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Topic: Chilean Approval of Colilert Title: '' Agua Potable - Metodo de determinacion simultanea de bacterias coliformes totales y Escherica coli mediante la tecnica del sustrato cromogenico '' Author(s): lnsLituto Nacional de Normalizcion, Chile Date: 5/15/98

Source: Chilean federal regulation NCh2043.c98 Highlights: • The Chilean government approves Colilert "Chromogenic Substrate Coliform Test" as included in Standard Nletbods for the Examination of Water and Wastewater AWW A-WEFAPHA method number 9223 for potable water testing. • Colilert is approved both as a Presence/ Absence method (Section 7.2) and as an MPN method (Section 7.3)

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Vencimiento consulta ptlblica: 1998.05.15

PROYECTO DE NORMA EN CONSULTA PUBLICA

NCh2043.c98

Agua potable - Metodo de determinaci6n simultanea de bacterias coliformes totales y Eschericha coli mediante Ia tecnica del sustrato cromogenico 1

\ Preambulo El Institute Nacional de Normalizaci6n, INN, es el organismo que tiene a su cargo el estudio y preparaci6n de las normas t~cnicas a nivel nacional. Es miembro de Ia lNTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION (ISO) y de Ia COMISION PANAMERICANA DE NORMA$ TECNICAS (COPANT), represent ando a Chile ante esos organismos. El proyecto de norma NChxxx ha sido preparado por Ia Divisi6n de Normas del Institute Nacional de Normalizaci6n, en base al documento tecnico elaborado por ESSEL S.A. y AROU7MED S.A. \

Este proyecta de norma es una homologaci6n del metoda 9223 Chromogenic substrate coliform test del Standa~ Methods for the Examination of Water and Wastewater AWWA-WEF-APHA, Q_~ ,.th edition 1995, siendo equivalente al mismo, con desviaciones menores en aspect9s de forma.

I

Los anexos A y B forman parte del crrpo de Ia norma.

Vencimiento consulta publica: 1998.05.15

PROYECTO DE NORMA EN CONSULTA PUBUCA

NCh2043.c98

Agua potable - Metoda de determinacion simultanea de bacterias coliformes totales y Eschericha coli mediante Ia tecnica del sustrato cromogenico iJ :J

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\ 1 Alcance y campo de aplicaci6n

, .f Est a norma establece Ia determinacion samultanea ae bactenas coliformes totales y E. coli en agua mediante Ia tecnica del sustrato cromog~n i co. 1.2 Esta norma se aplica al agua potable,

1

2 Referencias NCh426/2

NCh1620/1

Agua grado reactive para analisis - Especlflcaciones - Parte 2: An~llsis frsico-qurmico y microbiol6gico de agua potable, aguas crudas y aguas residuales. Agua potable - Determinacion de bac1erias coliformes totales Parte 1: Metodo de los tubes multiples (NMP).

3 Principio del metodo El metodo se basa en Ia capacidad que ttene Ia j3.-galactosidasa, enzima constituttva de las bacterias coliformes, de metabolizar el orto-nitrofenil·~0galactopiranoside1 ONPG, (nutriente indicador especfficol , liberar Ia porci6n indicadora (enzima' cromogenica indacadora de los c~liformes , o-nitrofenol) y tornarse amarilla, al ser incubada a 35°C ± 0 ,5°C durante 24 h. Conjuntamente con Ia capactdad de Ia J3-glucoronidasa, enztma constitutiva del E. coli, de metabolizar al 4 -metil-umberifenil - p..o-glucor6nido, MUG , (nutriente indicador especffico), liberar Ia porci6n indicadora l~a- cromogenica

35°C

±

lndicadorif de E. coli, 4 - metil·umbeliferonal al ser incubada a

0,5°C durant~· 24 h. I

1

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NCh2043 Este m~todo permite Ia confirmaci6n conjunta de presencia de coliformes totales y E. coli, sin ensayo presuntrvo, en 24 h.

4 T erminologra 4.1 bacterias collformes totales: comprende todos los bacrlos Gram negatives, eerobros o anaerobros facultativos , no esporulados, que poseen Ia enzima B-0galactostdasa y son capaces de metabolizar el sustrato cromogl§nico definido, resultando Ia hberaci6n del crom6geno.

4 .2 bacterias Escheriche coli: comprende las bacterias que dan respuesta positiva en el test del sustrato cromogenico 1 de coliformes totales y que poseen Ia enzima B- glucoronidasa y que son capaces de metabolizar el sustrato fluorog~nico 4-metil umbeliferil B·d·glucor6nido (MUG). obteniendose Ia liberaci6n del fluor6geno. 4.3 t6cnica de tubes multiples: metodo cuantitatlvo para estimar Ia concentraci6n de bactertas presentes en el agua, mediante Ia inoculaci6n de una ser1e de volumenes en concentracrones decrmales decrecientes de Ia muesua, en un medio de cultivo edecuedo. los cuales se incuban en condiciones de tlempo y temperatura determ tnados .

5 Reactjvos y medio de cultivo

5. 1 Re activos 5 .1. 1 Agua destilede esteril Exenta de sustancias t6xicas o nutrientes que pueden influir en el desarrollo o supervivencia de microorganismos (ver NCh426/2l.

T~.1.2 Comporodor

----·

Frasco comparador de 1 00 ml de color amarillo visible y fluorescente a 365 nm, en el Hmtte mrnimo de Ia sensibilidad, para distmgutr por comparaci6n los resultados pos1trvos dudosos de los negatives.

6.2 Sistema de reactivos 6.2. 1 Composicl6n del medio basal! Sulf eto de amonro

5,0 g

Sulfate de manganese

0 ,0005 g

Sulfate de zinc

0,0005 g

Sulfate de magnesia

0,1 g

2

NCh2043 Cloruro de sodio

10,0 g

Cloruro de calcic

0,05 g

Sulfite de sodio

0,04 g

Amfotericln

~

0,001 g

a-nitrofenil-r>-o-galactopiranosido

0,5 g

4-metilumbeliferil-r>-O-glucuronido

0,075 g

Solanium•

0,50 g

Buffer Hepes Sal de sodio

5,3 g

Acidos organicos

6,9 g

5.2.2 Preseo.taci6n 5.2.2.1 Do sis unitarias para 100 ml de muestra

6 Aparatos 6.1 Estufa de cultivo, ·regulable a 35°C 6.2 Estufa de esterilizaci6n, 1 70°C ± 1ooc.

con

±

0,5°C.

circulaci6n

de

aire

caliente,

regulable

a

6.3 Pipetas bacterio16gicas, de 1, 5ml a 10 ml, con subdivisiones de 0, 1 ml, esteriles. 6.4 Recipientes para pipetas, cilfndricos o rectangulares, de aluminio o acero inoxidable, u otro material no corrosive y resistente al calor, provisto de tapa; o envolturas de papel Kraft. No deben usarse recipientes de cobre o de aleaciones de est e. 6.5 Tubos de cultivo. ·de 30 ·mm · 150 mm y de 16 mm · 1 50 mm.

•1

Solenium esta patentado yes una mezcla de varies productos qulmicos lncluyendo antibi6ticos, capaz de suprimir los microorganismos para los cuales no esta disenado, los cuales por lo general no contienen Ia enzlma necesaria y no pueden metabolizer el nutriente indicedor, por lo que su crecimiento no puede continuar.

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3

NCh2043

6 .6 Frescos de muestras esteriles, con afore a 100 mi. 6 . 7 Sellador (en el caso de emplear bandejas

pl~stic as

de cuentificaci6n).

6.8 Bandejas est6riles, pl6sticas, de cuant1ficaci6n, para recuento bajo o alto.

6.9 L'mparas UV). = 365 nm.

6.1 0 Otro material de uso habitual en el laboratorio.

7 Procedimiento 7. 1 Oetermlnacl6n del cloro residual libre Analizar el contenido del elora residual de las muestras de acuerdo con el procedim1ento ind1cado en el m~todo 4500 - Cl G (M~todo colonm~tnco DPOI del Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater AWWA-WEFAPHA. 18 th edition 1995.

7.2 Ensayo presencia/ausencia 7.2.1 Tomar exactamente 100 ml de muestra en un fresco estt\ril (6.6). 7 .2.2 Agregar el contenido de un reactive (5.2.2. 1) para 100 mi. 7 .2.3 Agitar V1gorosamente.

7 .2.4 lncubar a 35°C ± 0,5°C. 7 .2.6 AI cabo de 24 h, comparar el frasco de reacci6n con el comparador de colores (5. 1 .2). Si no se observa ningun color amarillo. el anillisis es negative para coliformes totalc s. 7 .2.6 Si Ia muestra tiene un color amarillo comparador, queda confirmada Ia presencia resultado positive PIA. Probar fluorescencia sistema a ~rrad1ac i6n con lilmpara UV (6.9). como resultado poslttvo para E. coli.

de de en Si

tntensldad mayor o 1gual a Ia del coliformes totales Registrar como los frascos amarillos somet1endo el se observe fluorescenc1a, registrar

7 .2. 7 Si una muestra se ha vuelto amarilla al cabo de Ia incubaci6n de 24 h, pero Ia intensidad del color es levemente menor que Ia del comparador (5.1.2) o indefinible, incubar hasta 4 h adtc1onales (NO MAS DE 28 h), a 35°C ± 0,5°C. Proceder de Ia m1sma forma con Ia prueba de fluorescencia.

7 .2.8 Si le muestra contiene coliformes el color se intensificar6, constituyendo un ensayo pos1tivo. Si el color no se intensifica, Ia muestra debe cons1derarse como negatiVZJ. Regtstrar los frascos positives para coliformes totales y los poSittvos para E. coli, para Ia prueba de P/A.

4

NCh2043 7.3 Ensayo de cuantificaci6n (NMP)

7.3.1 Metodo de tubas multiples par cada 100 mt de agua est~r ll et contanido de un reactivo (5.2.2. 1 ). Agitar vigorosamente hasta djsolver el contenido (Ej.: para una secuencia de 1 5 tubas multiples agregar dos reactivos a 200 ml de agua est~riH, ver esquema N° 1 en p~gina 8 . Otstribuir Ia soluci6n en Ia serle de tubos a utilizer para el analisis.

7 .3.1. 1 Agregar

7 .3.1.2 lnocular los tubas con Ia mezcla obtenida en 7 .3.1 . 1, usando volumenes y series que se indican en tabla N° 1 de NCh 1620/1, de acuerdo a las diluciones que se requieran.

7 .3.1.3 Alternativamente es posible no preparar diluciones y tomar los 100 ml de muestra, agregar el contenido de un reactive, agitar haste disolver y dispenser en 5 6 10 tubas esterites, volumenes de 20 ml 6 10 ml respectivamente.

7 .3.1.4 Agitar vigorosamente cad a tubo. 7 .3. 1 .5 lncubar los tubas a 35°C ± 0,5°C.

7 .3. 1 .6 AI cabo de 24 h, comparar cada tubo de reacci6n con el comparador de colores (5.1.2). Si-no se observe ningun color amarillo, el an~lisis es negative para coliformes totales.

7 .3. 1. 7 Si Ia muestra tiene un color amarillo de intensidad mayor o igual a Ia del comparador, queda confirmada Ia presencia de coliformes totales. Registrar el numero total de tubas positives. Probar fluorescencia de los tubas o celdas amarillas sometiendo el sistema a irradiaci6n con l~mpara UV (6.9). Si Ia muestra tiene una fluorescencia mayor o .\gual. a Ia del comparador de color, confirmar Ia muestra como posltiva para E. coli y registrar el numero de tubas positives.

7 .3.1.8 Si una muestra se ha vuelto amarilla al cabo de Ia incubacl6n de 24 h, perc Ia intensidad del color es levemente menor que Ia del comparador (5.1.2) o lndefinible, incubar hasta 4 h adicionales (NO MAS DE 28 hl. a 35°C ± 0,5°C. Proceder de Ia misma forma con Ia prueba de fluorescencia. 7 .3.1.9 Si Ia muestra contiene coliformes el color se intensificar~, constituyendo un ensayo positive. Si el color no se intensifies, Ia muestra debe considerarse como negative. Registrar el numero total de tubes positives. 7 .3.1 .1 0 Si Ia muestra de agua tiene un color de fonda, comparar los tubas que contienen sistema de reactiyos (5.2) inoculado con un blanco de control de Ia misma muestra de agua. 7 .3.2 Metoda de bandeja de cuantificaci6n 7.3.2. 1 Tomar exactamente 100 ml de muestra en un fresco esteril (6.6). 7.3.2.2 Agregar el

con~~nido l{.j ·-·

de unreactive (6.2.2. 1I para 100 mi.

5

NCh2043 7 .3.2.3 Agitar vigorosamente.

7 .3.2.4 lntroducir el contenado dentro de Ia bandeja est~ril dependiendo del contenido esperado de coliformes totales.

de cuantificaci6n

7 .3.2.6 Oistribuir y sellar el dispositive usando el sellador (6. 7); ver esquema N° 2 en pagina 9.

7.3.2.6 lncubar e 35°C :: 0, 5°C. 7.3.2.7 AI cabo de 24 h, comparar cada una de las celdas de reaccu~n de Ia bandeJa con el comparador de color adecuado (5.1.2). Si no se observa ningun color amarillo, el an61isis es negative para coliformes totales.

7 .3.2.8 Sl Ia muestra t iene un color amarillo de lntensidad mayor o lgual a Ia del coMparador queda confirmada Ia presencia de coliformes totales . Registrar el numero totJl de tubas positives. Probar fluorescenc1a de los tubas o celdas amarillas sol'?letiendo el sistema a irradiaci6n con lampara UV (6.9). S1 Ia muestra taene una fluorescencia mayor o iguel a Ia del comparador de color, confirmar Ia muestra como pos1tava para E. coli. Registrar el numero de celdas positavas . 7 .3.2.9 S1 una muestra se he vuelto amarilla al cabo de Ia ancubaci6n de 24 h, pero Ia intensidad del color es levemente menor que Ia del comparador (5.1.2) a indefanible, incubar hasta 4 h ad1cionales (NO MAS DE 28 h), a 35°C ± 0,5°C. Proceder de Ia misme forma con Ia prueba de fluorescencia. t ntensifica r ~ . constituyendo un ensayo pos1tivo. Si el color no se intensafica , Ia muestra debe considererse como negativa. Aegtstrar el numero. total de celdas posttavas .

7 .3.3 Si Ia muestra contaene cohformes el color se

8 Expresi6n de resultados 8.1 Ensayo presencla/ausencia 8.1. 1 Si el resultado es positive en este ensayo expresar como :

>

0

= 1 UFC por 100 ml para coli formes totales y/o E. coli positives.

8.1.2 Si el resultado es negative en este ensayo expresar como:

<

1 UFC por 100 ml para coliformes tot ales y/o E. coli negatives.

8.2 Ensayo de cuantificaci6n • Metodo tubes multiples 8.2. 1 Oetermanar un c6digo de 3 cifras con Ia combanaca6n de tubos posittvos y negatives obtenidos en cada diluci6n .

..

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6

•

NCh2043 8.2.2 Con el c6digo establecido, entrar a Ia tabla N° 1, y leer directamente el numero mas probable de bacterias coliformes por 100 ml, en Ia columna correspondiente al numero de tubas sembrados en cad a diluci6n (ver anexos A y 8). 8.2.3 Expresar el resultado como NMP por 100 mi. •'

8.3 Ensayo de cuantificaci6n • M~todo de bandeja de cuantificaci6n 8.3.1 Para el caso de Ia bandeja de NMP 200, determiner el numero de celdas positives para coliformes totales. 8.3.2 Con este numero entrar a Ia tabla N° 2 probable de coliiormes totales por 100 mi.

y leer directamente el numero mas

8.3.3 Para el caso de Ia bandeja de NMP 2000, determiner el numero de celdas pequenas positives y el numero de celdas grandes positives, tanto para coliformes totales como para E. coli.

'

8.3.4 Con estes numeros, entrar a Ia tabla N° 3 y leer, en Ia intersecci6n de ambas columnas, el numero mas probable de bacterias coliformes totales . 8.3.5 Realizar Ia misma operaci6n para obtener los resultados de E. coli. 8 .3.6 Expresar el resultado como NMP · 100 mi.

9 lnforme

,,

En el informe se debe indicar como mfnimo: a) identificaci6n de Ia muestra; bl numero de horas transcurridas entre Ia toma de muestra y el ensayo; c) contenido de elora libre residual. determinado segun el metoda colorimetrico; d) referencia al metoda; e) resultados obtenidos; f) cualquier particularidad del ensayo que sea opcional. o no este considerada en

esta norma y que afecte los resultados.

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