PRODUCCION DE ETANOL A PARTIR DE YUCA MEDIANTE BIOREACTOR DE TANQUE AGITADO CON CONTROL DE VARIABLES AUTOR: Qco. Msc. AMLETO LEON TÉLLEZ Y COLABORADORES DOCENTE INVESTIGADOR UNIVERSIDAD AUTONOMA DE BUCARAMANGA, UNAB Email: [email protected] ó [email protected]

RESUMEN DEL PROYECTO: El proyecto consiste básicamente en producir etanol a partir del almidón aislado de la yuca raíz sin cáscara, dicho almidón (polisacárido de glucosa) se somete a hidrólisis química, de tal forma que se produzcan azúcares fermentables, que son sometidos a una fermentación anaeróbica por acción de la levadura Saccharomyces cerevisiae obteniéndose así una solución etanólica. Ambas etapas, hidrólisis y fermentación anaeróbica son realizadas en el Bioreactor de Tanque Agitado controlando las variables de pH, Temperatura, Agitación, Tiempos de hidrólisis y de fermentación y Concentración de sustratos. Los experimentos de producción de etanol en el Bioreactor están planteados de acuerdo a un diseño factorial de experimentos que permite el análisis estadístico de los resultados.

Lo innovador del proyecto en la obtención de etanol por vía Biotecnológica a partir del almidón de yuca, es la aplicación del Bioreactor con control de variables para las dos etapas del proceso, hidrólisis química y fermentación anaeróbica. Estas etapas se realizan en forma continua, y en el mismo bioreactor; para tal efecto éste cuenta con accesos para la toma de muestras y para la adición de nutrientes y estabilizadores del bioproceso.

I. INTRODUCCION Este proyecto se enmarca dentro del interés del gobierno colombiano, expresado en la Ley 693 de Septiembre 19 de 2001, por la cual se dictan normas sobre el uso de alcoholes carburantes, se crean estímulos para su producción, comercialización y consumo, y s0e dictan otras disposiciones. Dicha Ley reza así en su artículo primero: "A partir de la vigencia de la presente ley, las gasolinas que se utilicen en el país en los centros urbanos de más de 500.000 habitantes tendrán que contener componentes oxigenados tales como alcoholes carburantes, en la cantidad y calidad que establezca los Ministerios de Minas y Energía, y del Medio Ambiente para cada región del país”.

La Resolución prevé que a más tardar el 27 de Septiembre de 2005 las primeras ciudades donde se venderá gasolina mezclada con etanol serán Cali, Bogotá, Medellín y Barranquilla y sus respectivas áreas metropolitanas.

En Bucaramanga, Cartagena, Cúcuta y Pereira será obligatorio a partir del 27 de septiembre del 2006. Posteriormente, la medida

se

aplicará

para

el

resto

del

país.

De acuerdo con la Asociación de Recursos Renovables del Canadá, el agregado de un 10% de etanol al combustible trae los siguientes beneficios: reducción de un 30% de las emisiones de monóxido de carbono y disminución entre un 6% y un 10% de reducción de las emisiones de dióxido de carbono a la atmósfera.

En este contexto, el bioalcohol surge como una fuente energética limpia y renovable; asimismo, presentan una potencialidad como materia prima para la síntesis del producto hoy de origen petroquímico. Por tanto, es una de las alternativas más atrayentes a la hora de considerar sustitutivos válidos del petróleo.

Dentro de los cultivos no convencionales, la yuca es uno de los más prometedores para la obtención de etanol en nuestro país, debido a su alto contenido de hidratos de carbono fácilmente fermentables, la rusticidad de la planta y los altos rendimientos obtenidos.

II. MATERIALES Y METODOS A. AISLAMIENTO DEL ALMIDÓN DE YUCA . La extracción del almidón de la yuca se realizó de acuerdo a los siguientes pasos: Primero Lavado; con el fin de retirar tierra y otras impurezas que trae la yuca. Segundo, Descortizado; se realiza a mano, teniendo el cuidado de no retirar también parte del tubérculo con la cáscara. Tercero, Rallado; se hace con el fin de desintegrar las células de las raíces para dejar libre e almidón. Cuarto, Tamizado; que consistió en colar la yuca rallada previamente, lavándola con agua abundante, para separar el almidón de la fibra 10 mL H2O/g, yuca sin cáscara, el tamiz corresponde a un tamaño de grano de 0.1 mm. El almidón es arrastrado por el agua a través del tamiz y la fibra permanece en éste, con la cual se logra separarlo. Quinto, sedimentado; Consistió en decantar la lechada que sale del tamiz para separar los gránulos del agua y por último el Secado; Tanto el almidón como la fibra se secan en una estufa a 60ºC de temperatura y durante 24 horas.

B. HIDRÓLISIS DEL ALMIDON DE YUCA Se realizó Hidrólisis Acida, controlando la temperatura de reacción , presión de reacción, concentración del ácido y del almidón. Con el almidón hidrolizado se obtienen azúcares fermentibles mediante rompimiento de las cadenas de glucosa. La Hidrólisis se llevó a cabo en Autoclave Marca “All American”, hecha en aluminio fundido con tubo metálico flexible de escape, manómetro y control de válvula, su cierre es de metal a metal sin empaques de caucho, y de volumen de 15 L. Los pasos que se siguieron en la Hidrólisis de almidón por vía química fueron los siguientes: Se pesó una cantidad de almidón para un volumen de 800mL y para una concentración dada de ácido en un erlenmeyer de 1L que fue llevado al autoclave x condiciones de 15 psi, durante 30 minutos a una temperatura de 120°C, terminada la hidrólisis se filtra al vacío y luego se determina la cantidad de azúcar obtenida. Diseño de experimentos para la hidrólisis del almidón de yuca por vía química Diseño Factorial Completo Se utiliza en la planeación de experimentos que produzcan una información confiable en el menor número de ensayos. El número de experimentos que se deben efectuar es 2n donde n es el número de variables independientes de dicho proceso. Determinación de las variables y sus niveles El primer paso a seguir es la escogencia de las variables que puedan ser controladas durante el proceso y sus niveles mas adecuados. Después de una búsqueda bibliográfica y ensayos preliminares se consideran las variables más influyentes como independientes. Los demás valores de las variables del proceso se mantienen constantes.

Los valores mas apropiados de las variables del proceso, se dan como un rango dentro del cual se determinan los niveles apropiados para el diseño. El nivel máximo se simboliza como (+) y el nivel mínimo como(-). La variable dependiente o respuesta se simboliza como Y. En el caso de que cada experimento se realiza como replica, la respuesta Y es el promedio de las dos respuestas, como se expone a continuación:

Y1 =

(Y11 + Y12 ) 2

Y11, Y12 = Respuesta del experimento y su replica. Y1 = Promedio de la respuesta. Para poder determinar la precisión de la experimentación se hace un análisis estadístico utilizando experimentos de control. Con los datos del análisis estadístico se plantea el modelo matemático que describe la significación de las variables en el proceso. Obtenidos los anteriores resultados se calcula los efectos simples, dobles y triples de las variables como se indica a continuación De acuerdo a los ensayos preliminares las variables seleccionadas (n) y sus niveles máximos (+) y mínimos (-) para la hidrólisis del almidón por vía química fueron:

Concentración de almidón (nivel superior 18%, nivel inferior 6%),

Concentración de Acido Clorhídrico (nivel superior 0.10N, nivel inferior 0.05, mediante buffers), y el Tiempo de Hidrólisis (nivel superior 30’y nivel inferior 10’).

Manteniendo constante la temperatura de 120°C, la presión de 15 psi y el volumen de hidrólisis de 800 mL. Se realizaron cuatro experimentos denominados de Control (simbolizados como “0” en la matriz del diseño) que no son más que cuatro replicas con valores de variable intermedio de a los valores superior e inferior como lo muestra la matriz del diseño con el fin de evaluar el límite de confiabilidad de los experimentos de la matriz de diseño factorial e identificar los efectos significativos de la acción de las variables en forma individual o conjunta.

El Porcentaje de Rendimiento de la Hidrólisis se obtiene mediante la relación del Azúcar Teóricamente esperado con respecto al valor leído experimentalmente de acuerdo a la siguiente relación:

360 g de glucosa Y=

* X gramos de almidón * 0.9 = Azúcar Teórico 342 g de almidón

Donde: • 360 g de glucosa corresponden al peso de dos moléculas de glucosa que se hidrolizan de una unidad monomérica (maltosa) del almidón. • 342 g peso de una unidad monomérica de almidón. • 0.9 es la fracción que indica que el 90% del almidón hidrolizan a azúcar, tomando un 10% en pérdida por almidón que no se alcanza a hidrolizar. Azúcar experimental % Rendimiento =

* 100

Azúcar teórica Tabla 1. Matriz de Diseño (2n ) para la Hidrólisis del Almidón de yuca

Concentración de

Concentración

Tiempo de

HCl

de Almidón

hidrólisis

[HCl]

[AL] en (%)

[t] en (minutos)

Experimento

% Rend

(N:mol/L) 1

0.05

6

10

70.4

2

0.10

6

10

69.8

3

0.05

18

10

71.4

4

0.10

18

10

70.5

5

0.05

6

30

84.3

6

0.10

6

30

88.2

7

0.05

18

30

77.5

8

0.10

18

30

90.2

9

0.075

12

20

84.8

10

0.075

12

20

85.2

11

0.075

12

20

84.3

12

0.075

12

20

83.6

C. DISEÑO DE EXPERIMENTOS PARA LA FERMENTACION ALCOHOLICA De acuerdo a referencias bibliograficas y ensayos preliminares las variables seleccionadas (n) y sus niveles máximos (+) y mínimos (-) para la fermentación de los hidrolizados de almidón a alcohol por parte del Saccharomices cerevisiae fueron: La Temperatura (nivel superior 37°C, nivel inferior 25°C), el pH (nivel superior 6.0, nivel inferior 4.0, mediante buffers), y la concentración de azúcares reductores totales (nivel superior 12%, nivel inferior 6%).

Manteniendo constante la

concentración del inoculo, flujo de aire, la concentración de sales, y el tiempo de la hidrólisis (96 horas).

El Porcentaje de Rendimiento de la Fermentación Alcohólica se obtiene mediante la relación entre la cantidad real de alcohol producido y la esperada teóricamente en base a la concentración de azúcar de la solución a fermentar. Se expresa en porcentaje entre el volumen de alcohol determinado y el volumen esperado teóricamente. Si se trata de X gramos de azúcar, maltosa, el volumen de alcohol esperado teóricamente será:

X g de maltosa Y=

184 g de alcohol *

100 mL de solución

500 *

360 g de maltosa

0.79

En donde: Y = mL de alcohol teórico, 184 es el peso de 4 moléculas de alcohol etílico que por fermentación se producen a partir de una molécula de maltosa o dos de glucosa, 360 es el peso de una molécula de maltosa equivalente a dos de glucosa, 0.79 es la densidad del etanol en g/mL, 500 es el volumen en mL medido para cada fermentación.

Alcohol experimental % Rendimiento =

* 100 Alcohol Teórico

TABLA 2. Matriz del Diseño con los experimentos de Control para la fermentación Alcohólica

Experimento

T

%AZU

pH

% Rend

1

25

6

4

76.2

2

37

6

4

82.2

3

25

12

4

84.7

4

37

12

4

86.4

5

25

6

6

78.2

6

37

6

6

84.2

7

25

12

6

85.2

8

37

12

6

89.1

9

32

9

5

89.3

10

32

9

5

87.4

11

32

9

5

88.6

12

32

9

5

86.8

D. BIOREACTOR DE TANQUE AGITADO Diseño y construcción del Biorreactor: El Biorreactor esta construido en acero inoxidable para asegurar la calidad en los procesos. Esta compuesto por un ventilador, un motor de 60 r.p.m., agitador con tres paletas ajustables y un cortaespuma, en la parte externa de la tapa están ubicados un manómetro, una válvula de seguridad, un termopozo fijo para termocupla removible (tipo J), una resistencia removible, cuatro bafles o cortacorrientes situados en las paredes del tanque interno, el dispersor de aire fijo en la base unido a una válvula de aguja, la chaqueta y tres válvulas de bola, a continuación se describen cada uno de ellos:

Accesorios del Biorreactor: Sistema de enfriamiento. Este sistema permite bajar las altas temperaturas generadas durante el proceso de esterilización y mantenerla luego bajo la acción de la resistencia (40W) a una temperatura determinada.

Este sistema de enfriamiento integra dos cajas elaboradas en aluminio, de las cuales una se ubica a nivel superior respecto a la otra.

Sistema de control. Se diseñó para llevar a cabo el proceso de esterilización, mantener la temperatura óptima durante el tiempo de desarrollo y crecimiento de la levadura en el Biorreactor, control del sistema de agitación, encendido y apagado de motobombas de acuerdo a los requerimientos.

Visualizador. Para seleccionar este dispositivo se procedió a buscar en el mercado un control

electrónico de temperatura específico para las condiciones de trabajo de la termocupla tipo J, la cual maneja un rango de temperatura de 0ºC a 400º C. El modelo XMTA – 93301 fue el que mejor se adaptó a las necesidades de funcionamiento del sistema de control del Biorreactor; el cual maneja un voltaje de trabajo de 110V y una frecuencia de 50/60Hz.

III. RESULTADOS

A. RESULTADOS DEL AISLAMIENTO DEL ALMIDON DE YUCA

Tabla 3. PORCENTAJES DE EXTRACCIÓN DE ALMIDON DE YUCA SEGÚN METODOLOGIA

323.7

PESO YUCA SIN CASCARA (g) 1956.9

PESO ALMIDON EXTRAIDO (g) 743.3

418.2

3005.2

1241.1

41.3

91.7

326.6

2519.8

1047.4

41.5

92.4

40.2

89.3

PESO YUCA INICIAL (g)

PESO CASCARA (g)

Muestra N°1:

% ALMIDON %RENDIMIENTO (% ALMIDON (BASE YUCA SIN TEORICO: 45%) CASCARA) 38.0 84.0

2280.6 Muestra N°2: 3423.4 Muestra N°3: 2876.4 VALORES PROMEDIOS 2860.1

356.2

2493.9

1010.6

TABLA 4. COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL ALMIDON EXTRAIDO

VALOR

MUESTRA ANALISIS

Muestra N°1

Muestra N°2

Muestra N°3

PROMEDIO

% HUMEDAD

6.4

6.1

5.7

6.06

% PROTEINA

0.22

0.31

0.24

0.25

% GRASA

0.10

0.12

0.14

0.12

% CENIZAS

0.20

0.21

0.16

0.19

% FIBRA

0.10

0.10

0.10

0.10

% CARBOHIDRATO

93.0

93.1

93.7

93.3

B. RESULTADOS DE LA HIDRÓLISIS DEL ALMIDON Tabla 5. Martiz del Diseño con los experimentos de Control

Experimento

Concentración de

Concentra-ción

Tiempo de

HCl

de Almidón

hidrólisis

[HCl]

[AL] en (%)

[t] en (minutos)

% Rend

(N:mol/L) 1

0.05

6

10

70.4

2

0.10

6

10

69.8

3

0.05

18

10

71.4

4

0.10

18

10

70.5

5

0.05

6

30

84.3

6

0.10

6

30

88.2

7

0.05

18

30

77.5

8

0.10

18

30

90.2

9

0.075

12

20

84.8

10

0.075

12

20

85.2

11

0.075

12

20

84.3

12

0.075

12

20

83.6

MODELO MATEMÁTICO DE LA HIDRÓLISIS DEL ALMIDON DE YUCA

% Re n dim iento = 77.78 + 4.52 X 1 + 14.5 X 3 + 2.2 X 1 X 2 + 3.77X1X3 + 2.12X1X2X3

X1 =

HCl − 0.075 0.025

X2 =

A − 12 6

X3 =

t − 20 10

C. RESULTADOS DE LA FERMENTACIÓN ALCOHOLICA

Experimento

T

%AZU

pH

% Rend

1

25

6

4

76.2

2

37

6

4

82.2

3

25

12

4

84.7

4

37

12

4

86.4

5

25

6

6

78.2

6

37

6

6

84.2

7

25

12

6

85.2

8

37

12

6

89.1

9

32

9

5

89.3

10

32

9

5

87.4

11

32

9

5

88.6

12

32

9

5

86.8

Modelo Matemático resultante de la fermentación Alcohólica

%Rendimiento = 83.2 + 4.4X1 + 6.1 X2 + 1.8 X3 - 1.6 X1 X2

X1 =

T − 32 7

X2 =

A − 9.0 5.0

X 3 = pH − 5

IV. DISCUSIÓN DE RESULTADOS Los resultados del análisis de la yuca raíz sin cáscara, nos muestra alto contenido de carbohidratos, diferentes a los carbohidratos de la fibra, representados por la ENN (Extracto No Nitrogenado = almidón, pectina y otros azúcares) que fue del orden del 86.5 en promedio, representado fundamentalmente por el porcentaje de almidón, para nuestros propósitos nos resulta significativamente importante, toda vez que, el ENN es de fácil fraccionamiento hidrolítico, generando así concentraciones altas de azúcares reductores totales con alto potencial de conversión a etanol por acción de las levaduras especializadas para tal efecto. -De acuerdo al Ministerio de Agricultura, Colombia en el 2001 produjo 2 millones de toneladas de yuca, en 180.000 Ha de cultivo, de las cuales se desperdician alrededor del 5%, lo que corresponde a 100.000 toneladas de yuca, con un valor potencial muy alto para producir etanol. -De acuerdo a los resultados obtenidos del análisis del contenido de almidón en la yuca que está del orden del 80%, se tienen entonces 80.000 tonelada de almidón que teóricamente se pueden obtener unos 240.000 metros cúbicos de etanol.

- Los porcentajes de almidón obtenidos, producto del aislamiento para tres muestras de Yuca, de acuerdo a la metodología descrita fueron de : 38.0, 41.3 y 41.5 para un promedio de 40.2%. El contenido total de

carbohidratos del almidón de yuca es del orden del 93%, lo que lo hace un excelente sustrato para la obtención de azúcares simples.

- El la hidrólisis del almidón de yuca se encontró un máximo rendimiento del 90.2% a las condiciones siguientes: Concentración de Ácido Clorhídrico 0.1 N, % de Almidón de 18% y un tiempo de Hidrólisis de 30 minutos, dichas condiciones son fáciles de reproducir.

- El modelo matemático que describe el proceso de hidrólisis contiene las variables con sus efectos individuales, dobles y triples. Demostrando la susceptibilidad del proceso a los cambio de los valores de variables. El efecto mayor es el relacionado con la acción conjunta entre las concentracines de almidón y ácido clorhídrico lo que significa que éstas es la variable de mayor significado.

- En la fermentación de los azúcares reductores por la Saccharomyce cerevisiae el mejor de los experimentos fué a las condiciones de pH 6.0, concentración de azúcares reductores totales de 12g/100mL y temperatura de 37°C con un rendimiento del 89.1% equivalente a 6.4% de etanol. En el modelo matemático resultan como variables significativas la temperatura, el pH y la concentración de azúcar, al igual con las variables conjuntas u efectos dobles de la temperatura y porcentaje de almidón.

- Los resultados de esta investigación demuestran claramente que es factible realizar la fermentación del almidón de Yuca en etanol a través de una previa hidrólisis ácida del almidón y de un organismo de fermentación del azúcar que no digiere el almidón como el Saccharomyces.

- En el diseño y puesta en marcha del Bioreactor de tanque agitado con variables de control cumplió, dentro de las limitaciones propias del diseño, controlar las más importantes variables del proceso como la Temperatura, tiempo de reacción, Velocidad de Agitación, concentración celular, flujo volumétrico, Productividad, Concentraciones de biomasa y sustrato en el equilibrio en las fases de hidrólisis y fermentación.

V. RECONOCIMIENTOS A las Ingenieras en Biorecursos; Liliana Corredor Silva, Marcela Forero Oses y Cristina Amparo Novoa Jaimes de la Universidad Manuela Beltrán, en el Diseño y Control electrónico del Bioreactor de tanque agitado.

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from

Starcha

by

Colcultures

of

Clostridium

thermosulfurogenes

and

Clostridium

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