PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE ESCUELA DE INGENIERÍA

EXTRACCIÓN DE ASTAXANTINA DE HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS USANDO CO2 SUPERCRÍTICO

RAÚL IGNACIO ARAVENA CONTRERAS

Tesis para optar al grado de Magíster en Ciencias de la Ingeniería

Profesor Supervisor: JOSÉ MANUEL DEL VALLE LL.

Santiago de Chile, Abril, 2011

PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE ESCUELA DE INGENIERÍA

EXTRACCIÓN DE ASTAXANTINA DE HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS USANDO CO2 SUPERCRÍTICO

RAÚL IGNACIO ARAVENA CONTRERAS

Tesis presentada a la Comisión integrada por los profesores: JOSÉ MANUEL DEL VALLE LL. CÉSAR SÁEZ N. PAZ ROBERT C. JOSÉ MUÑOZ P.

Para completar las exigencias del grado de Magister en Ciencias de la Ingeniería

Santiago de Chile, Abril, 2011

(A mis Padres, hermanos y amigos, que me apoyaron cuando más los necesite)

ii

AGRADECIMIENTOS Al concluir esta Tesis quisiera agradecer a la empresa Atacama Bionatural Products S.A por facilitar la materia prima necesaria para poder llevar a cabo los experimentos. Al profesor César Sáez y su alumno Fabián Reyes por permitirme utilizar su laboratorio para efectuar el análisis de los extractos. A los alumnos y administrativos del Departamento de Ingeniería Química quienes siempre me entregaron su apoyo, en especial a Gonzalo y Freddy con quienes discutí en más de alguna oportunidad diversos temas relacionado con mi Tesis que me ayudaron a ir mejorando procedimientos y análisis. Finalmente, al profesor José Manuel del Valle por permitirme efectuar mi investigación en su laboratorio bajo su supervisión.

iii

ÍNDICE GENERAL Pág. DEDICATORIA.................................................................................................................... ii AGRADECIMIENTOS ....................................................................................................... iii INDICE DE TABLAS ..........................................................................................................vi INDICE DE FIGURAS ....................................................................................................... vii RESUMEN ......................................................................................................................... viii ABSTRACT ..........................................................................................................................ix 1.

INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 1 1.1 Haematococcus pluvialis y astaxantina................................................................ 2 1.2 Producción de compuestos de alto valor a partir de microalgas .......................... 3 1.3.1 Extracción con fluidos supercríticos .......................................................... 4 1.3.2 Extracción supercrítica de microalgas ........................................................ 8 1.3 Objetivos ............................................................................................................. 9

2.

MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................. 10 2.1 Materiales .......................................................................................................... 10 2.2 Análisis de materia prima ................................................................................. 10 2.3 Extracción supercrítica ..................................................................................... 11 2.4 Medición de astaxantina por espectrofotometría ............................................... 13

3.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................ 14 3.1 Extracción supercrítica de polvo de H. pluvialias.............................................. 14 3.2 Extracción supercrítica de homogenato de H. pluvialias ................................... 20 3.3 Comparación extracción de polvo con extracción de homogenato .................... 24

4.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ........................................................ 28 4.1 Conclusiones ..................................................................................................... 28

4.2 Recomendaciones ............................................................................................... 29 BIBLIOGRAFIA .................................................................................................................. 31 A N E X O S ......................................................................................................................... 37 ANEXO A : Estudios publicados sobre fraccionamiento y extracción de corrientes líquidas usando CO2-SC ........................................................................................................... 37 ANEXO B: Estudios publicados sobre extracción de microalgas usando CO2-SC ............. 38 ANEXO C: Validación metodología……………………………………………………... 42 ANEXO D: Resultados extracción de polvo de H. pluvialis .............................................. 44 ANEXO E: Estructura de monoesteres y diestres de astaxantina ....................................... 47 ANEXO F: Resultados extracción de homogenato de H. pluvialis .................................... 48

ÍNDICE DE TABLAS Pág. Tabla 1-1: Comparación entre procesos de Extracción SuperCrítica (ESC) de Sólidos (S) y Líquidos (L). ................................................................................................................. 7 Tabla 3-1: Solubilidad de astaxantina .................................................................................. 16 Tabla 3-2: Resultados obtenidos en estre trabajo y los reportados por Machmudah et al. (2006) para la extracción de H. pluvialis .................................................................... 18 Tabla 3-3: Pureza de extractos de polvo de H. pluvialis ..................................................... 20 Tabla 3-4: Resultados obtenidos al final del proceso de extracción de homogenato .......... 23 Tabla 3-5: Pureza de extractos de homogenato de H. pluvialis .......................................... 24 Tabla 3-6: Factor de productividad (G) ............................................................................... 25 Tabla Anexo A: Estudios publicados sobre fracciobamiento y extracción de corrientes líquidas usando CO2.SC……………………………………………………………..37 Tabla Anexo B: Estudios publicados sobre extracción de microalgas usando CO2-SC…...38 Tabla Anexo D: Resultados extracción polvo de H. pluvialis……………………………..44 Tabla Anexo F: Resultados extracción de homogenato de H. pluvialis…………………...48

vi

ÍNDICE DE FIGURAS Pág. Figura 1-1: Estructura molecular de astaxantina .................................................................... 3 Figura 2-1: Diagrama del equipo de extracción ................................................................... 12 Figura 3-1: Cinéticas de extracción de sólido en condiciones isobáricas ............................ 15 Figura 3-2: Cinéticas de extracción de homogenato en condiciones isobáricas .................. 22 Figura 3-3: Comparación pureza de extractos...................................................................... 27 Figura Anexo C-1: Extracción de sólidos………………………………………………….42 Figura Anexo C-2: Extracción de líquidos……...…………………………………………43

vii

RESUMEN

En los últimos años las microalgas han cobrado interés industrial por sus aplicaciones en biocombustibles, alimentos, nutraceútos, farmaceúticos, y cosméticos. En particular, Haematoccocus pluviales destaca por ser la mayor fuente natural de astaxantina, un carotenoide con propiedades funcionales y antioxidantes derivadas de sus cadenas de dobles enlaces conjugados. La extracción con dióxido de carbono supercrítico es un método atractivo para la obtención de astaxantina de H. pluvialis, pues permite operar a baja temperatura de extracción sin dejar trazas de solventes en los extractos. Esta técnica se puede aplicar tanto a sustratos secos como líquidos.

El objetivo de esta tesis fue estudiar el proceso de extracción de astaxantina de H. pluvialis desde un medio acuoso (homogenato) usando dióxido de carbono supercrítico. Los efectos de presión (350-550 bar) y temperatura (40-70 ºC) fueron evaluados y comparados con resultados obtenidos de la extracción de astaxantina de la microalga seca bajo estas mismas condiciones.

Los resultados obtenidos indican que la presencia de agua en el homogenato genera un retardo en el inicio del proceso de extracción dando origen a curvas de extracción con forma sigmoidal. Además, el agua reduce la solubilidad de astaxantina y otros compuestos del extracto en el CO2, requiriéndose un mayor consumo de CO2 para obtener un mismo rendimiento de extracción, registrándose la mejor relación recuperación astaxantina (60.75%) para la extracción de polvo de H. pluvialis a 550 bar y 70ºC. Por otro lado, bajo las condiciones de extracción evaluadas, el extracto de mayor pureza se obtuvo para la extracción de homogenato a 450 bar y 40 ºC (6.77%).

Palabras Claves: Haematoccocus pluvialis; Astaxantina; Extracción Supercritica, Homogenato.

viii

ABSTRACT In recent years, microalgae have gained interesting in the industry by its applications in biofuels,

foods,

nutraceuticals,

pharmaceutical,

and

cosmetics.

Particularly,

Haematoccocus pluviales is the main natural source of astaxanthin, a carotenoid with functional and antioxidant properties derived from its double bound carbon chain. Supercritical carbon dioxide extraction is an interesting method for obtaining H. pluvialis’ s astaxanthin natural products, because of its low operational temperature, the complete separation of solvent from the extract. Furthermore, this technical can be applied to solid and liquids samples. The objective of this thesis was studing the extraction of H. pluvialis’ s astaxanthin in aqueous medium (homogenate) using supercritical carbon dioxide. The effects of pressure (350-550 bar) and temperature (40-70 ºC) were evaluated and compared with the extraction of dry microalgae under the same conditions.

Results showed that water delayed extraction of homogenate so that sigmodal curves were obtained. Besides, water reduces the solubility of astaxanthin and other extract components in CO2 so that CO2 consumption in extraction of homogenate was larger than the solid counterpart when obtain the same yield. The best relation between astaxanthin recovery and CO2 consumption was recorded for H. pluvialis powder extraction at 500 bar and 70 ºC. On the other hand, the highest astaxanthin concentration in the extract (6.77%) was obtained when extracting homogenate at 450 bar and 70 ºC.

Keywords: Haematoccocus pluvialis; Astaxanthin; Supercritical Extraction; Homogenate. ix

1 1.

INTRODUCCIÓN La producción de microalgas a escala industrial ha sufrido un fuerte aumento desde

sus comienzos (en Japón en la década de los 60 con la producción de Chlorella), existiendo hoy en día plantas de producción en diversos países del mundo con variadas especies (Spolaore et al., 2006). Lo anterior se debe a que estos microorganismos son fuente de gran cantidad de compuestos de alto interés comercial para las industrias: alimenticia, farmacéutica, cosmética, y energética (Capelli y Cysewski, 2006; Spolaore et al., 2006). En relación con la industria energética, el uso de microalgas como fuente de materia prima para la producción de biocombustibles ha cobrado importancia en los últimos años por el creciente interés a nivel mundial en fuentes de energías renovables y menos contaminantes. El interés se sustenta en el alto contenido en varias especies de microalgas de aceites (Chisti, 2007), que constituyen la principal materia prima para la síntesis de biocombustibles (Ma y Hanna, 1999; Chisti, 2007; Huang et al., 2010). Sumado a lo anterior, las microalgas se reproducen rápidamente, lo que permite obtener una mayor cantidad de aceite por unidad de área de cultivo y tiempo que cultivando vegetales, de modo que permiten limitar el uso de los terrenos cultivables al cultivo de alimentos de consumo humano (Chisti, 2007).

En la actualidad la síntesis de biocombustibles a partir de microalgas no es económicamente atractiva en comparación con sus aplicaciones alternativas como sustratos para productos de alto valor agregado para las industrias de alimentos, fármacos, y cosméticos. No obstante lo anterior, recientemente se ha considerado la obtención de biocombustible a partir de microalgas como un co-producto en la extracción de compuestos de alto valor agregado por transesterificación de los ácidos grasos residuales (Bitran, 2009). Por lo tanto, interesa el desarrollo de nuevas tecnologías que permitan recuperar bioproductos de alto valor agregado selectivamente, de manera de obtener un producto de alta pureza, y un residuo rico en ácidos grasos que sea utilizable en la producción de biodiesel. Entre los productos de alto valor agregado obtenidos desde microalgas para el uso en diversas industrias destacan -caroteno de Dunaliella salina y D.

2 bardawil, ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs, del inglés para Polyunsaturated Fatty Acids) de Spirulina máxima, S. platensis, y Crypthecodinium, proteínas de Arthrospira, 1,3-glucano de Chlorella, y astaxantina de Haematococcus pluvialis entre otros (Olaizola, 2003; Spolaore et al., 2006).

En el caso de nuestro país, la producción de microalgas se inició a fines del siglo pasado con la producción a pequeña escala de las microalgas H. pluvialis, S. máxima, y D. salina aprovechando una serie de ventajas que tiene Chile para su cultivo: zonas de alta radiación solar que favorecen la reproducción de las microalgas; bastas extensiones de suelo desértico que pueden ser ocupados para el cultivo; y disponibilidad de aguas no contaminadas. Desde un punto de vista comercial, la microalga más importante actualmente en nuestro país es H. pluviales debido a su alto contenido en astaxantina (Sección 1.2), siendo cultivada por Astax, Atacama BioNatural Products, y Pigmentos Naturales en la I Región, y por Algas Chañar y Alimtec en la IV Región, para generar principalmente productos de consumo animal para la industria del salmón.

1.1

Haematoccocus pluvialis y astaxantina Haematococus pluvialis es de gran importancia comercial, ya que bajo condiciones

de cultivo apropiadas es capaz de sintetizar y acumular gran cantidad de astaxantina, que llega a constituir entre 2 y 5% del peso seco de la microalga (Dufossé et al., 2005; Mendes, 2008). Lo anterior convierte a H. pluvialis en la mayor fuente natural de este bioproducto, por sobre otras fuentes convencionales como son la levadura Phaffia rhodozyma y restos de crustáceos (Higuera-Ciapara, et al., 2006).

La astaxantina (3.3’-dihidroxi- . -caroteno-4,4’-diona) (Figura 1-1) es un carotenoide perteneciente a la clase de la xantófilas, que está formado por una estructura hidrocarbonada de 40 átomos de carbono con dos anillos terminales, unidos por una cadena con dobles enlaces conjugados. En la actualidad el principal mercado de la astaxantin es la industria del salmón, en donde se utiliza como suplemento alimenticio para

3 pigmentar su carne. Sin embargo, en los últimos años la industria farmacéutica y nutracéutica también se ha interesado en la astaxantina (Olaizola, 2003) debido a su alto poder antioxidante, muy superior al resto de los antioxidantes conocidos tales como

-

caroteno, tocoferoles, y vitamina C (Dufossé et al., 2005; Capelli y Cysewski, 2006). Además, la astaxantina ha demostrado tener efectos positivos en la salud tales como reducción del estrés oxidativo celular, prevención de procesos inflamatorios, mejoramiento de la respuesta inmune, reducción del nivel de triglicéridos en la sangre, y prevención de diversos tipos de cáncer, entre otros (Guerin et al., 2003).

Figura 1-1: Estructura molecular de astaxantina. Desde un punto de vista comercial, la existencia de una versión sintética de la astaxantin, ha vuelto el proceso de extracción desde fuentes naturales poco rentable, debido a que la mayor parte de la industria del salmón se abastece con esta versión sintética (Olaizola, 2003). Sin embargo, estudios recientes que informan los efectos positivos de la astaxantina en la salud humana antes mencionados, han abierto un nuevo mercado para la comercialización del producto de origen natural.

1.2

Producción de compuestos de alto valor agregado de microalga. La producción de microalgas secas o productos derivados como extractos,

comienza con el cultivo controlado de la microalga favoreciendo la síntesis del producto deseado, inclusive estresando al microorganismo en alguna etapa de su desarrollo.

Una vez generada una cantidad de biomasa óptima, es necesario efectuar el proceso de cultivo de la microalga de manera de separarla del caldo de cultivo. Con este fin, se

4 utilizan diferentes operaciones unitarias dependiendo de las características de las microalgas y las necesidades del proceso. Entre estas técnicas la más habitualmente implementada es la centrifugación debido a su mayor eficiencia.

En la mayoría de los casos, dado que el producto de interés se encuentra al interior de las células, una etapa de ruptura debe ser utilizada. En general, métodos de ruptura mecánica son recomendados debido a la complejidad que presenta la ruptura de este tipo de microorganismos, destacándose el uso de molinos de bolas y homogenizadores de alta presión. Una vez efectuada la ruptura de las microalgas se obtiene un homogenato, el cual en algunos casos puede ser sometido directamente a un proceso de secado para su comercialización, o en su defecto debe ser procesado de tal forma de obtener un producto final de alta pureza. Para este último caso, es necesario desarrollar tecnologías adecuadas para la recuperación de compuestos de alto valor agregado desde las microalgas. En el caso particular de los carotenoides, como la astaxantina, existen serios inconvenientes a la hora de su extracción, derivados principalmente de la facilidad con que estos compuestos se degradan al estar expuestos al oxigeno, luz, y altas temperaturas (Gouveia y Empis, 2003). Técnicas convencionales para la recuperación de astaxantina de H. pluvialis utilizan solventes orgánicos (e.g. acetona, hexano), los que presentan baja selectividad; y requieren procesos posteriores para eliminar trazas de solvente, que exponen los extractos a altas temperaturas y provoca su isomerización y oxidación con su consecuente degradación. Además, deben enfrentar las cada vez mayores restricciones puestas al uso de este tipo de solventes en la producción de sustancias para consumo humano.

Finalmente, sin importar la metodología empleada para recuperar el producto deseado, este debe ser sometido a un proceso de formulación y estabilización que permita su posterior comercialización.

1.2.1 Extracción con fluidos supercríticos La extracción utilizando Fluidos SuperCríticos (FSC) aparece como una alternativa interesante de ser explorada para superar las carencias que presentan los solventes

5 convencionales en la recuperación de bioproductos específicos desde fuentes naturales y que sean aptos para el consumo humano. Una gran diferencia de los FSC con los solventes líquidos convencionales es que su densidad es muy variable con las condiciones de estado, particularmente cerca del punto crítico en que el fluido es marcadamente compresible, lo que les otorga un poder solvente variable (Brunner, 1994; del Valle y Aguilera, 1999), y con ello una selectividad variable. Además, los FSC presentan propiedades intermedias entre las de los líquidos y gases convencionales, lo que se traduce en que a altas presiones tienen densidades que se aproximan a la de los líquidos y les otorga alto poder solvente (ideal para la recuperación de compuestos), y a bajas presiones tienen propiedades de transportes que se aproximan a la de los gases (baja viscosidad, alta autodifusividad), que facilitan los procesos de transferencia de masa y reducen los tiempos (Brunner, 1994: del Valle y Aguilera, 1999). Por otro lado, los FSC permiten una fácil separación entre el extracto y el solvente por medio de la precipitación del producto de interés al reducir la presión del sistema, lo que evita recurrir a un cambio de fase para desolventizar el extracto, etapa que demanda mucha energía al usar solventes líquidos convencionales (Brunner, 1994: del Valle y Aguilera, 1999).

Sumado a lo anterior, el dióxido de carbono (CO2) SuperCrítico (SC) presenta una serie de ventajas particulares que lo han convertido en el FSC más ampliamente estudiado como solvente para la extracción de productos de origen natural. Desde un punto de vista operacional el hecho que la temperatura crítica del CO2 sea cercana a la ambiental (Tc= 31.0 ºC) reduce el daño de compuestos termolábiles como los carotenoides. Por otro lado, el CO2-SC presenta otras propiedades que lo convierten en un solvente ideal para la extracción de compuestos bioactivos (Brunner, 1994; del Valle y Aguilera, 1999; Lang y Wai, 2001): i) es de bajo costo; ii) es inerte, y no se quema ni explota; iii) no es tóxico y no daña los extractos ni sustratos agotados; y, iv) es muy selectivo para la extracción de compuestos de alto valor agregado como aceites esenciales, lípidos, y compuestos lipofílicos seleccionados.

La extracción con CO2-SC puede ser efectuada sobre sustratos sólidos como corrientes líquidas (Reverchon y De Marco, 2006). Con respecto al proceso usando

6 sustratos sólidos, este consiste en cargar el sólido de interés en un extractor o serie de extractores por los cuales se hace circular el CO2 para posteriormente, por medio de la expansión de CO2, precipitar los compuestos extraídos. Este tipo de operación es eminentemente por lotes, pues cada vez que el sustrato se agota es necesario abrir el extractor para renovar la materia prima. Por su parte, el procesamiento de corrientes líquidas haciendo uso de CO2-SC es un proceso continuo donde la mezcla líquida y el CO2-SC se contactan en una columna a contra-corriente. La Extracción SuperCrítica (ESC) de Líquidos (L) presenta diversas ventajas frente a ESC de sólidos (ESCS), siendo la más relevante la posibilidad de fraccionar compuestos que poseen un factor de separación pequeño debido a las múltiples etapas de equilibrio que se establecen a lo largo de la columna debido a la naturaleza de contacto a contra-corrientes del proceso, lo cual es posible en la ESCS, siendo en muchos casos la ESCL la única alternativa para obtener productos de alta pureza. Desde un punto de vista operacional la ESCL disminuye tiempos muertos en el uso de equipos al no requerir procesos discontinuos de carga y descarga de material, además de reducir las pérdidas de CO2 debido a la menor apertura de equipos por tratarse de un proceso continuo. La Tabla 1-1 muestra una comparación entre ambas ESCL y ESCS.

En relación a la ESCS son diversas las aplicaciones tanto a nivel de laboratorio como industrial que utilizan CO2-SC para la recuperación de aceites esenciales, aceites vegetales, y compuestos de alto valor agregado (e.g. carotenoides, tocoferoles, flavonoides) desde una amplia gama de materias primas (Reverchon y De Marco, 2006). Por su parte, la ESCL ha sido mucho menos estudiada, centrándose principalmente en el fraccionamiento de corrientes oleosas para la purificación de ácidos grasos poliinsaturados, aún cuando se han efectuado algunas investigaciones en soluciones y suspensiones acuosas (Anexo A). Sin embargo, sin importar cuál de las dos alternativas de extracción se use, la selección de condiciones adecuadas de operación (temperatura, presión, flujo de CO2-SC, tiempo de extracción en el caso de ESCS, flujo de líquido en el caso de ESCL) es crucial en el resultado del proceso (velocidad de extracción, cantidad de extracto recuperado, selectividad, entre otros), y dependen principalmente del sustrato o líquido procesado y el bioproducto que se busca extraer o purificar (Reverchon y De

7 Marco, 2006). Por ejemplo, para el caso de ESCS no siempre las condiciones que maximizan el rendimiento coinciden con las condiciones de máxima actividad biológica, posiblemente porque el extracto se diluye con compuestos más solubles, reduciendoce la pureza. Tabla 1-1: Comparación entre procesos de Extracción SuperCrítica (ESC) de Sólidos (S) y Líquidos (L). Criterio Cantidad de solvente usado Etapas de equilibrio Ensuciamiento Factor de separación requerido Tipo de Proceso

ESCS Alta Pocas Poco relevante Alto Por lotes

ESCL Baja Varias Problema serio Bajo Continuo

Los efectos de las condiciones de extracción en el rendimiento y la pureza en astaxantina del extracto de H. pluvialis dependen principalmente de la solubilidad en el CO2-SC de los componentes del extracto y de éste como un todo, por un lado, y de la velocidad del proceso, por el otro (del Valle y Aguilera, 1999). Para cortos tiempos de proceso el rendimiento está determinado principalmente por la transferencia de masa entre la matriz sólida y el CO2-SC (factores cinéticos), y por la solubilidad del soluto en el CO2SC; pero para tiempos largos de extracción el rendimiento depende de la partición del soluto entre la matriz sólida y el CO2-SC, y por la transferencia de masa al interior de la matiz (factores cinéticos). Los parámetros de transferencia de masa externo mejoran al aumentar la velocidad superficial del solvente, aumentar la temperatura, o disminuir la presión. Por su parte, la solubilidad generalmente aumenta al aumentar la presión del sistema (incremento en la densidad y poder solvente del CO2-SC) y la temperatura del sistema (incremento en la presión de vapor y volatilidad del soluto). Sin embargo, a bajas presiones el aumento de la volatilidad del soluto al aumentar la temperatura muchas veces no compensa la disminución en la densidad del CO2-SC, disminuyendo solubilidad al aumentar la temperatura a presión constante.

8 1.2.2 Extracción supercrítica de microalgas La ESC de microalgas como sustrato sólido ha sido estudiada por diversos autores para diferentes especies y bioproductos de interés. El Anexo B presenta una tabla resumen de algunos de estos estudios. En el caso de la extracción de H. pluvialis distintos investigadores han evaluado el efecto de las condiciones de operación (Valderrama et a.l, 2003; Machmudah et a.l, 2006; Nobre et al., 2006; Thana et al., 2008), el grados de ruptura del material (Valderrama et al., 2003; Nobre et al., 2006) y el uso de etanol (Valderrama et al., 2003; Nobre et al., 2006; Machmudah et al., 2006) como co-solvente sobre la extracción de astaxantina, carotenoides totales, y extracto total. Los estudios han mostrado que un aumento en la presión a una temperatura constante (Machmudah et al., 2006; Nobre et al., 2006; Thana et al., 2008), en la temperatura a una presión constante (Machmudah et al., 2006; Nobre et al., 2006), y en el flujo (Machmudah et al., 2006), aumentan la velocidad y rendimiento del proceso. Por su parte, una eficiente ruptura del material (Valderrama et al., 2003; Nobre et al., 2006) y el uso de co-solvente (Valderrama et al., 2003; Machmudah et al., 2006; Nobre et al., 2006) también afectan positivamente la velocidad y rendimiento de extracción.

Sin embargo, como se indicó en la Sección 1.2, la obtención de un sustrato sólido a partir de un cultivo de microalgas implica un proceso de secado (Valderrama et al., 2003; Machmudah et al., 2006; Nobre et al., 2006; Thana et al., 2008) que aumenta la complejidad y el tiempo de ciclo del proceso, por lo que extraer en forma directa una suspensión de microalgas o restos de microalgas derivado del cultivo o ruptura celular se presenta como una alternativa interesante de ser considerada, tomando en cuenta las ventajas mencionadas en la Sección 1.2.1. Sin embargo, como se puede apreciar en el Anexo A, los esfuerzos de investigación en esta área se han centrado principalmente en la recuperación de compuestos de menor peso molecular que la astaxantina. No obstante lo anterior, las patentes de Kanel y Marentis (2000) y Roney et al. (2008), que proponen la recuperación de

caroteno desde una pasta de zanahoria y de una salmuera de la

microalga Dunaliella salina, respectivamente, dan indicios de los posibles beneficios que

9 presentaría efectuar un proceso de ESCL para la recuperación de carotenoides, como la astaxantina, desde suspensiones acuosas.

1.3

Objetivos El objetivo de esta tesis consiste en estudiar el efecto que tienen las distintas

condiciones de operación (presión, temperatura) sobre la extracción de un homogenato de H. pluvialis y comparar estos resultados con los obtenidos a partir de la extracción de un polvo de esta misma microalga. Para cumplir con dicho objetivo, se plantearon los siguientes objetivos específicos:

i.

Implementar una metodología para el estudio de la extracción de soluciones acuosas en el equipo de screening de sustratos sólidos con que cuenta el Laboratorio de Extracción de Materiales Biológicos (LEMaB) del Departamento de Ingeniería Química y Bioprocesos de la Pontificia Universidad Católica de Chile.

ii.

Estudiar a nivel de laboratorio los efectos de presión y temperatura sobre la extracción de un polvo seco de H. pluvialis.

iii.

Estudiar a nivel de laboratorio los efectos de presión y temperatura sobre la extracción de un homogenato de H. pluvialis y comparar los resultado con los obtenidos en ii).

10 2. 2.1

MATERIALES Y METODOS Materiales La materia prima utilizada consistió en polvo seco de H. pluvialis, el cual fue

facilitado por la empresa Atacama Bionatural Products S.A. (Iquique, Chile). Para evitar su degradación, las muestras fueron almacenada en bolsas de aluminio selladas a vacío y almacenadas a -15 ºC hasta ser usadas.

El solvente de extracción supercrítica fue CO2 de grado alimenticio con un 99.8%, adquirido a la empresa AGA S.A. (Santiago, Chile). El nitrógeno utilizado para el secado de las muestras fue adquirido a esta misma empresa. Para la extracción con acetona y la medición espectrofotométrica de contenido de astaxantina en las muestras se utilizó acetona grado HPLC marca J.T. Baker adquirida en LabTec Ltda. (Santiago, Chile).

2.2

Análisis de materia prima Para determinar la cantidad total de extracto presente en el polvo seco de H. pluvialis

se procedió a extraer 10 mg de polvo en un tubo ependorff con 1 ml acetona como solvente de extracción recuperando el sobrenadante obtenido, previa centrifugación a 6400 RPM por 2 minutos. El procedimiento se repitió 6 hasta que el polvo de H. pluvialis quedo completamente decolorado. Luego se tomaron 3 cm3 del sobrenadante acumulado los que fueron colocados en un vial previamente pesado para posteriormente desolventizar el extracto en atmósfera de nitrógeno y con ello determinar la cantidad total de extracto en la microalga. Paralelamente, se tomaron 2 cm3 del sobrenadante total a los cuales se les efectuó análisis espectrofotométrico para determinar el contenido de astaxantina (Sección 2.4).

Por otro lado, para medir la humedad del extracto, se tomaron 3 g de polvo seco, los cuales se secaron en un horno a 105 ºC hasta peso constante (del Valle et al., 2003).

11 2.3

Extracción supercrítica Las extracciones con CO2 supercrítico se efectuaron utilizando el sistema de

extracción SFE-1L de Thar Designs (Pittsburgh, PA, EE.UU) con que cuenta el Laboratorio de Extracción de Materiales Biológicos (LEMaB) de la Pontificia Universidad Católica de Chile (Santiago, Chile). En este sistema (Figura 2-1) el CO2 proveniente del cilindro pasa por un chiller que lo enfría hasta 0 ºC asegurando el estado líquido del fluido antes de ingresar a la bomba de doble pistón modelo P-200 que se encarga de presurizar el sistema y hacer circular el CO2 a través del extractor cargado con la muestra. Por su parte, el extractor se encuentra al interior de un horno calefactor a temperatura controlada y que se encarga de mantener el CO2 que ingresa al extractor a la temperatura de extracción deseada. Luego, a la salida del sistema, se encuentra un BPR (del inglés Back Pressure Regulator) que consiste en una válvula de aguja de alta precisión controlada por un controlador PID el que permite mantener la presión de extracción del sistema. Finalmente, el sistema cuenta con una válvula de seis vías y dos posiciones que posibilita efectuar un análisis cinético del proceso de extracción al poder conectar dos viales de muestreo al mismo tiempo. El procedimiento de extracción consistió en cargar un extractor de 50 cm3 (22 mm de diámetro interno) con la muestra a extraer (homogenato o polvo seco) y el volumen vacío llenado con esferitas de vidrio. Para la extracción de homogenato la muestra cargada correspondió a 4 g de una mezcla al 25% p/p de polvo de microalga con agua, lo que equivale a cargar 1 g de microalga. Por su parte, para la extracción de la muestra sólida se procedió a cargar una mezcla de 1 g de microalga con 1.5 g de tierra de diatomeas. El uso de las tierras de diatomeas se debió a la existencia de un problema de aglomeración del material

al ser cargado sólo en el extractor, lo cual se puede evitar agregando

coadyuvantes de filtración que reducen la humedad y mejoran la porosidad del lecho (Hopper y King, 1992). Una vez cargado el extractor con la muestra respectiva se procedió a colocarlo en el horno calefactor para llevar la temperatura del sistema a la deseada de extracción, la cual fue mantenida durante todo el proceso (± 1 ºC). Una vez alcanzada la temperatura de extracción la presión fue incrementada lentamente hasta lograr la presión

12 de proceso la que fue mantenida a lo largo de la extracción (±1 MPa). La metodología anteriormente expuesta fue validada para asegurar reproducibilidad de los datos (Anexo C). El efecto de la presión fue medido a 350, 450, y 550 bar y el de la temperatura a 40 y 70 ºC. En todos los casos el flujo de CO2 utilizado fue de 10 g/min. En cada extracción se tomaron muestras periódicas de extracto en viales de vidrio pre-pesado (22 cm3) envueltos en papel de aluminio. Para el caso de homogenato las muestras se recolectaron cada 1 hora durante un tiempo total de extracción de 10 horas aproximadamente, mientras que para el sólido seco las muestras se tomaron en intervalos de tiempo variable para un periodo total de extracción de 4.5 horas aproximadamente. Finalmente, los extractos obtenido se almacenaron en oscuridad a -15 ºC hasta su análisis. La medición del extracto recuperado en cada intervalo de tiempo se efectuó por procedimiento gravimétrico pesando el vial antes y después de la extracción. Por otro lado, el contenido de astaxantina de cada muestra se determinó espectrofotométricamente (Sección 2.4).

Figura 2-1: Diagrama del equipo de extracción.

13 2.4

Medición de astaxantina por espectrofotometría La cantidad total de astaxantina en la muestra expresada como contenido de

astaxantina fue medida por espectrofotometría en acetona (Goodwin y Srisukh, 1949) en un equipo Hach modelo dr/2000 (Loveland, CO, EE.UU). Para efectuar la medición, el extracto recuperado en cada uno de los viales fue resuspendido en 5 cm3 de acetona de los cuales se tomaron volúmenes de entre 150 a 1400 L dependiendo de la concentración de la muestra y posteriormente aforados hasta un volumen de 20 cm3. El volumen tomado de cada muestra fue considerado adecuado si la absorbancia de la suspensión aforada se encontraba entre 0.1 a 0.9 AU al ser medida a una longitud de onda de 470 nm (MendesPinto et al., 2001). Finalmente, la concentración de astaxantina en el volumen de 20 cm3 se estimó utilizando la ecuación (2.1): x 10

A E11cm

(2.1)

donde x es la concentración de astaxantina (mg/mL), A es la absorbancia medida, y E1cm1 es el coeficiente específico de extinción óptica que toma el valor de 2100 para astaxantina en acetona (Mendes-Pinto et al., 2001).

14 3.

RESULTADOS Y DUSCUSIÓN De la extracción con acetona del polvo seco de Haematoccocus pluviales se obtuvo

que 1.92% del peso seco corresponde a astaxantina y 32% del peso seco a oleorresina extraíble. Por otro lado, el polvo de microalga utilizado poseía una humedad de 4%.

3.1

Extracción supercrítica de polvo de H. pluvialis Las curvas cinéticas de oleorresina (g de oleorresina/g microalga, R) y de

astaxantina (mg oleorresina/g microalga, y) obtenidas para la extracción de sustrato sólido, se presentan en las Figura 3-1 en función del consumo específico de CO2 (kg de CO2/g microalga, F), mientras que los datos numéricos se encuentran en el Anexo D. Una comparación de las curvas obtenidas tanto para la extracción de oleorresina como astaxantina con curvas cinéticas obtenidas por otros autores para sustratos similares usando CO2-SC, permite concluir que existe consistencia en la forma de las curvas, es decir, la presencia de una o dos regiones iniciales de extracción a tasa constante, las cuales están determinadas por factores de equilibrio entre el soluto-matriz-CO2, y una segunda región de tasa variable, y que está limitada principalmente por factores cinéticos de transferencia de masa. Los factores de equilibrio que afectan la velocidad de la extracción están representados por la isoterma de adsorción del soluto entre la fase sólida y el CO2-SC, y por la solubilidad máxima del soluto en el CO2, ambos factores dependientes de la presión y temperatura del sistema (Sovová, 2005; Oliveira, et al., 2003). Por su parte, los factores de transferencia de masa están relacionados con la velocidad a la cual ocurre la transferencia del soluto en la fase sólida desde el interior de la partícula a la superficie de la misma, y por su posterior transferencia desde este punto al CO2-SC. Estos parámetros mejoran al aumentar la temperatura o disminuir la presión (del Valle y de la Fuente, 2006). Al aplicar los conceptos anteriores a las curvas cinéticas obtenidas, podemos observar que en todos los casos efectivamente existe una zona de extracción inicial a tasa constante la cual varía según las condiciones de extracción (Presión, P; Temperatura, T). Al comparar curvas obtenidas a igual temperatura se aprecia que un incremento en la presión se traduce en un aumento en la pendiente inicial de la curva de extracción (Tabla 3-

15 1), indicando que tanto la solubilidad de la oleorresina como de la astaxantina se ven favorecida por un aumento de la presión. Este fenómeno es esperable debido a que un incremento en la presión produce un aumento en la densidad del CO2-SC lo que conlleva a un aumento en su poder solvente.

Figura 3-1: Cinéticas de extracción de sólido en condiciones isobáricas. Las curvas verdes en la figura muestran las cinéticas de extracción de oleorresina y las curvas rojas las de astaxantina.

16 Tabla 3-1: Solubilidad de astaxantina (105×g astaxantina/g CO2). Solubilidad medida como la pendiente de la zona inicial de las curvas de extracción bajo las mismas condiciones de operación. T (ºC)/P (bar) 70 40

350 1.73 1.48

450 3.32 1.94

550 6.51 3.58

Por otro lado, para comparar extracciones a una misma presión de extracción se debe tener en cuenta que esta variable puede tener un efecto positivo o negativo sobre la solubilidad de un soluto en CO2 dependiendo de la presión del sistema. Este efecto contrario se basa en el hecho de que un incremento en la temperatura, si bien produce una reducción en la densidad del solvente y con ello una disminución de su poder solvente, al mismo tiempo aumenta la presión de vapor y volatilidad del soluto lo que se traduce en un mayor traspaso a la fase fluida. Por lo tanto, cuando el efecto sobre la reducción de la densidad es menos fuerte que el aumento en la volatilidad del soluto, un incremento en la temperatura se traduce en un aumento en la solubilidad, sucediendo lo contrario si el efecto sobre la densidad es más fuerte que el de la volatilidad. Lo anterior, implica que existe una presión a la cual a diferentes temperaturas la solubilidad del soluto en CO2 es la misma (punto de cross-over), cumpliéndose que por sobre esta presión un incremento en la temperatura tiene un efecto positivo en la solubilidad del soluto en CO2, mientras que bajo esta presión se observa el efecto contrario. Al contrastar las curvas de extracción obtenidas a una presión constante, es posible concluir que la temperatura en todos los casos incrementa la pendiente de la zona inicial de la curva de extracción, o dicho de otro modo, tiene un efecto positivo sobre la solubilidad del soluto en el CO2 (Figura 3-1, Tabla 3-1). Es interesante destacar que al efectuar esta comparación a presiones cada vez menores las distancias entre las curvas en la región controlada por solubilidad son cada vez menores, es decir, las pendientes de la primera zona de extracción son cada vez más parecidas, lo que implica que la solubilidad del soluto bajo dichas condiciones son similares, por la mayor cercanía del sistema a la presión de cross-over. Lo anterior, coincide con lo publicado por diversos autores, quienes han observado que el punto de

cross-over de diferentes

compuestos en CO2 se encuentra generalmente a bajas presiones, en particular para carotenoides bajo los 300 bar (Jay et al., 1991; de la Fuente et al., 2006).

17 No obstante lo anterior, al comparar la solubilidad de astaxantina reportada por de la Fuente et al. (2006) a P = 350 bar y T = 40 ºC con la pendiente de la zona inicial de extracción bajo estas misma condiciones, se observa que la solubilidad operacional es aproximadamente 4 veces superior a la solubilidad termodinámica. Esta desviación de la solubilidad estimada con respecto a la solubilidad reportada en literatura se puede deber a dos fenómenos: (i) La presencia de astaxantina esterificada por sobre astaxantina sin esterificar (Miao et al., 2006; Lorenz y Cysewski, 2000); (ii) Interacción existente entre los diferentes componentes de la mezcla compleja que forman el extracto (Lucien y Foster, 2000). Según Lorenz y Cysewski (2000), Haematococcus pluvialis puede llegar a tener un 95% de su astaxantina en forma esterificada formando tanto mono- (70%) como diésteres (25%). Desde el punto de vista de la solubilidad en CO2, si bien, la esterificación de esta molécula produce un incremento en su peso molecular, lo cual afecta negativamente la solubilidad del compuesto en CO2, la reacción de esterificación implica la incorporación de cadena alifática a la molécula (Anexo E), lo que tendería a disminuir la polaridad de la sustancia y con ello probablemente incrementar su solubilidad en CO2, por lo que la suma de los dos efectos contrarios dará como resultado que la solubilidad del éster de astaxantina difiera de la solubilidad de la astaxantina libre. El efecto de la esterificación de carotenoides sobre la solubilidad en CO2 puede ser observado al comparar los resultado reportados por Jay et al. (1991) en solubilidad de luteína libre con los reportados por Naranjo-Modad et al. (2000) para la solubilidad de esteres de luteína. De éstos es posible observar que, por ejemplo, a P = 280 bar y T = 40 ºC la solubilidad de luteína libre es aproximadamente el doble que la de los ésteres de luteína. En relación a la interacción entre compuestos, ésta generalmente tiende a reducir la solubilidad de los solutos con respecto a los valores de solubilidad medidos para sustancias puras. Sin embargo, puede darse el caso que algunos compuestos presentes en la matriz actúan como co-solventes favoreciendo la extracción de otros solutos debido a la fuerte interacción soluto-soluto existente (Lucien y Foster, 2000).

Por lo tanto, la suma de los dos fenómenos

mencionados anteriormente puede ser la responsable de que, bajo las diferentes condiciones de extracción estudiadas, la solubilidad de astaxantina medida como la pendiente de las curvas difiera de los datos reportados en la literatura.

18 La Tabla 3-2 presenta los resultados obtenidos en este trabajo para el extracto total con los reportados por Machmudah et al. (2006) para la extracción de astaxantina a partir de H. pluvialis. En esta tabla es posible observar que los efectos de presión y temperatura descritos anteriormente coinciden con los observados por Machmudah et al. (2006); es decir, incrementos en ambos factores favorecen la extracción tanto de oleorresina como astaxantina, lográndose la mejor condición de extracción a P = 550 bar y T = 70 ºC. Sin embargo, un análisis más detallado de los resultados permite observar diferencias importantes entre ambos estudios en lo que se refiere a extracción de astaxantina y cinética del proceso. Tabla 3-2: Resultados obtenidos en este trabajo y los reportados por Machmudah et al. (2006) para la extracción de H. pluvialis. En esta tabla R representa la recuperación de oleorresina (g oleorresina/g microalga) y Ra la recuperación de astaxantina (g astaxantina/g astaxantina inicialmente en la muestra).

Presión (bar) Temperatura (ºC) 40 70

Este trabajo 350 450 R 16.71 18.71

Ra 51.72 51.71

R 17.86 18.34

Machmudah et al. (2006) 300 400 Presión (bar) Temperatura (ºC) R Ra R Ra 40 70 15.5 15.5 15 16

550

Ra 51.99 56.86

R 21.31 21.88

Ra 58.11 60.75

500 R 16

550 Ra 15

R 13 22

Ra 15 78

En relación al primer punto, podemos ver que el máximo rendimiento de recuperación de astaxantina obtenido por Machmudah et al. (2006) es casi un 29% mayor al encontrado en este trabajo, lo cual puede estar relacionado con el uso de materias primas diferentes con distinto grado de ruptura celular y que se ha demostrado tiene un efecto crítico sobre los rendimientos de extracción (Valderrama et al., 2003; Nobre et al., 2006). Por otro lado, al contrarrestar más detalladamente el efecto de la temperatura de extracción reportado por Machmudah et al. (2006), se aprecia que a una temperatura de 70ºC un

19 incremento de la presión de 500 a 550 bar aumenta en aproximadamente 4 veces el rendimiento de la extracción de astaxantina, observándose una diferencia similar al incrementar la presión desde 400 a 550 bar, lo que indica que algo similar debiese suceder al incrementar la presión desde 450 a 550 bar. Sin embargo, en este estudio, al efectuar dicho cambio de presión se puede constatar que el efecto es mucho menor (Tabla 3-2) al que se esperaría obtener. Un comportamiento similar ocurre al comparar los rendimientos de extracción de astaxantina a 550 bar con un incremento de temperatura de 40 ºC a 70 ºC. Estas importantes diferencias observadas entre ambos estudios pueden deberse a que en los experimentos efectuados por Machmudah et al. (2006) la cantidad de CO2 utilizado por masa de muestra es muy baja (F=0.05 kg CO2/g de microalga), por lo que probablemente en muchos de los casos, especialmente a bajas presiones y temperatura donde la solubilidad de los compuestos es menor, las mediciones fueron detenidas cuando aún el proceso se encontraba regido por factores de equilibrio, registrándose por esto grandes saltos en los rendimientos de recuperación de astaxantina. Lo anteriormente expuesto se ve respaldado por los resultados obtenidos por Thana et al. (2008), quien utilizó un flujo de especifico de CO2 14 veces superior al de Machmudah et al. (2006) registrando a P = 500 bar y T = 40 ºC una recuperación de astaxantina del 79%, lo que es considerablemente mayor a lo reportado por Machmudah et al. (2006) y mucho más consistente con los valores de recuperación de astaxantina obtenidos en este trabajo. El mayor rendimiento reportado por Thana et al. (2008) en comparación al presentado en este informe, puede deberse a que al uso de una materia prima con un menor grado de ruptura que la utilizada por Thana et al. (2008). Respecto a las diferencias en las cinéticas de extracción reportadas por Machmuda et al. (2006) con las presentadas en la Figura 3-1, se concluye que las velocidades de extracción medidas en este trabajo son menores para todas las condiciones reportadas tanto para la recuperación de oleorresina como de astaxantina. Este fenómeno puede estar relacionado al uso de materias primas distintas con diferente grado de ruptura celular, que se ha demostrado tiene una fuerte influencia sobre la extracción (Valderrama et al., 2003; Nobre et al., 2006). El efecto del grado de ruptura celular fue considerado por Sovová (2005) al plantear su modelo de simulación de procesos de extracción de tejidos usando

20 CO2-SC. Este modelo considera la existencia de dos tipos de células en el sistema, unas “rotas” cuyo soluto es de libre acceso al CO2 y otras “no rotas” cuyo soluto debe enfrentar un proceso de transferencia de masa interna para poder ser extraído. Según este modelo el proceso de extracción está controlado por factores de equilibrio (región de extracción rápida) hasta que todo el soluto de las células rotas ha sido removido. Por lo tanto, un material sometido a una mejor ruptura celular presentará una cinética de extracción más rápida que un material con más baja ruptura, que es lo que pareciera ocurrir en este caso. Finalmente, es interesante evaluar la pureza de los extractos obtenidos, ya que no siempre las condiciones de mejor rendimiento de extracción coinciden con la de mayor concentración del compuesto bioactivo en el extracto. La Tabla 3-3, presenta las purezas de los extractos obtenidos al final del proceso de extracción bajo las diferentes condiciones evaluadas. En ella se aprecia que la condición a la cual se logra la mayor pureza de extracto es P = 450 bar y T = 70 ºC, la cual no coincide con la condición de mayor rendimiento de extracción que es P = 550 bar y T = 70 ºC (Tabla 3-2). Por otro lado, la máxima pureza obtenida en este estudio es aproximadamente la mitad de la reportada por Machmudah et al. (2006), lo cual puede deberse a la presencia de una mayor cantidad de astaxantina en la muestra procesada en sus estudios (3.43% p/p) con respecto a la usada en este trabajo (1.92% p/p) Tabla 3-3: Pureza de extractos (100 × g astaxantina/g oleorresina) de polvo de H. pluvialis T (º C)/P (bar) 40 70 3.2

350 5.95 5.31

450 5.60 5.96

550 5.24 5.34

Extracción supercrítica de homogenato de H. pluvialis Las curvas cinéticas de oleorresina (g de oleorresina/g de sustrato, R) y de

astaxantina (mg oleorresina/g de sustrato, y) obtenidas para la extracción de homogenato se presentan en la Figura 3-2 en función del consumo específico de CO2 (kg de CO2/g microalga, F), mientras que los datos numéricos se encuentran en el Anexo F. Es fácil

21 apreciar que las curvas cinéticas tanto de oleorresina como de astaxantina presentan una forma sigmoidal, a diferencia de lo sucedido con la extracción de sustrato sólido. Este tipo de curvas se caracterizan por un primera zona de extracción lenta a velocidad creciente, luego una zona de extracción a tasa constante, para concluir con una zona de extracción a velocidad decreciente. Las curvas cinéticas reportadas en literatura para la extracción de diferentes compuestos a partir de sustratos biológicos, presentan en su mayoría la forma de las curvas reportadas en la Figura 3-1 para sustrato sólido, es decir, una primera región de extracción a tasa constante y una segunda a tasa decreciente. Sin embargo, en algunos casos particulares al utilizar co-solventes, se ha visto un pequeño retardo en la tasa inicial de extracción dando origen a curvas sigmoidales como las observadas para la extracción de homogenato. Sun y Tamelli (2006) al utilizar aceite de canola como co-solvente para la extracción de zanahoria, registra curvas de extracción de oleorresina que presentan un pequeño retardo inicial en la tasa de extracción. Por otro lado, Cocero y García (2001) registran este mismo fenómeno durante la extracción de aceite de semillas de girasol al usar diferentes alcoholes como co-solvente. Según Cocero y García (2001), la explicación de este retardo en la curva de extracción se debería al proceso de desorción del soluto desde la matriz, ocurriendo el fenómeno cuando el coeficiente de transferencia de masa desde la superficie del sólido al fluido es pequeño. Por lo tanto, es posible que el agua presente en el homogenato entorpezca la transferencia de masa hacia la fase supercrítica, lo que explicaría el retardo en la curva de extracción. Por otro lado, la presencia de una larga región a tasa de extracción constante indica que el proceso de extracción se encuentra limitado principalmente por la solubilidad de los solutos en el fluido.

22

Figura 3-2: Cinéticas de extracción de homogenato en condiciones isobáricas. Las curvas verdes en la figura muestran las cinéticas de extracción de oleorresina y las curvas rojas las de astaxantina. En cuanto al efecto de la presión de extracción sobre las curvas de extracción, es posible apreciar que a una temperatura constante un incremento en la presión tiene un leve efecto sobre el rendimiento de extracción de oleorresina, pero sin presentar un patrón claro de variación, pues a 40 ºC el efecto es siempre positivo pero a 70 ºC el efecto es variable (Figura 3-2, Tabla 3-4). Por otro lado, al comparar los resultados de extracción de astaxantina, es posible apreciar que a 40º C no existe un patrón definido de respuesta, mientras que a 70º C un aumento en la presión tiene efecto ligeramente negativo. La

23 existencia de patrones no definidos al variar la presión del sistema es un fenómeno que también fue reportado por Green y Akergman (1996) al estudiar la extracción de contaminantes de suelo a partir de una pasta acuosa, obteniendo máximos rendimientos de extracción a presiones inferiores a la máxima. Según los autores el fenómeno se debe a la forma dispar en que afecta la presión la partición del soluto entre la fase sólida y el agua, lo que puede estar ocurriendo para el caso de la astaxantina.

Tabla 3-4: Resultados obtenidos al final del proceso de extracción de homogenato. En esta tabla R representa la recuperación de oleorresina (g oleorresina/g microalga) y Ra la recuperación de astaxantina (g astaxantina/g astaxantina inicialmente en la muestra). Presión (bar) Temperatura (ºC) 40 70

350 R 12.52 20.81

Ra 39.16 54.84

450 R 13.29 19.90

Ra 50.68 54.19

550 R 13.61 22.71

Ra 48.84 48.45

Por otro lado, de las curvas de extracción de oleorresina es posible apreciar que a una presión de extracción constante un incremento en la temperatura aumenta el rendimiento de extracción de oleorresina en forma importante (Figura 3-2, Tabla 3-4), lo cual sumado al leve efecto que tiene la presión de extracción sobre el rendimiento, parece indicar que la variación en la volatilidad de los solutos tiene mayor relevancia que los cambios en la densidad del CO2 sobre la solubilidad de la oleorresina en el CO2. En cuanto a la extracción de astaxantina, se observa que existe un efecto positivo de la temperatura sobre el rendimiento de extracción, el cual es altamente dependiente de la presión de extracción, siendo más fuerte su efecto a presiones más bajas (Tabla 3-4). Esta interacción entre presión y temperatura sobre la extracción es un resultado no esperado considerando que el proceso está controlado por la solubilidad en el CO2, ya que para carotenoides la solubilidad presenta saltos mayores con cambios en la temperatura a medida que la presión de comparación aumenta, pues existe un alejándose de la temperatura de cross-over (Jay et al., 1991; de la Fuente et al., 2006). Sin embargo, al ser este un sistema multicomponente complejo la solubilidad medida para un sistema binario soluto-CO2 no es completamente

24 aplicable, debido a que las condiciones de presión y temperatura no sólo afectan la solubilidad de los compuestos en el CO2 sino que también en el agua, y es posible que se establezcan interacciones soluto-soluto que no observadas en sistemas binarios (Lucien y Foster, 2000). En cuanto a la pureza de los extractos obtenidos (Tabla 3-5), podemos observar que a menores temperaturas es posible obtener extractos más ricos en astaxantina, mientras que pareciera existir una presión intermedia entre 350-550 bar a la cual se alcanza un óptimo de pureza. Para el caso de las condiciones evaluadas en este estudio, la mayor pureza de extracto (6.77%) se logra a P = 450 bar y T = 40ºC. En resumen, considerando los efectos anteriormente descritos de presión y temperatura sobre la extracción de homogenato, se tiene que el mayor rendimiento para la extracción de oleorresina (22.7%) se obtiene a P =550 bar y T = 70ºC, mientras que la mayor recuperación de astaxantina (54.84%) se registra a P = 350 bar y T = 70 ºC (Tabla 3-5). Por su parte, la condición para lograr un extracto más rico en astaxantina (6.77%) es a P = 450 bar y T = 40ºC. Tabla 3-5: Pureza de extractos (100 × g astaxantina/g oleorresina) de homogenato de H. pluvialis. T (ºC)/P (bar) 70 40

3.3

350 4.73 5.65

450 4.88 6.77

550 3.87 6.54

Comparación extracción de sólido con extracción de homogenato Al comparar las curvas de extracción obtenidas para sólidos y para homogenato es

fácil darse cuenta que las tasas de extracción para homogenato son mucho menores a las de sólido, requiriéndose un consumo especifico de CO2 mucho mayor para conseguir igual rendimiento de extracción, o visto de otra forma, se logran rendimientos de extracción mucho menores para un mismo consumo específico de CO2. La Tabla 3-6 muestra este fenómeno, al presentar un factor que representa la masa de astaxantina recuperada por

25 masa de CO2 consumida (G), apreciándose claramente que para todos los casos este valor es mayor para extracción de sólidos respecto de homogenato. Por lo tanto, es posible concluir que el agua presente en el homogenato tiene un efecto negativo sobre la solubilidad de los solutos en la fase supercrítica independiente de las condiciones de extracción reportadas en este estudio. Tabla 3-6: Factor de productividad (G). La tabla muestra el factor G (mg astaxantina/kg CO2) que relaciona la masa de astaxantina recuperada por masa de CO2 consumido en el proceso de extracción total bajo las diferentes condiciones estudiadas. P (bar) T (ºC) 70 40

350 Homogenato Sólido 1.75 3.98 1.25 3.98

450 Homogenato 1.73 1.62

Sólido 4.37 4.00

550 Homogenato 1.55 1.56

Sólido 4.67 4.47

No obstante lo anterior, si bien la velocidad a la que ocurre el proceso de extracción es una variable importante, pues esta determina el consumo de CO2, la obtención de extractos de mayor pureza podría contrarrestar este efecto negativo, debido a la mayor valorización de estos productos en el mercado. Al comparar las purezas de los extractos finales obtenidos tanto para sustrato sólido (Tabla 3-3) como para homogenato (Tabla 3-5) podemos observar que las dos mayores purezas de extracto se alcanzan al extraer homogenato a P = 450 bar; T = 40 oC y P = 550 bar; T = 40 oC, con valores de 6.77% y 6.35% respectivamente. Sin embargo, la recuperación de astaxantina por masa de CO2 consumida es muy baja para estas dos condiciones siendo de 1.62 y 1.56 respectivamente. Por su parte, si bien la extracción de sustrato sólido presenta una recuperación de astaxantina por masa de CO2 2-3 veces mayor, la mayor pureza alcanzada es de un 5.96%, valor inferior al registrado para extracción de homogenato. Por lo tanto, aún cuando la extracción de homogenato retarda el proceso de extracción, en algunos casos tiene la ventaja de generar extractos finales de mayor pureza que en la extracción de sustrato sólido. Lo anteriormente expuesto queda respaldado por la Figura 3-5, que permite observar la condición a la cual se obtiene un extracto de mayor pureza para una misma recuperación

26 de oleorresina. En forma práctica, un extracto que se encuentre más alejado del eje de las abscisas que otro para una misma recuperación presentará una mayor pureza del compuesto deseado. La ventaja de esta figura es que permite comparar la evolución en la pureza del extracto conforme se va recuperando oleorresina desde el sustrato. Una primera conclusión que se deriva del gráfico es que a medida que transcurre la extracción, para todos los casos la cantidad de astaxantina que se extrae en relación a la oleorresina total va aumentado (pendiente creciente) lo que puede estar sucediendo por una mayor solubilidad de los compuestos de oleorresina en CO2, lo que implica que se alcanza más rápidamente la fase controlada por transferencia de masa o el CO2 deja de salir saturado de la mayoría de los compuestos de la oleorresina, mientras que la extracción de astaxantina aún se encuentra en la etapa controlada por solubilidad y abandona saturado el extractor. Sumado a lo anterior, se puede observar que para el caso de extracción de homogenatos la composición del extracto permanece constante por un periodo de extracción mucho más prolongado que para el caso de extracción de microalga seca, lo que refuerza el efecto negativo del agua sobre la solubilidad de oleorresina y astaxantina en CO2, ya que el sistema permanece por un periodo más largo de extracción controlado por solubilidad saliendo saturado de ambas “solutos”. Finalmente, al comparar las curvas de extracción obtenidas con la recta que se obtendría si el extracto recolectado tuviese en todo momento la composición presente en la microalga (1.92% del peso seco de astaxantina; 32% peso seco de oleorresina), es posible constatar que la mayor parte de las curvas pasan por debajo de esta recta, lo que indica que la recuperación de oleorresina se ve favorecida por sobre la de astaxantina. Sin embargo, para la extracción de homogenato a P = 450 bar; T = 40 oC se tiene que en todo momento la pureza del extracto obtenido es igual o superior a la composición de la microalga, lo cual es un fenómeno interesante, ya que indica que el agua mejora la selectividad del proceso de extracción.

27

Figura 3-3: Comparación pureza de extractos. Las figuras sólidas (negras) corresponden a homogenato y las figuras huecas (rojas) a sólido. Las pendientes de las curvas permiten obtener las purezas de los extractos a medida que se va recuperando oleorresina.

28 4.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

4.1

Conclusiones

De los resultados obtenidos en este trabajo se derivan las siguientes conclusiones: Es factible efectuar un proceso de extracción por lotes para recuperar astaxantina a partir de un homogenato de la microalga Haematococcus pluvialis utilizando como medio solvente CO2 supercrítico. Para el caso de extracción de Haematoccocus pluvialis como sustrato sólido, y dentro del rango de presiones (P = 350-550 bar) y temperaturas (T = 40-70 ºC) estudiados, tanto el rendimiento de oleorresina como de astaxantina se ven favorecidos por un aumento de la temperatura y presión del proceso, lo cual concuerda con lo reportado por otros autores, siendo la mejor condición de extracción, en cuanto a recuperación de astaxantina (60.8%),

P = 550 bar y T =

70ºC, y en cuanto a pureza final del extracto (5.96%), P = 450 bar y T = 70ºC . Por lo tanto, no existe una única condición óptima de extracción, sino que la elección de condiciones de operación adecuadas dependerá del producto final esperado, siendo esto un compromiso entre rendimiento, pureza, y tiempo de proceso. Para el caso de extracción de un homogenato de Haematoccocus pluvialis, y dentro del rango de presiones (P = 350-550 bar) y temperaturas (T = 40-70 ºC) estudiados, el efecto de la presión sobre los rendimientos de extracción de oleorresina y astaxantina no presentan una tendencia clara, lo cual es consistente con lo publicado por otros autores para la extracción por lotes de suspensiones acuosas. Por su parte, un incremento en la temperatura de extracción presenta un efecto positivo tanto en el rendimiento de extracción de oleorresina como de astaxantina, siendo para este último caso el efecto altamente dependiente de la presión de extracción. De los resultados reportados se establece que la condición de extracción de astaxantina más favorable en relación a la recuperación obtenida es P = 350 bar y T = 70 ºC con una recuperación de 54.4%, mientras que si se desea alta pureza la mejor condición es P = 450 bar y T = 40 ºC con un pureza de extracto de 6.77%.

29 Por lo tanto, al igual que lo ocurre para la extracción de sustrato sólido, la mejor condición de extracción depende del resultado final que se desea obtener. El agua presente en el homogenato afecta negativamente la solubilidad de la oleorresina y astaxantina en CO2, lo que se traduce en procesos de extracción más lentos en comparación a la extracción de microalga seca, requiriéndose un mayor consumo específico de CO2 para lograr un mismo rendimiento de extracción. Por otro lado, la presencia de agua hace que se generen diferencias más marcadas en la pureza de los extractos obtenidos que para el caso de un sólido seco. Además, el agua no sólo afecta en forma importante la cinética de extracción por reducir la solubilidad de los compuestos en el CO2, sino que también genera un retardo inicial en el proceso que se traduce en la obtención de curvas sigmoidales.

4.2

RECOMENDACIONES A partir de los resultados obtenidos en este estudio y el análisis efectuado se derivan

una serie de recomendaciones: En relación a lo observado para la extracción de sustrato sólido se recomienda (i) Medir el efecto de la presión y temperatura sobre la solubilidad de ésteres de astaxantia en CO2-SC; (ii) Determinar las isotermas de sorción de astaxantina entre la microalga y el CO2-SC; y, (iii) Modelar la cinética de extracción de astaxantina desde la microalga seca utilizando el modelo propuesto por Sovová (2005). Derivado de la metodología desarrollada para extraer un homogenato en un extractor, se recomienda (i) Presurizar lentamente el sistema de filtración para evitar que la muestra sea impulsada al gradiente de presión establecido al principio del proceso; (ii) Evitar llenar el extractor con homogenato por sobre la mitad de su capacidad, pues sobre este límite se suelen presentar problemas de taponamiento de los filtros por el desplazamiento del fluido; (iii) Calefaccionar la salida del sistema luego del BPR para evitar taponamiento por la formación de hidratos; (iv) Utilizar algún material inerte (e.g esferitas de vidrio) para

30 evitar la canalización del flujo de CO2; (v) Diseñar un sistema que permita recuperar el agua extraída con el fin de registrar la cinética de extracción de agua y entender mejor su efecto sobre el proceso.. En relación al proceso de extracción de homogenato y con el fin de comprender mejor los fenómenos observados se recomienda (i) Determinar el equilibrio de fase del sistema ternario agua-CO2-ésteres de astaxantina; y (ii) Estudiar la partición de los ésteres de astaxantina para el sistema ternario microalga-aguaCO2.

31 BIBLIOGRAFÍA Andrich, G., Zinnai, A., Nesti, U., Venturi, F. y Fiorentini, R. (2006). Supercritical fluid extraction of oil from microalga Spirulina platensis. Acta Alimentaria, 35, 195-203 Andrich, G., Nesti, U., Venturi, F., Zinnai, A. y Florentini, R. (2005). Supercritical fluid extraction of bioactive lipids from the microalga Nannochloropsis sp. European Journal of Lipid Science and Technology, 107, 381-386. Benvenuti, F., Gironi, F. y Lamberti, L. (2001). Supercritical deterpenation of lemon essential oil, experimental data and simulation of the semi-continuous extraction process. The Journal of Supercritical Fluids, 20, 29–44. Bitran E. Energías renovables no convencionales: estrategias de innovación para Chile [diapositiva]. 8 de Octubre 2009. Antofagasta, Consejo Nacional de Innovación para la Competitividad, 26 diapositivas. Brunner, G. (1994). Gas extraction. An introduction to fundamentals of supercritical fluids and the application to separation processes. New York, EE.UU.: Springer. Budich, M. y Brunner, G. (2003). Supercritical fluid extraction of ethanol from aqueous solutions. The Journal of Supercritical Fluids, 25, 45–55. Budich, M., Heilig, S., Wesse, T., Leibküchler, V. y Brunner, G. (1999). Countercurrent deterpenation of citrus oils with supercritical CO2. The Journal of Supercritical Fluids, 14, 105–114. Canela, A.P.R.F., Rosa, P.T.V., Marques, M.O.M. y Meireles, M.A.A. (2002). Supercritical fluid extraction of fatty acids and carotenoids from the microalgae Spirulina máxima. Industrial & Engineering Chemistry Research, 41, 3012-3018. Capelli, B. y Cysewski, G.R. (2006). Astaxanthin, Natural Astaxanthin: King of the Carotenoids. Hawai, EE.UU: Cyanotech Corporation. Catchpole, O.J., Grey, J.B., y Noermark, K.A. (2000). Fractionation of fish oils using supercritical CO2 and CO2 + ethanol mixtures. The Journal of Supercritical Fluids, 19, 25– 37. Chisti, Y. (2007). Biodiesel from microalgae. Biotechnology Advances, 25, 294-306. Chuang, M.H. y Brunner, G. (2006). Concentration of minor components in crude palm oil. The Journal of Supercritical Fluids, 37, 151–156.

32 Cocero, M.J. y García, J. (2001). Mathematical model of supercritical extraction applied to oil seed extraction by CO2 + saturated alcohol-I. Desorption model. The Journal of Supercritical Fluids, 20, 229-243. Danielski, L., Brunner, G., Schwänke, Ch., Zetzl, C., Hense, H. y Donoso, JPM. (2008). Deterpenation of mandarin (Citrus reticulata) peel oils by means of countercurrent multistage extraction and adsorption/desorption with supercritical CO2. The Journal of Supercritical Fluids, 44, 315–324. de la Fuente, J.C., Oyarzún, B., Quezada, N. y del Valle, J.M. (2006). Solubility of carotenoid pigments (lycopene and astaxanthin) in supercritical carbón dioxide. Fluid Phase Equilibria, 247, 90-95. del Valle, J.M. y Aguilera, J.M. (1999). Extracción con CO2 a alta presión. Fundamentos y aplicaciones en la industria de alimentos. Food Science and Technology International, 5, 1-24. del Valle, J.M. y de la Fuente, J.C. (2006). Supercritical CO2 Extraction of Oilseeds: Review of Kinetic and Equilibrium Models. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 46, 131-160. del Valle, J.M., Jiménez, M. y de la Fuentes, J.C. (2003). Extraction kinetics of prepelletized Jalapeño peppers with supercritical CO2. The Journal of Supercritical Fluids, 25, 33-44. Dufossé, L., Galauo, P., Yaron, A., Malis, S., Blanc, P., Chidambara, KN. y Ravishankar, G.A. (2005). Microorganism and microalgae as source of pigments for food use: a scientific oddity or an industial reality?. Trends in Food Science & Technology, 16, 389406. Eller, F.J., Taylor, S.L., Compton, D.L., Laszlo, J.A. y Palmquist, D.E. (2008). Countercurrent liquid carbon dioxide purification of a model reaction mixture. The Journal of Supercritical Fluids, 43, 510–514. Fleck, U., Tiegs, C. y Brunner, G. (1998). Fractionation of fatty acid ethyl esters by supercritical CO2: high separation efficiency using an automated countercurrent column. The Journal of Supercritical Fluids, 14, 67–74. Fornari, T., Vazquez, L., Torres, C.F., Ibanez, E., Senorans F.J. y Reglero, G. (2008). Countercurrent supercritical fluid extraction of different lipid-type materials: experimental and thermodynamic modeling. The Journal of Supercritical Fluids, 45, 206–212. Gamse, T., Rogler, I. y Marr, R. (1999). Supercritical CO2 extraction for utilisation of excess wine of poor quality. The Journal of Supercritical Fluids, 14, 123–128.

33 Gast, K., Jungfer, M., Saure, C. y Brunner, G. (2005). Purification of tocochromanols from edible oil. The Journal of Supercritical Fluids, 34, 17–25. Gironi, F. y Maschietti, M. (2005). Supercritical carbon dioxide fractionation of lemon oil by means of a batch process with an external reflux. The Journal of Supercritical Fluids, 35, 227–234. Goodwin, T.W. y Srisukh, S. (1949). Some observation on astaxanthin distribution in marine crustacean. Biochemical Journal, 45(3), 268-270. Green, L.A. y Akgerman, A. (1996). Supercritical CO2 extraction of soil-water slurries. The Journal of Supercritical Fluids, 9, 177-184 Gouveia, L. y Empis, J. (2003). Relative stabilities of microalgal carotenoids in microalgal extract, biomass and fish feed: effect of storage conditions. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 4, 227-233. Gouveia, L., Nobre, B.P., Marcelo, F.M., Mrejen, S., Cardoso, M.Y., Palabra, A.F. y Mendes, R.L. (2007). Functional food oil coloured by pigments extracted from microalgae with supercritical CO2. Food Chemistry, 101, 717-723. Guerin, M., Huntley, M.E. y Olaizola, M. (2003). Haematoccocus astaxanthin: applications for human health and nutrition. Trends in Biotechnology, 21, 210-216. Higuera-Cipara, I., Félix-Valenzuela, L. y Goycoolea, F.M. (2006). Astaxanthin: a review of its chemistry and applications. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 46 (2), 185-196. Hopper, M.L. y King, J.W. (1992). Supercritical Fluid Extraction Enhancer. United States Patent 5151188. Hu, Q.H. (1999). Supercritical carbon dioxide extraction of Spirulina platensis component and removing the stench. Journal of Agricultural and Fodd Chemistry, 47, 2705-2706. Huang, G., Chen, F., Wei, D., Zhang, X., y Chen, G. (2010). Biodiesel production by microalgal biotechnology. Applied Energy, 87, 38-46. Jay, A.J., Steytler, D.C. y Knights, M. (1991). Spectrophtometric Studies of Food Colors in Near-Critical Carbon Dioxide. The Journal of Supercritical Fluids, 4, 131-141. Kanel, J.S. y Marentis, R. T. (2000). Process for fluid/dense gas extraction under enhanced solubility conditions. United States Patent 6106720. Kitada, K., Machmudah, S., Sasaki, M., Goto, M., Nakashima, Y., Kumamoto, S. y Hasegawa, T. (2008). Supercritical CO2 extraction of pigment components with

34 pharmaceutical importance from Chlorella vulgaris. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 84, 657-661. Lang, Q. y Wai, Ch.M. (2001). Supercritical fluid extraction in herbal and natural product studies––a practical review. Talanta, 53, 771–782. Lorenz, R.T. y Cysewski, G.R. (200o). Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin. Trends in Biotechnology, 18, 160–167. Lucien, F.P. y Foster, N.R. (2000). Solubilities of solid mixtures in supercritical carbón dioxide: a review. The Journal of Supercritical Fluids, 17, 111-134. Ma, F. y Hanna, M.A. (1999). Biodiesel production: a review. Bioresource Technology, 70, 1-15. Macías-Sánchez, M.D., Mantell, C., Rodríguez, M., Martinez de la Ossa, E., Lubián, L.M. y Montero, O. (2005). Supercritical fluid extraction of carotenoids and chlorophyll a from Nannochcloropsis gaditana. Journal of Food Engineering, 66, 245-251. Macías-Sánchez, M.D., Mantell, C., Rodríguez, M., Martínez de la Ossa, E., Lubián, L.M. y Montero, O. (2009). Comparison of supercritical fluid and ultrasound-assisted extraction of carotenoids and chlorophyll a from Dunaliella salina. Talanta, 77, 948-952. Machmudah, S., Shotipruk, A., Goto, M., Sasaki, M. y Hirose, T. (2006). Extraction of astaxanthin from Haematococcus pluvialis using supercritical CO2 and ethanol as entrainer. Industrial & Engineering Chimestry Research, 45 (10), 3652-3657. Mandiola, J.A., Jaime, L., Santoyo, S., Reglero, G., Cifuentes, A., Ibañez, E. y Señoráns, F.J. (2007). Screening of functional compounds in supercritical fluid extracts form Spirulina platensis. Food Chemisty, 102, 1357-1367. Mendes, R.L. (2008). Supercritical fluid extraction of active compounds from algae. En J.L. Martinez (Ed.), Supercritical Fluid Extraction of Nutraceutical and Bioactive Compounds (pp. 189-213). New York, EE.UU: CRS Press. Mendes, R.L., Reis, A.D. y Palabra, A.F. (2006). Supercritical CO2 extraction of γlinolenic acid and other lipids from Arthrospira (Spirulina) maxima: Comparison with organic solvent extraction. Food Chemistry, 99, 57-63. Mendes, R.L., Nobre, B.P, Cardoso, M.T., Pereira, A.P. y Palabra, A.F. (2003). Supercritical carbon dioxide extraction of compounds with pharmaceutical importance from microalgae. Inorganica Chimica Acta, 356, 328-334. Mendes, R.L., Fernandes, H.L, Coelho, J.P., Reis, E.C., Cabral, J.M.S, Novais, J.M. y Palabra, A.F. (1995). Supercritical CO2 extraction of carotenoids and other lipids from chlorella-vulgaris. Food Chemistry, 53, 99-103.

35

Mendes-Pinto, M.M., Raposo, M.F., Bowen, J., Young, A.J. y Morais R. (2001). Evaluation of different cell disruption processes on encysted cells of Haematococcus pluvialis: effects on astaxanthin recovery and implications for bio-availability. Journal of Applied Phycology, 13, 19-24. Miao, R., Lu, D., Li, Y. y Mingtao, Z. (2006).Characterization of astaxanthin esters in Haematococcus pluvialis by liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry. Analytical Biochemistry, 352, 176-181. Naranjo-Modad, S., López-Munguía, A., Vilarem, G., Gset, A. y Bárzana, E. (2000). Solubility of purified lutein diesters obtained from Tagetes erecta in supercritical CO2 and the Effect of Solvent Modifiers. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48, 5640564. Nobre, B., Marcelo, F., Passos, R., Beirao, L., Palabra, A., Gouveia, L. y Mendes, R. (2006). Supercritical carbon dioxide extraction of astaxanthin and other carotenoids from the microalga Haematococcus pluvialis. European Food Research and Technology, 223, 787-790. Olaizola, M. (2003). Commercial development of microalgal biotechnology: from the test tube to the market. Biomolecular Engineering, 20, 459-466. Oliveira, E.L.G., Silvestre, A.J.D. y Silva, M.C. (2010). Review of kinetic models for supercritical fluid extraction. Chemical Engineering Research and Design, In Press. Reverchon, E. y de Marco, I. (2006). Supercritical fluid extraction and fractionation of natural matter. The Journal of Supercritical Fluids, 38, 146-166. Roney, D., Waibel, B. y Marentis, R. (2008). Supercritical CO2 carrot feedstock extraction. United States Patent 2008/0233238 A1. Sato, M., Kondo, M., Goto, M., Kodama, A. y Hirose, T. (1998). Fractionation of citrus oil by supercritical countercurrent extractor with side-stream withdrawal. The Journal of Supercritical Fluids, 13, 311–317. Señoráns, FJ., Ruiz-Rodriguez, A., Ibáñez, E., Tabera, J. y Reglero, G. (2001). Optimization of countercurrent supercritical fluid extraction conditions for spirits fractionation. The Journal of Supercritical Fluids, 21, 41–49. Señoráns, F.J., Ruiz-Rodriguez, A., Ibáñez, E., Tabera, J. y Reglero, G. (2003). Isolation of brandy aroma by countercurrent supercritical fluid extraction. The Journal of Supercritical Fluids, 26, 129–135. Sovová, H. (2005). Mathematical model for supercritical fluid extraction of natural products and extraction curve evaluation. The Journal of Supercritical Fluids, 33, 35-52.

36 Spolaore, P., Joannis-Cassan, C., Duran, E. y Isambert, A. (2006). Commercial applications of microalgae. Journal of Bioscience and Bioengineering, 101 (2), 87-96. Sun, M. y Temelli, F. (2006). Supercritical carbón dioxide extraction of carotenoids from carrot using canola oil as a continuous co-solvent. The Journal of Supercritical Fluids, 2006, 397-408. Thana, P., Machmudah, S., Goto, M., Sasaki, M., Pavasant, P. y Shotipruk, A. (2008). Response surface methodology to supercritical carbon dioxide extraction of astaxanthin from Haematococcus pluvialis. Bioresource Technology, 99, 3110–3115. Valderrama, J.O., Perrut, M., y Majewski, W. (2003). Extraction of astaxantine and phycocyanine from microalgae with supercritical carbon dioxide. Journal of Chemical & Engineering Data, 48, 827-830. Varona, S., Martin, A., Cocero, M.J y Gamse, T. (2008). Supercritical carbon dioxide fractionation of lavandin essential oil: experiments and modeling. The Journal of Supercritical Fluids, 45, 181–188. Zosel, K. (1982). Process for the direct decaffeination of aqueous coffee extract solution. United States Patent 4348422.

37 ANEXOS

ANEXO A: Estudios publicados sobre fraccionamiento y extracción de corrientes líquidas usando CO2-SC Proceso Desacidificación de aceite vegetal Extracción/enriquecimiento de tocoferoles de aceite destilado deodorizado Concentración de tococromanoles de aceite de palma Recuperación de escualeno a partir de aceite de oliva deodorizado Fraccionamiento de etil esteres de ácidos grasos Remoción de esteres de ácidos grasos de mezcla de reacción Remoción de compuestos sin reaccionar y subproductos de una reacción enzimática Fraccionamiento de aceite de pescado incluyendo mezclas CO2 + etanol Deterpenación de aceites cítricos Deterpenación de aceite de piel de limón Fraccionamiento de aceite cítrico Fraccionamiento de aceite de limón Deterpenación de aceite de piel de mandarina Fraccionamiento de aceite esencial de lavanda Extracción azeotrópica de etanol de soluciones acuosas Extracción de aromas y etanol de vino Fraccionamiento de licores Aislamiento de aroma de brandi Ácidos orgánicos Descafeinación de soluciones acuosas Recuperación b-caroteno de pasta de Dunaliella salina Recuperación -caroteno de pasta de Zanahoria

Referencia Fornari et al. (2008) Fornari et al. (2008) Gast et al. (2005) Fornari et al. (2008) Fleck et al. (1998) Chuang y Brunner (2006). Eller et al. (2008) Catchpole et al. (2000) Budich et al. (1999) Benvenuti et al. (2001) Sato et al. (1998) Gironi y Maschietti, (2005) Danielski et al. (2008) Varona et al. (2008) Budich y Brunner (2003). Gamse et al. (1999) Senorans et al. (2001) Senorans et al. (2003) Shimshick (1981) Zosel (1982) Kanel y Marentis (2000) Roney et al. (2008)

38 ANEXO B: Estudios publicados sobre extracción de microalgas usando CO2-SC La presente tabla resume algunos de los estudios reportados en literatura sobre la extracción de compuestos de alto valor agregado utilizando dióxido de carbono supercrítico como solvente. Condiciones de extracción Arthrospira máxima - Carga: Materia prima más esferas de vidrio por arriba y abajo - 60 ºC - 25-35 MPa - Etanol (10%) Chlorella vulgaris - Carga: Materia prima más esferas de vidrio por arriba y abajo. - 40-55 ºC - 10-35 MPa - Grado ruptura - Carga: 5 g de muestras más esferas de vidrio - 40-50 ºC - 10-35 MPa - Grado ruptura

- 40 ºC - 30MPa - Grado ruptura - 0.34 o 0.6 L NPT/min - Aceite y etanol

- Extractor de 10 mL - 3g de microalga y esferas de vidrio. - 60-80 ºC - 20-50 MPa - 2.5 mL/min - Etanol (7.5%) - Acetona (7.5%).

Resultados

Ref*

- El uso de etanol aumenta la recuperación de GLA (4 a 13%). - El aumento de presión incrementa la recuperación de GLA (18% a 45%)

[1]

- Mayor ruptura aumenta la recuperación de Carotenos a 35 MPa y 55ºC (de 10% a sobre 40%). Para lípidos el aumento de de 20% a sobre 50%. - Sobre 20 MPa el efecto de temperatura en el rendimiento es mucho menor que el de presión - Óptimo recuperación lípidos: 35 MPa, 55ºC y células fracturadas (13%). Mismas condiciones sin ruptura 5% recuperación. - Para carotenos a 35 MPa, 55ºC y células fracturadas 40% recuperación y no fracturadas un 10%. - A40ºC, 30 MPa, alto grado de ruptura y SC-CO2 se logra recuperar 69% de carotenos - A menor grado de ruptura menor recuperación. - Con Etanol mejora la recuperación de células enteras (17% a 20%).

[1]

- Óptimo recuperación Luteina: 80ºC y 50 MPa usando Etanol (baja selectividad). - Rendimiento para beta-Caroteno dos órdenes de magnitud menores a otros pigmentos.

[4]

[1] [2]

[3]

39 Dunaliella salina - Carga: Materia prima más esferas de vidrio por arriba y abajo. - 40-60 ºC - 20 MPa - Carga: 0.1g de microalga. - 40-60 ºC - 10-50 MPa - 4.5 mmol/min Haematococus pluvialis - Extractor de 10 mL - Carga: 0.5g de materia prima y el resto arena de sílice - 40-80 ºC - 30-50 MPa - 1-4 horas (h) - 3 mL/min - Extractor de 5 mL - Carga: 2g de materia prima - 40-60 ºC - 20-30 MPa - Grado ruptura - 10% de etanol - 60ºC - 30 MPa - 1mL/min - Grado ruptura - Extractor: 50 mL - Carga: 7g de microalga mas esferas de vidrio arriba y abajo - 40-80 ºC - 20-55 MPa - 2-4 cm3/min - Etanol (1.67-7.5%) Nannochloropsis gaditana - Carga: 0.2 g de microalga - 40-60 ºC - 10-50 MPa - 4.5 mmol/min

Nannochloropsis sp

- La extracción con SC-CO2 es más selectiva que la acetona entre -caroteno cis/trans.

[1]

- Óptimo carotenos: 40MPa y 60ºC con rendimiento de 12.17 mg/g. La mayor selectividad se logró a 30MPa y 40ºC pero la mitad del rendimiento.

[5]

- Óptimo a 70ºC, 50MPa y 4 h. - Recuperación: 83.78% - Rendimiento: 23 mg/g

[6]

- Óptimo: algas rotas, 30MPa, 60ºC y etanol. - Recuperación: 92% de carotenos y 90% de astaxantina. - Rendimiento: 16 mg/g

[7]

- Rendimiento: Células una vez rota 0.85 %, dos veces rotas 1.3%. - Con etanol se recupero un 97% (1.6% rendimeinto). Y la concentración extracto aumento de 0.35% a 1.75%. - Óptimo: 55 MPa, 70 ºC y 3 cm3/min con lo cual se logra una recuperación del 79.9% y un contenido en el extracto de 12.3%.

[8]

- La mayor cantidad de carotenos se logra a 40 MPa y 60 ºC (rendimiento 0.34 mg/g). - La mayor selectividad de carotenos se logra a 20 MPa y 60 ºC (1.4 veces más carotenos q clorofila)

[10]

[9]

40 - Óptimo PUFA’s: 55 MPa y 55 ºC con una concentración de 54.6% (44.4% omega-3) y un rendimiento de 250 mg lipidos/g

[11]

- Rendimiento: con SC-CO2 puro de 1.1% con 10% de etanol 3%.

[8]

- Carga: 173g de materia prima y 173g de esferitas de vidrio. - 20-70 ºC - 15-18 MPa - 306 kg/h

- Óptimo recuperación ac. grasos se logra a 15 MPa y 50 ºC con 30 mg. - Óptimo recuperación carotenos es a 18 MPa y 30 ºC con 2.27 mg.

[12]

- Carga: 5 g de microalga. - 50-60 ºC - 25-35 MPa - 2 g/min - Etanol 10%

- Óptimo: 25 MPa, 50 ºC y Etanol recuperando 45% de GLA.

[13]

- Óptimo se logra con etanol, 55 ºC y presiones intermedias (22-32 MPa) con una recuperación sobre 65%. - SC-CO2 puro requiere altas presiones y temperatura.

[14]

- Óptimo lípidos: 35 MPa y 4 h con un rendimiento de 7.2%. - Óptimo GLA: 40 MPa y 4 h con un rendimiento de 0.29%

[15]

- Carga: 180 g materia primas y 100g de esferas de vidrio. - 40-55 ºC - 40-70 MPa - 6h - 10% de etanol - 10 kg/h Spirulina maxima - 60 ºC - 30 MPa - 1mL/min

Spirulina platensis - Extractor: 285 mL - Carga: 75 g microalga y 120 g tierra de mar. - 27-83 ºC - 7.8-36.1 MPa - Etanol (10%). - 75 min. - 40 ºC - 30-40 MPa. - 2-4 h.

41 - Carga: 8 g de microalga y 100 g de esferas de vidrio - 40-55 ºC - 25-70 MPa. - 10 kg/h - 0-4h *

- Óptimo lípidos 55ºC y 70MPa con un rendimiento de 77.9 mg /g de microalga en un tiempo de 1.30 h. - A 55ºC y 55MPa se requiere de 2 h para conseguir un rendimiento de 77.9 mg/g.

[16]

[1]Mendes et al., 2003; [2] Mendes et al., 1995; [3] Gouveia et al., 2007; [4] Kitada et al., 2008; [5] Macías-Sánchez et al, 2009; [6] Thana et al, 2008; [7] Nobre et al, 2006; [8] Valderrama et al., 2003; [9] Machmudah et al., 2006; [10] Macías-Sánchez et al., 2005; [11] Andrich et al., 2005; [12] Canela et al., 2002; [13] Mendes et al., 2006; [14] Mandiola et al, 2007; [15] Hu 1999; [16] Andrich et al., 2006

42 ANEXO C: Validación metodología Extracción de sólidos Para encontrar una metodología adecuada para la extracción de sólidos se partió extrayendo el polvo seco sin agregar tierra de diatomeas pero ocurrio un fenómeno de aglomeración, el cual genera canalización de flujo y por ello zonas muertas en el lecho. Para evitar esto se decidió agregar tierra de diatomeas como ha sido sugerido por Hopper y King (1992), lo cual efectivamente eliminó el problema. Posteriormente, se efectuaron pruebas con distinta carga de soluto (3 g y 1 g) manteniendo la relación entre la microalga y tierra cargada, de tal forma de asegurar que en la zona inicial del proceso de extracción el CO2 se encontraba saliendo saturado del extractor y además asegurar reproducibilidad en los resultados. La figura adjunta muestra un caso particular (P = 550 bar; T = 40 ºC) donde se aprecia claramente que en un comienzo ambas curvas se superponen. La diferencia que se aprecia en la zona intermedia entre la curva de las prueba 1, y las pruebas 2 y 3 se pude deber a diferencias en el lecho debido a que la prueba 1 fue efectuada cargado una mayor cantidad de microalga (3 g) que las pruebas 2 y 3 (1 g).

Figura Anexo C-1: Pruebas de extracción de sólidos.

43 Extracción de homogenato Para encontrar una metodología de extracción de líquidos se partió cargando el homogenato sólo en el extractor, pero se encontró que el CO2 se canalizaba por el interior medio del extractor desplazando el fluido a las paredes. Para evitar este inconveniente se procedió a cargar el extractor con esferitas de vidrio las cuales permitieron una mejor dispersión del flujo en el lecho. Posteriormente se procedieron a efectuar extracciones a P = 550 bar y T = 70 ºC para verificar la reproducibilidad de los datos. La figura adjunta presenta las curvas cinéticas obtenidas donde se puede apreciar una alta reproducibilidad de los resultados obtenidos.

Figura Anexo C-2: Pruebas de extracción de homogenato.

44 ANEXO D: Resultados extracción de polvo de H. pluvialis Presión de extracción 550 bar, Temperatura de extracción 70 ºC F (kg CO2/g microalga)

R (g extracto/g microalga)

y (mg astaxantina/g microalga)

0,028

4.21

1.94

0,048

6.27

3.13

0,096

9.34

4.62

0,192

12.83

6.01

0,336

15.93

8.09

0,576

18.68

9.79

0,865

20.05

10.76

1,442

20.70

11.10

2,019

21.42

11.45

2,5

21.88

11.69

Presión de extracción 550 bar, Temperatura de extracción 50 ºC F (kg CO2/g microalga)

R (g extracto/g microalga)

y (mg astaxantina/g microalga)

0.022

3.19

0.85

0.036

4.60

1.33

0.073

7.21

2.63

0.147

9.72

3.85

0.220

11.65

4.68

0.514

14.25

6.16

0.808

16.40

7.71

1.397

18.95

9.78

1.985

20.19

10.71

2.5

21.31

11.18

45 Presión de extracción 450 bar, Temperatura de extracción 70 ºC F (kg CO2/g microalga)

R (g extracto/g microalga)

y (mg astaxantina/g microalga)

0.030

2.51

0.85

0.050

3.84

1.63

0.099

7.40

3.29

0.198

12.38

6.68

0.347

15.28

8.83

0.594

16.43

9.70

0.891

16.95

10.21

1.485

17.58

10.49

2.079

18.07

10.62

2.5

18.35

10.95

Presión de extracción 450 bar, Temperatura de extracción 40 ºC F (kg CO2/g microalga)

R (g extracto/g microalga)

y (mg astaxantina/g microalga)

0.029

1.93

0.54

0.048

3.29

0.93

0.095

6.27

2.24

0.190

7.90

3.29

0.333

10.51

4.81

0.571

13.76

6.27

0.857

15.83

7.12

1.429

16.75

8.55

2

17.34

9.46

2.5

17.87

10.01

46 Presión de extracción 350 bar, Temperatura de extracción 70 ºC F (kg CO2/g microalga)

R (g extracto/g microalga)

y (mg astaxantina/g microalga)

0.028

1.72

0.46

0.047

2.79

0.55

0.091

5.35

1.57

0.182

7.43

2.45

0.273

10.00

3.57

0.455

12.29

5.14

0.727

15.25

7.10

1.273

17.17

8.72

1.818

18.42

9.72

2.5

18.72

9.96

Presión de extracción 350 bar, Temperatura de extracción 40 ºC F (kg CO2/g microalga)

R (g extracto/g microalga)

y (mg astaxantina/g microalga)

0.039

1.99

0.58

0.065

3.23

0.96

0.130

5.45

2.01

0.259

8.24

3.42

0.454

11.01

5.28

0.778

12.85

6.88

1.167

14.34

7.93

1.944

15.75

8.96

2.722

16.86

10.10

2.5

16.71

9.96

47 ANEXO E: Estructura de monoésteres y diésteres de astaxantina La Figura A muestra la estructura de una molécula de astaxantina. Las figuras B y C muestran moléculas generales de mono y diésteres de astaxantina respectivamente, donde R representa cualquier cadena alifática (típicamente entre 16-18 átomos de carbono) (Miao et al., 2006).

48 ANEXO F: Resultados extracción de homogenato de H. pluvialis Presión de extracción 550 bar, Temperatura de extracción 70 ºC F (kg CO2/g microalga)

R (g extracto/g microalga)

y (mg astaxantina/g microalga)

0.59

2.91

0.92

1.21

6.93

2.16

1.76

10.59

3.37

2.35

13.02

4.19

2.94

15.65

5.01

3.53

17.87

5.74

4.12

19.48

6.55

4.71

21.02

7.35

5.29

22.90

8.23

5.88

23.93

9.16

6

24.05

9.33

Presión de extracción 550 bar, Temperatura de extracción 40 ºC F (kg CO2/g microalga)

R (g extracto/g microalga)

y (mg astaxantina/g microalga)

0.79

1.62

0.90

1.58

4.44

2.64

2.28

6.55

3.86

3.07

9.06

5.30

3.66

10.86

6.27

4.36

12.27

7.30

5.05

13.40

8.44

5.64

14.09

9.12

6

14.37

9.40

49

Presión de extracción 450 bar, Temperatura de extracción 70 ºC F (kg CO2/g microalga)

R (g extracto/g microalga)

y (mg astaxantina/g microalga)

0.67

2.94

1.24

1.33

6.47

3.04

2

9.59

4.41

2.67

12.63

5.71

3.43

15.53

7.12

4

17.30

8.15

4.67

18.90

8.97

5.52

20.43

9.87

6

21.37

10.43

Presión de extracción 450 bar, Temperatura de extracción 40 ºC F (kg CO2/g microalga)

R (g extracto/g microalga)

y (mg astaxantina/g microalga)

0.65

1.28

0.65

1.31

2.68

1.56

1.96

5.31

3.24

2.71

7.81

4.85

3.46

9.63

5.98

4.11

11.21

7.28

4.77

12.59

8.33

5.42

13.58

9.22

6

14.41

9.76

50 Presión de extracción 350 bar, Temperatura de extracción 70 ºC F (kg CO2/g microalga)

R (g extracto/g microalga)

y (mg astaxantina/g microalga)

0.7

2.17

0.84

1.4

5.53

2.34

2.1

9.26

4.21

2.8

12.33

5.54

3.5

15.22

6.87

4.2

17.51

7.90

5

20.28

9.35

5.7

21.88

10.21

6

22.28

10.56

Presión de extracción 350 bar, Temperatura de extracción 40 ºC F (kg CO2/g microalga)

R (g extracto/g microalga)

y (mg astaxantina/g microalga)

0.58

1.23

0.32

1.17

2.17

0.80

1.94

4.77

2.09

2.72

7.28

3.22

3.40

9.02

4.02

3.98

10.66

5.03

4.76

11.96

5.99

5.44

12.77

6.84

6

13.33

7.54