III. PRODUCCION DE ÁCIDO CÍTRICO A PARTIR DE SUERO LÁCTEO ENTERO E HIDROLIZADO CON Aspergillus niger, POR VÍA FERMENTATIVA Leal D. 1, Pico Y2, Castro J.3, Guerra J.4, Castro G.5* 1,2,3,4,5

Programa de Ingeniería de Alimentos. Facultad de Ingeniería. Universidad de la Salle Cra 2 Nº 10-70, Bloque D piso 7 *[email protected]

RESUMEN El suero lácteo es un subproducto obtenido en gran cantidad en la elaboración de quesos, por lo cual se buscan nuevas alternativas de aprovechamiento, una opción es producir acido cítrico utilizando el suero lácteo como sustrato. En este trabajo se produjo acido cítrico a partir del suero lácteo entero (SE) e hidrolizado (SH) por medio de una fermentación realizada con Aspergillus niger 765. Se inoculó el hongo en los medios preparados de suero entero e hidrolizado con adición de 48 mg de fosfato diácido de amonio ((NH4)H2PO4), se incubaron los medios a 30 ºC por ocho días durante los cuales se realizaron pruebas para determinar azucares reductores totales (ART), biomasa, producción de acido cítrico, glucosa y pH. Hubo un consumo de azúcares similar en los dos medios tratados (SE y SH), se presentó disminución de pH debido a la fermentación, un aumento exponencial de los microorganismo siendo mayor en el hidrolizado por tener disponibilidad de glucosa en el tiempo inicial. La producción de acido cítrico fue similar en los dos medios, lo cual indica que independiente de la hidrolisis de azúcares complejos realizada a uno de los medios (SH), el Aspergillus niger tiene la capacidad de producir ácido cítrico desdoblando por si mismo la lactosa. La cantidad de biomasa producida en cada medio fue de 8,7g/L para SE y 15,2g/L para SH. La producción final de acido cítrico para el suero entero e hidrolizado fue de 9,9g/L y 9,6g/L respectivamente. Palabras claves: ácido cítrico, Aspergillus niger, suero de leche, hidrólisis de lactosa. ABSTRACT The whey is a byproduct obtained in large quantities in the manufacture of cheese, so it is looking for new alternative uses; one option is to produce citric acid using cheese whey as substrate. In this work, citric acid produced from whey whole (SE) and hydrolyzed (SH) through fermentation by Aspergillus niger 765. The fungus was inoculated in the media prepared whole and hydrolyzed whey with the addition of 48mg of ammonium dihydrogen phosphate (NH4) H2 PO4, media were incubated at 30 °C for eight days during which tests were used to determine total reducing sugars (TRS, biomass, production citric acid, glucose and pH. There was a similar sugar consumption in the two media treated (SE and SH), there was a pH decreasing and a microorganism exponential increase being higher in

the hydrolyzate due to the availability of glucose in the initial time. The production of citric acid is similar in both media, indicating that despite the complex sugars hydrolysis in one of the means (SH), Aspergillus niger is capable of producing citric acid unfolding itself lactose. The final production of citric acid in whole whey and hydrolyzed whey was 5.246 g /L and 6.752g /L respectively. Key Words: Citric acid, Aspergillus niger, cheese whey, lactose hydrolysis.

I.

INTRODUCCIÓN

La industria de alimentos es una de las que producen mayor contaminación, esto debido a la generación de residuos orgánicos e inorgánicos durante sus procesos. En la industria láctea, algunos efluentes como el suero lácteo, forman parte de los residuos de mayor proporción que existen; obtenido a partir de la elaboración de los diferentes quesos del mercado; este subproducto comprende del 80 al 90% del volumen de la materia transformada. A pesar de los diferentes manejos que se han dado, casi el 50% del suero es descargado en suelo, drenajes y cuerpos de agua, el porcentaje restante es utilizado en la elaboración de otros productos lácteos. Una alternativa para el aprovechamiento de subproductos se busca por medio de la biotecnología; en donde el suero puede suministrar fuentes de carbono y energía (por medio de la lactosa contenida en este), como medio de cultivo para el desarrollo de diferentes microorganismos y por consiguiente la obtención de metabolitos de gran importancia (Sánchez et al., 2004). Es de aclarar que hay muy pocos microorganismos que pueden utilizar la lactosa como fuente, pero al hidrolizar este disacárido obteniendo glucosa y galactosa, se aumenta la posibilidad de utilizar más microorganismos para estos procesos fermentativos (López et al.,

2006). El suero de leche ha sido de gran uso en la obtención de diferentes ácidos, como lo son láctico, acético, propiónico, glucónico y cítrico, (López et al., 2006), además es empleado en la misma medida para la propagación de inóculos en queserías, producción de vinos, entre otras aplicaciones. El acido cítrico es obtenido industrialmente por la fermentación de la glucosa o sacarosa obtenida de melaza de caña con Aspergillus níger (Sánchez et al., 2004), el proceso tiene varias etapas como lo son la preparación del sustrato de la melaza de caña, La fermentación por parte del microorganismo A. niger, separación, purificación, cristalización y secado del acido cítrico. Siendo importante este ácido por ser un producto de gran demanda en diferentes industrias (farmacéutica, cosmética, plásticos, detergentes) especialmente en alimentos como modificador de pH y acidulante. II. MATERIALES Y MÉTODOS. 2.1. Microorganismo Para la experimentación se utilizó una cepa de Aspergillus niger 765, suministrada por la Universidad de los Andes, la cual fue mantenida en refrigeración a 4 ºC. Para su posterior uso se realizó una re-siembra en Agar Saboraud en cajas de petri y en tubos,

incubado a 25 ºC por 7 días hasta que germinaran las esporas. Luego se realizaron suspensiones en agua esterilizada con twin 80 de aproximadamente 2 x 107 esporas/mL para su posterior inoculación en los medios elaborados (Sánchez et al., 2004). 2.2. Suero de leche Se utilizó suero lácteo deshidratado (proteína del 9% base seca), posteriormente reconstituido, con el fin de obtener una humedad del 97%, simulando el que se obtiene normalmente en plantas queseras. El 50% del suero reconstituido fue sometido a un proceso de hidrólisis por vía enzimática, la cual es de mayor eficiencia que la hidrólisis ácida (Ríos et al., 2006), utilizando la enzima Maxilact (Lactasa comercial). Se toman 250 mL de suero y se adiciona 2 mL de Maxilact a 37 ºC y pH=6.6 durante 1 hora para obtener una hidrólisis del 80% (López et al., 2006). Para asegurar que el suero ha sido hidrolizado adecuadamente, se realizó una prueba de determinación de hidrólisis de la lactosa por el método de glucosa-oxidasa. 2.3 Medio de cultivo de Aspergillus niger para producción de ácido cítrico Los medios utilizados para la experimentación fueron suero entero (SE) y suero hidrolizado (SH); con el fin de comparar entre ellos, cual es el mejor sustrato para la producción de ácido cítrico, se adicionan 100 mL de cada tipo de suero en erlenmeyers de 250 mL, a los cuales se les adicionó fosfato diácido de amonio ((NH4)H2PO4) en relación de

48 mg/kg, el pH se ajustó a 4 utilizando ácido clorhídrico (HCl) 0.1N. Posteriormente fueron esterilizados a 121 ºC por 15 min. Se inoculó cada medio con 3,4 mL de la suspensión de esporas (3%v/v) y se incubaron a una temperatura de 30 ºC (Sánchez et al., 2004). 2.4. Métodos de análisis Luego de establecer las variables a manejar y las condiciones de producción de acido cítrico, Se realizó un seguimiento durante 8 días, evaluando azúcares reductores totales (ART), contenido de glucosa, biomasa y producción de acido cítrico a una temperatura de 30 ºC, en donde se tomaron muestras cada 24 h. Para evaluar el contenido de azúcares reductores totales, se determinó por el método DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico), la glucosa se determinó por el método cuantitativo de glucosa IVD, las muestras fueron previamente desproteinizadas con ácido tricloroacetico al 10%, para evitar que estas interfirieran con los resultados. El contenido de ácido cítrico se estimó por el método espectrofotométrico de la piridina-anhídrido acético (Marier y Boulet, 1958). La determinación de biomasa se llevó a cabo por el método de peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se encuentran en una suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105 °C hasta peso constante.

SUERO DESHIDRATADO RECONSTITUCIÓN DEL SUERO

SUERO

para suero hidrolizado, lo cual supera lo encontrado por López 7,02 g/L para suero desproteinizado, como en este caso.

HIDROLISIS SUERO

ADICIONAR 48mg DE PO4-3

ESTERILIZAR MEDIOS (15min a 125 ºC) AJUSTE pH INOCULACION

Gráfica 1. Producción de de acido cítrico INCUBACION PRUEBAS

3.2. Consumo de glucosa Diagrama 1. Preparación de medios de cultivo para producción de ácido cítrico 2.5 Tratamiento de datos Las pruebas se realizaron por duplicado, analizándolas por método descriptivo y de varianza ANOVA con un nivel de confianza del 95%. III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1. Producción de ácido cítrico En la producción de acido cítrico se observa una similitud en la cantidad producida entre los dos medios de suero preparados. La producción final de ácido cítrico en cada medio fue muy similar obteniéndose 9,963 g/L para suero entero y 9,581 g/L

La gráfica 2. Muestra que el medio hidrolizado tiene mayor disponibilidad inicial de glucosa con 16,15 g/L en comparación con el suero entero con un valor inicial de 4,91g/L, esto debido a la acción de la enzima Maxilac, la cual desdobla la lactosa en glucosa y galactosa. En ambos casos se ve disminuida la glucosa durante el tiempo y en el día ocho se observa el consumo total de glucosa en los dos medios, alcanzando niveles similares de glucosa en las últimas tomas. Para el suero entero se puede inferir que a medida que el microorganismo desdobla la lactosa, la convierte de inmediato en ácido cítrico, ya que no se observa una lectura alta de la glucosa para ninguno de los días.

Gráfica 2. Determinación del contenido de glucosa durante el tiempo de análisis

Gráfica 3. Determinación del contenido de ART durante el tiempo de análisis. 3.5. Determinación pH

3.3. Consumo Reductores Totales

de

Azúcares

La gráfica 3. Muestra que hay mayor cantidad de azúcares reductores iníciales en el hidrolizado que en el entero con valores de 46,1 g/L y 23,7 g/L respectivamente. Pero en el día cuatro tienen la misma reducción hasta 13 g/L y en el último día de análisis tienen valores de aproximadamente 3 g/L al comparar esto con la gráfica 2 donde se reporta el consumo total de la glucosa se determinó que la disponibilidad reportada en esta gráfica se trata de otros azúcares reductores diferentes a este; sin embargo la fuente utilizada para producción de ácido cítrico es la glucosa y no la galactosa, por lo cual esta cantidad restante no es utilizada para la producción de este ácido.

Inicialmente el suero tiene un pH de 4,1 y después de los ocho días de análisis el pH obtenido estuvo entre 3,5 y 3,8, como se observa en la Gráfica 4. Lo cual indica una acidificación del medio producido por la fermentación que realiza el Aspergillus niger al producir el ácido cítrico, es evidente la relación directa entre la producción de éste y el descenso en el pH. Estos valores coinciden con los trabajados por Sánchez.

Gráfica 4. Determinación del contenido de pH durante el tiempo de análisis.

3.6. Producción de Biomasa En el día uno, la producción de biomasa en el medio de suero entero es mayor que el hidrolizado, pero en el ultimo día el fenómeno es contrario por que hay mayor cantidad de microorganismos en el medio de suero hidrolizado por tener desde el inicio una fuente alta de glucosa. La cantidad de biomasa en el suero hidrolizado fue de 15,21 g/L y en el suero entero de 8,75 g/L mostrando una diferencia significativa (gráfica 5). Esta diferencia en la cantidad de biomasa obtenida en el medio, se debe a la cantidad de glucosa disponible, sin ser un factor que afecte la producción final de ácido cítrico, ya que metabólicamente la biomasa se puede aumentar, con la mayor disposición de azúcares reductores diferentes a la glucosa, para el suero hidrolizado. López obtuvo un valor de 16 g/L aproximadamente, utilizando suero entero

pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradación. Además, la muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta. IV. CONCLUSIONES Se puede concluir que el Aspergillus niger, es un microorganismo adecuado para la producción de ácido cítrico a partir del suero lácteo, sin observar diferencia entre el suero entero e hidrolizado, es decir que este microorganismo es capaz de sintetizar de forma eficiente la lactosa y tomar la glucosa como fuente de energía para su crecimiento; y así realizar la fermentación para producir este ácido. La cantidad de glucosa en el medio el día ocho fue de 0.27 g/L en suero entero y 0.20 g/L en suero hidrolizado.

Gráfica 5. Determinación del contenido de biomasa durante el tiempo de análisis.

El tiempo de seguimiento escogido fue de ocho días siendo suficiente para agotar la glucosa y producir el ácido cítrico, su producción fue en forma logarítmica proporcional al crecimiento de los microorganismos con una concentración final de ácido cítrico de 9,963 g/L en suero entero y 9,581 g/L en suero hidrolizado y una biomasa de 8.75 g/L y 15.21 g/L respectivamente, indicando que hidrólisis de lactosa solo favorece al crecimiento del microorganismo y no influye significativamente en la producción de ácido.

La desventaja de este método es que componentes volátiles de la célula

Se recomienda que el ácido cítrico obtenido a partir del suero lácteo por Aspergillus niger, sea extraído y refinado

para posteriores aplicaciones en la industria alimentaria, además que su efecto sea comparado con el obtenido industrialmente con la melaza de la caña. V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Alderete, Juan Manuel. Ácido cítrico. Dirección de Industria Alimentaria S.A.G.P. y A., Alimentos Argentinos N° 12. Pág. 5 de 7. Consultado en: http://www.alimentosargentinos.gov.ar/0 -3/revistas/r_12/Citrico.PDF Currie, James N. The citric acid fermentation of Aspergillus niger. Received for publication, April 20. From the Research Laboratories, Dairy Division, United States Department of Agriculture, Washington. Consultado en: http://www.jbc.org/content/31/1/15.full.p df López C., Meneses A., Herrera S., Ruiz A., Medina V. (2006). Producción de ácido cítrico con Aspergillus niger nrrl 2270 a partir de suero de leche. Universidad Nacional de Colombia, Medellín. vol. 73 No.150 DYNA. Consultado en: http://www.scielo.org.co/scielo.php?pid= S001273532006000300004&script=sci_arttext . Marier I R, Boulet M. Direct determination of citric acid in milk with an improved pyridine-acetic anhydride method (1958). J. Dairy Sci. 41:168392,. [Div. Applied Biology, National Research Council, Ottawa, Canada]. Consultado en:

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