y las probetas de madera colocadas en la parte superior han quedado sin atacar (Tabla 8). Sin embargo, cuando se aplican estos productos como cebo, se ha observado (Tabla 9) que solo la Beauvearia (I-2) resultó ser muy eficaz, eliminando la colonia de termitas. La mortandad se detectó, incluso a la semana de puesta en contacto, mientras que las que tenían los cebos controles sin tratar, permanecían vivas. Sin embargo, el Bacillus (I-1), también usado como

13/15 producto fitosanitario, solo resultó eficaz cuando se impregnaron las barreras con este microorganismo, y no cuando se impregnaron los cebos o el papel sustrato, por lo que cabe deducir que este microorganismo no actúa, en el caso de las termitas, a través de la ingesta de sus endotoxinas, sino por contacto directo. No obstante, cuando se impregna la madera con estos productos, los resultados obtenidos (tabla 10) han mostrado que a las concentraciones utilizadas han sido eficaces, dado que ninguna probeta de madera tratada con ellos ha resultado atacada, y no se han encontrado termes supervivientes. Todos estos resultados hacen plantear la novedad de la utilización de microorganismos entomopatógenos, como la B. bassiana, como controlador y reductor poblacional de las termitas. 6. Conclusiones La utilización de organismos vivos o de sus metabolitos en el campo de la protección de la madera ha resultado ser eficaz, por lo que se abre una línea de investigación en la industria del sector que permita sustituir los formulados químicos tradicionales por otros menos agresivos para el medioambiente y el ser humano, de acuerdo con las directrices europeas. 7. Agradecimientos Este estudio ha sido llevado a cabo en el seno del proyecto AGL-2004-01236/FOR, y se ha contado con el apoyo de diferentes empresas del sector: FKR-Química, S.L., Química de Munguía, Syngenta Agro S.A., BASF ESPAÑOLA S.A., Mejora de Ambientes y Entornos S.A. y Massó, a los que los que los autores agradecen su colaboración. 8. Bibliografía ANKE, T.; 1989. Basidiomycetes. A source for new bioactive secondary metabolites. Progress in Industrial Microbiology 27, 51-66. BEHRENDT, C.J.; BLANCHETTE, C.J.; FARRELL, R.L.; 1995. Biological control of bluestain fungi in wood. Phytopathology 85 (1), 92-97. BERDY, J.; 1989. The discovery of new bioactive microbial metabolites. Progress in Industrial Microbiology 27, 3-25. BLANCHETTE, R.A.; HELD, B.W.; BEHRENDT, C.J.; FARRELL, R.L.; NAVARRETE, J.; 2000. Development of a successful program for biological control of blue stain in wood products. Maderas Ciencia y Tecnología 2 (2), 130-139. BUCHANAN, M.S.; STEGLICH, W.; ANKE, T.; 1999. Strobilurin N and two metabolitesd related to chorismic acid from the fruit bodies of Mycena crocata (Agaricales). Z. Naturforsch. 54, 463-468. CHRISTENSEN, H.B.; GRANBY, K.; 2001. Method validation for strobilurin fungicides in cereals. Food Addip. Contam. 18, 866-874.

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