Guía: Centrifugación de la sangre

ESCUELA DE SALUD

GUÍA CENTRIFUGACIÓN DE LA SANGRE.

DIRIGIDO A: Alumnos de la carrera de Técnico de Laboratorio Clínico y Banco de Sangre en la asignatura de “Banco de Sangre II”

PRE- REQUISITO: Guía Centrifugas, asignatura “Instrumentación” Taller “Flebotomía en Donantes de Sangre “

Autores: TM. Fernando Zamorano EU Eliana Escudero DuocUC

Guía: Centrifugación de la sangre

INTRODUCCIÓN La sangre ha sido transfundida con éxito durante unos 60 años. Sin embargo durante este periodo de tiempo la práctica transfusional ha cambiado radicalmente y con ella los productos utilizados y el procesamiento. Las primeras transfusiones corresponden a sangre completa, procedimiento que se realiza de brazo a brazo y que soluciona solo algunos de los problemas hematológicos que padecen los pacientes, principalmente aquellos asociados a la capacidad transportadora de oxigeno, función desempeñada por los glóbulos rojos, mientras el resto de hemocomponentes se encuentra en pequeña cantidad en la sangre completa y sus efectos en la transfusión por ello es poco eficiente. Separar la sangre en sus componentes debe haber sido una idea que nace de observar lo que ocurre en forma natural (al permanecer almacenada), pero como este proceso se extiende por un tiempo superior al que algunos hemocomponentes se mantienen viables en la sangre, fue necesario utilizar una herramienta que lo facilitara (en menos tiempo) y es la centrifugación de la sangre lo que da solución a esta dificultad. La centrifugación corresponde a una técnica ampliamente usada en los bancos de sangre, que permite la obtención de Concentrado Eritrocitario (Glóbulos Rojos), Plasma Fresco Congelado, Plaquetas, Crioprecipitado, y Concentrado de Leucocitos. El plasma es separado en otros de sus componentes, al sumar a la centrifugación procedimientos como el procesamiento de grandes cantidades de Plasma Fresco Congelado con la técnica de fraccionamiento alcohólico de Cohn, de Cohn – Oncley y la ultra-filtración. La utilización de estos procedimientos permite obtener factores de la coagulación por separado, albúmina e inmunoglobulinas; procesamiento que se realiza en plantas industriales de fraccionamiento de plasma. Por último, como una forma alternativa de separar componentes de la sangre se debe considerar a la aféresis en sus distintas opciones plasmaferesis, plaquetoferesis, citoferesis, etc.

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OBJETIVOS. Al finalizar el taller el alumno será capaz de: Centrifugar una unidad de sangre completa para obtener hemcomponentes, al menos Concentrado de Glóbulos Rojos y Plasma Fresco Congelado. Identificar diferencias entre una centrifuga de banco y una de laboratorio y sus cuidados particulares. Realizar los procedimientos adecuados que mantienen la viabilidad y la función de los hemocomponentes. Realizar los procedimientos adecuados para evitar cambios físicos que perjudican los hemocomponentes.

REALIZADO POR: Tecnólogo Medico (experiencia en banco de sangre)

DURACIÓN: 90 minutos

NUMERO DE ALUMNOS POR DOCENTE Maximo 10 alumnos

MARCO TEÓRICO. Nota: revisar para el taller las “Norma del manejo Post exposición Laboral a Sangre en el contexto de la Prevención de la Infección por VIH Resolución exenta 561 del 7.03.2000” Hoy en día la transfusión sanguínea es más que extraer sangre a un donante para ponerla a un paciente. La transfusión moderna procura administrar a cada paciente SÓLO el componente deficiente. La "terapia por componente" disminuye el riesgo de efectos adversos de la transfusión y asegura que se consiga el máximo rendimiento de cada donación de sangre.

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Guía: Centrifugación de la sangre Es frecuente que los componentes de una donación se utilicen para tratar a varios pacientes con enfermedades diferentes. Esto es posible por medio de la utilización de técnicas de centrifugación, congelación y descongelación, que permiten separar las diferentes células (glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas) y el plasma, dando lugar a diversos productos sanguíneos con una composición, una forma de conservación y un uso transfusional propios. Las partículas en disolución (por ejemplo los componentes de la sangre) pueden sufrir alteración espacial, es decir, pueden cambiar de posición con el tiempo. Esto se debe a procesos de difusión (en un gradiente de concentración, las partículas tienden a ir de la zona de mayor concentración a la de menor concentración) o bien a procesos de sedimentación. Se produce sedimentación por gravedad si la densidad de la partícula es mayor que la densidad del disolvente. Las velocidades de sedimentación que se dan en condiciones naturales son muy bajas. Para aumentar la velocidad de sedimentación, se utiliza la centrifugación.

Distintos productos obtenidos usando la centrifugación

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La centrifugación es una técnica de separación de partículas que se basa en la distinta velocidad de desplazamiento de las partículas en un medio líquido al ser sometidas a un campo centrífugo para la obtención de hemocomponentes. Cuando se centrifuga una solución, se rompe la homogeneidad y se produce la separación del soluto y del disolvente. Las primeras partículas en sedimentar son las de mayor masa.

Aplicaciones.  Separar en sus componentes las unidades de sangre. 

Cosecha de células especificas, células troncales (madres, pluripotente) usadas en el tratamiento de aplasia o posterior a tratamientos de quimioterapia en el caso de cáncer.

Características de una centrífuga de banco de sangre: Son de uso específico en el banco de sangre Son de rotor de ángulo móvil Refrigeradas Los capachos son de gran tamaño para contener la unidad de sangre. (Para ver detalles de las distintas centrifugas ver guía Centrifugas).

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Las bolsas de sangre se centrifugan para obtener tres componentes: Hematíes, Plaquetas y Plasma

Uso de la centrifuga 1 La centrifuga será encendida con anticipación a su uso para que la unidad refrigerante alcance la temperatura adecuada según el hemocomponente que se ha planificado obtener (para el caso de plasma fresco 2 a 6°C y en el caso de plaquetas 20 a 24°C). Cerciórese que el dispositivo que indica la temperatura a utilizar por la centrifuga este en el lugar indicado. 2 Las bolsas con sangre han sido pesadas y se busca aquellas con peso igual o semejante. 3 Habrá la centrífuga y retire los capachos. 4 Los capachos deben ser hermanados por peso igual o semejante. Introduzca una bolsa de sangre al interior del capacho, con todos sus dispositivos de conexión hacia afuera (ver imagen superior) y las bolsas satélites extendidas detrás de la bolsa principal. La tubuladura debe ser puesta alrededor de la

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bolsa de forma que quede apretada contra el capacho (para evitar que durante la centrifugación la tubuladura flote al interior de la centrifuga y se rompa), pero no bebe formar una cintura en la bolsa de sangre. Ajuste el peso de los capachos hermanos y bolsas con sangre, para ello puede agregar trozos de goma de distinto tamaño a un costado de las bolsas y la pared del capacho, nunca al fondo del capacho, pues durante la centrifugación es posible que rompan la bolsa de sangre. En el caso de que el capacho disponga de tapa, proceda a colocarla. Los capachos hermanados son depositados en la centrifuga, uno frente al otro, para mantener equilibrada la centrifuga. En el caso que no cuente con bolsas suficientes para toda la carga de la centrifuga, los capachos vacíos igual deben ser ubicados en sus posiciones. Cierre la centrífuga. Observe que la centrífuga a alcanzado la temperatura que se fijo en el punto “1”. Proceda a indicar el tiempo y las revoluciones al cual deberá funcionar la centrífuga para el producto que desea obtener.

Tabla 1 Combinación de Variables para preparar hemocomponentes a partir de sangre completa Centrifugación Pesada Pesada Leve

Productos

Velocidad (g)

Tiempo (minutos)

5000

5

5000

7

2000

3

Eritrocito centrifugados Concentrado de plaquetas Plasma Libre de Células Crioprecipitado Plasma Rico en Plaquetas

A continuación se detalla en forma general algunos de los procedimientos para obtener los hemocomponentes mas conocidos.

I. Preparación

de Concentrado de Glóbulos Rojos (otro nombre que reciben es de concentrado de Eritrocitos). Los eritrocitos se obtienen por eliminación del plasma sobrenadante de la sangre entera centrifugada. El volumen del plasma eliminado determina el hematocrito del componente.

1. La extracción de sangre se debe realizar en bolsa doble, triple o cuádruple (ver imagen de bolsa triple abajo). La unidad extraída se debe refrigerar entre 1 y 6°C si no se procesa de inmediato. Zona de nudos flojos y de pinzado

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2. Centrifugar la sangre utilizando una fuerza de centrifugación pesada (ver tabla 1) a una temperatura a 4°C. 3. Colocar la bolsa principal que contiene la sangre centrifugada (o sedimentada) en un desplasmatizador y suelte el muelle, dejando que la placa entre en contacto con la bolsa. Manipular con cuidado para no mezcla las distintas capas en que ha separada sido la sangre. 4. Realice dos nudos flojos (si dispone de un sellador de tubuladura no son es necesario realizar los nudos) en la tubuladura entre la bolsa primaria y la bifurcación en “Y” de la tubuladura (la imagen de la derecha indica con un circulo la zona en que se debe ubicar nudos flojos). 5. Obstruir la tubuladura entre los dos nudos flojos con una pinza (en la imagen de la derecha esta indicado por una estrella). Si hay 2 bolsas satélites colocar una pinza para que el plasma entre solo a una de ellas. 6. Marcar la bolsa satélite con la misma identificación que la bolsa principal y romper el sello de la bolsa principal que comunica con una de las bolsas satélites. Al traspasar unos 225 a 250 ml (la densidad del plasma es de 1.023) de plasma a la bolsa satélite, en la bolsa principal permanecen glóbulos rojos con un 70 a 80% de hematocrito. 7. Volver a pinzar la tubuladura cuando haya entrado en el bolsa satélite la cantidad de plasma establecido. Sellar la comunicación entre la bolsa principal y la satélite, cerrando los nudos flojos o aplicando sellos a la tubuladura, estos deben quedar cercanos a las bolsas, cortar la tubuladura. Observe que en los extremos de las tubuladuras no existan filtraciones. En la imagen de la derecha se observa con una “fecha” las zonas donde debe ubicar los nudos o sellos y con la imagen del rayo (rojo) la zona donde debe realizar los cortes de la tubuladura. 8. Elimine en un receptáculo adecuado el plasma que permanece en la tubuladura cortada. 9. Almacenar el hemocomponente obtenido a la temperatura adecuada. Autores: TM. Fernando Zamorano EU Eliana Escudero DuocUC

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Preparación concentrada de Glóbulos Rojos desde sangre extraída en bolsa simple. La preparación de un hemocomponente desde una bolsa simple, implica

romper la integridad de un sistema cerrado (la bolsa de extracción de sangre ha sido fabricada bajo condiciones higiénicas, sellada del ambiente exterior y esterilizada por medio de un método aprobado), por lo tanto se habla de preparación en sistema abierto. La preparación de un hemocomponente puede realizarse siempre y cuando se prevenga toda posibilidad de contaminación bacteriana, se trabaje en un ambiente limpio, utilizando materiales estériles y técnicas de manejo aséptico, manteniendo una presión positiva sobre la bolsa original hasta que ella sea sellada. La esterilidad de los componentes preparados en un sistema abierto debe ser monitoreado utilizando métodos validados. Los componentes sanguíneos obtenidos por medio de un sistema abierto deben ser utilizados tan pronto como sea posible. Los hemocomponentes cuya temperatura de almacenamiento es de 1 a 6°C deben ser transfundidos antes de 24 horas; la nueva fecha y hora de vencimiento se debe anotar en al etiqueta y en los registros.

Preparación de Glóbulos Rojos en solución aditiva

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Guía: Centrifugación de la sangre Preparación de Glóbulos Rojos Leucodepletados La leucodepleción corresponde al procedimiento que deja menos de 5x106 leucocitos por unidad, en el 99% de los componentes, con un nivel de seguridad del 95%. Lo cual se realiza por medio del uso de filtros. Preparación de Glóbulos Rojos Leucoreducidos. La leucorreducción corresponde al procedimiento que deja menos de 1,2x109 Leucocitos por unidad en el 75% de las unidades estudiadas, con un nivel de seguridad del 95%. Lo cual se realiza por medio del retiro del buffi coat, lo que será dependiente del procedimiento establecido por el banco de sangre. Preparación de Glóbulos Rojos Lavados El Alumno debe investigar sobre la Preparación de este Hemocomponente Preparación de Glóbulos Rojos Irradiados El Alumno debe investigar sobre la Preparación de este Hemocomponente

II. Preparación de Plasma Fresco Congelado (PFC). El plasma se separa de los elementos celulares de la sangre y se congela para preservar la actividad de los factores lábiles de la coagulación. 1. La extracción de sangre debe realizar en bolsa doble, triple o cuádruple. La unidad extraída se debe refrigerar a 4°C (1– 6°C) si no se procesa de inmediato y para obtener Plasma Fresco Congelado se debe procesar antes de 6 horas de extraída. 2. Al proceder de acuerdo al procedimiento I, en el punto 6 se obtiene una unidad de PFC junto con el concentrado de Glóbulos Rojos. 3. Congelar el plasma a –18°C o más, de modo tal que este quede congelado en estado sólido en un plazo de 6 horas desde la extracción. 4. Almacenar el PFC a –18°C. 5. El plasma debe ser congelado de manera que resulte fácil detectar si se ha descongelado y vuelto a congelar. Algunos métodos para ello son: 5.1. Oprima un tubo contra la bolsa durante el congelamiento para dejar una marco que desaparece si la unidad de licua. 5.2. Congelar el plasma plano en posición horizontal, pero almacenarlo vertical. Durante el congelamiento se forma una burbuja de aire en el punto mas alto; este se hallara en el contado de la bolsa luego congelamiento horizontal, pero se desplazara a la parte mas alta de la bolsa si se descongelo y se volvió a congelar en posición vertical. Autores: TM. Fernando Zamorano EU Eliana Escudero DuocUC

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III. Preparación de Concentrado de Plaquetas a partir de sangre entera. El plasma rico en plaquetas es separado de la sangre entera por centrifugación con “centrifugación liviana” y las plaquetas son concentradas por centrifugación pesada con extracción posterior del plasma sobrenadante. 1. Para preparar un concentrado de Plaquetas se requiere: 1.1. La extracción de sangre se debe realizar en bolsa triple o cuádruplo, 1.2. Que el tiempo de extracción de la unidad a preparar sea menor a 15 minutos 1.3. El recipiente final que almacenara las plaquetas debe ser de un plástico aprobado para el almacenamiento de las plaquetas, 1.4. La unidad extraída se debe mantener a temperatura ambiente (22°C) y procesar antes de 6 horas de extraída. 2. Centrifugar a velocidad suave (2000g por 3 minutos) a una temperatura de 20°C para obtener plasma rico en plaquetas. Si la temperatura de la centrífuga es de 1 – 6°C, regular el control de temperatura de la centrífuga refrigerada a 20°C y dejar que la temperatura se eleve hasta aproximadamente 20°C. 3. Procesar de acuerdo con el procedimiento I (puntos desde 3 a 9). Manipule con cuidado para no dispersar las plaquetas que se encuentran suspendidas en el plasma. En el punto 6 traspasa plasma rico en plaquetas a la bolsa satélite I, prevista como la bolsa que almacenara el concentrado de plaquetas. 4. Centrifugar el plasma rico en plaquetas junto a la(s) otra(s) bolsa(s) satélite a alta velocidad (5000g por 5 minutos) a una temperatura de 20°C. 5. Extraer el plasma sobrenadante pobre en plaquetas a bolsa satélite II y dejar bolsa satélite I con 50 a 60 ml de plasma. Sellar la tubuladura en dos puntos, entre ambas bolsas y cortar entre ellos. 6. Resuspensión de Plaquetas. Las plaquetas centrifugadas se agregan en forma irreversible si son sometidas a una agitación brusca, los siguientes pasos permiten una nueva suspensión sin agregación irreversible. 6.1. El concentrado plaquetario debe permanecer estacionario, con el lado del rotulo hacia abajo, a temperatura ambiente aproximadamente por 1 hora. 6.2. Resuspender las plaquetas en una de las siguientes formas: 6.2.1. Manipular el recipiente de las plaquetas manualmente para lograr una resuspensión uniforme. 6.2.2. Colocar el recipiente en un rotador a temperatura ambiente. La agitación lenta y suave debe lograr una resuspensión uniforme dentro de las 2 horas. 6.3. Mantener las suspensiones de plaquetas a 20 – 24°C con agitación suave continua. 6.4. Las plaquetas deben ser inspeccionadas antes de despacharlas para asegurarse que no se visualizan agregados plaquetarios. 6.5. El plasma pobre en plaquetas puede congelarse rápidamente y conservar como plasma fresco congelado.

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IV. Preparación de Crioprecipitado de globulina anti hemofílica (Factor VIII, factor antihemofilico, FAH). Se puede concentrar el factor VIII de la coagulación del plasma fresco congelado por crioprecipitación. La crioprecipitación se alcanza mediante el descongelamiento lento, a 1 – 6°C, de plasma que ha sido preparado para congelamiento dentro de las 6 horas de la flebotomía. 1. Para preparar un Crioprecipitado se requiere: 1.1. La extracción de sangre se debe realizar en bolsa triple o cuádruple, 1.2. Que el tiempo de extracción de la unidad a preparar sea menor a 15 minutos 1.3. La unidad extraída se debe refrigerar a 4°C si no se procesa de inmediato. 1.4. Para obtener Plasma Fresco Congelado se debe procesar antes de 6 horas de extraída. 2. Proceder de acuerdo con el procedimiento para la obtención de PFC (procedimiento II). Debe colectar como mínimo 200 ml (205 gramos) de plasma libre de células en la bolsa satélite para el procesamiento del crioprecipitado 3. Colocar rápidamente plasma en un dispositivo de congelamiento de modo de que este se complete dentro de las 8 horas de la flebotomia y dentro de la hora del momento que se inicio el congelamiento. Esto se logra con congelador de aire forzado o congeladores mecánicos capaces de mantener temperaturas de – 65°C o menos, hielo seco o un baño de etanol-hielo seco. Las bolsas de plasma sumergidas en liquido deben estar protegidas con una envoltura de plástico. 4. Dejar descongelar el plasma a temperaturas de 1 a 6°C colocando la bolsa en un refrigerador a 4°C. También puede realizarse este paso colocando la bolsa en un baño de agua batidor a 4°C, en este caso utilizar una envoltura de plástico u otro medio para mantener secas las puertas de la bolsa. 5. Cuando el plasma tiene una consistencia fangosa, separar el plasma liquido del crioprecipitado por uno de los siguientes procedimientos: 5.1. Centrifugar el plasma a 1-6°C utilizando una centrifugación pesada. Colgar la bolsa en posición invertida y dejar que el plasma separado fluya rápidamente a la bolsa satélite II, dejando que el crioprecipitado se adhiera a los costados de la bolsa primaria. Separa rápidamente, para evitar que el crioprecipitado se disuelva y salga fuera de la bolsa. 5.2. Colocar el Plasma que se esta descongelando en un extractor de plasma cuando aun esta congelado aproximadamente el 10% del contenido. Con la bolsa en posición erecta, dejar que el plasma sobrenadante fluya lentamente a la bolsa de transferencia, utilizando los cristales de hielo en la parte superior como filtro. La pasta de crioprecipitado se adhiere a los costados de la bolsa o al hielo. La bolsa satélite II contiene plasma pobre en crioprecipitado.

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6. Se puede dejar 10 a 15 ml de plasma sobrenadante en la bolsa para resuspender el crioprecipitado después del congelamiento. 7. Pinzar la tubuladura cuando se haya extraído aproximadamente el 90% del plasma pobre en crioprecipitado. 8. Comprobar que cada bolsa tenga la identificación correcta (numero de donante, fecha elaboración, tipo de componente). 9. Sellar la tubuladura entre ambas bolsas en dos lugares y cortar en esa zona. 10. Almacenar a -18°C o menos, de preferencia a -30°C o menos hasta 12 meses desde la fecha de colección del la sangre. Se puede preparar el crioprecipitado de plasma en cualquier momento dentro de los 12 meses de colección. La fecha de expiración del crioprecipitado es de 12 meses desde la fecha de la flebotomía, no desde la fecha en que fue preparado.

INSUMOS Y EQUIPOS NECESARIOS PARA EL TALLER      

Bolsas de sangre de distinto tipo Extractor de plasma Clips de metal y sellador manual Instrumentos limpios (tijeras) Balanza centrifuga

Actividad 1 Los alumnos simularan la centrifugación de una unidad de sangre completa para preparar Concentrado de Glóbulos Rojos y Plasma Fresco Congelado. Actividad 2 Los alumnos simularan la centrifugación de una unidad de sangre completa para preparar Concentrado de Glóbulos Rojos, Plasma Rico en Plaquetas, agregando solución aditiva al concentrado de glóbulos. Actividad 3 Los alumnos investigaran y disertaran sobre la limpieza y cuidados de una centrífuga refrigerada para fraccionamiento de sangre completa.

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BIBLIOGRAFIA 1. Orientaciones y Regulaciones para Centros de Sangre en Chile. Ministerio de Salud Chile 2004. 2. Manual Técnico. 12° edición. Asociación Argentina de Hemoterapia e Inmunohematologia. American Association of Blood Banks 1996. 3. Guía Practica Inmunohematologia y Banco de Sangre. Carrera de Tecnología Medica. Universidad de Chile. 1997. Características de los Hemocomponentes Hemocomponente

Concentrados Glóbulos Rojos

Concentrados Glóbulos Rojos Leucodepletados

Concentrados Glóbulos Rojos en solución aditiva

Concentrados Glóbulos Rojos en solución aditiva Leucodepletados

Concentrados Glóbulos Rojos en solución aditiva Leucoreducidos

Concentrados Glóbulos Rojos lavados

Conservación Medio Días CPD 21 CPD-A 35 Heparina 2 Circuito abierto 24

Temperatura CPD CPD-A Heparina Circuito abierto

2 - 6°C 21 35 2 24

Temperatura ADSOL NUTRICEL OPTISOL Temperatura ADSOL NUTRICEL OPTISOL

2- 6°C 42

Contenido

Control de Calidad

280 ± 60

CGR 55 a 75%, plasma 45 a 25%, algunas plaquetas y Glóbulos Blancos

Hematocrito y Volumen de la unidad

270 ± 50

CGR 55 – 75%, plasma 45 a 25% Leucocitos 6