TOLERANCIA DE Aspergillus niger y Penicillum chrysogenum A ALTAS CONCENTRACIONES DE METALES PESADOS Miguel Angel Gutiérrez Cerón, Enrique Sánchez Mora, Doris Peralta Mellado, Leandro Rodrigo González González Laboratorios de Investigación de Química y Bioquímica. Tecnológico de Estudios Superiores de Ecatepec. Av. Carlos Hank González s/n Esq. Valle del Mayo, Col. Valle de Anáhuac. Ecatepec, Edo. de México. Tel 7104560 ext. 307, Fax 7104560 ext. 305.

RESUMEN En el presente trabajo se determinó la tolerancia de Aspergillus y Penicillum a Al3+, Cu2+, Cr6+, Hg2+, Ni2+, Pb2+ y Zn2+, en medio sólido. El criterio que se tomó para determinar la toxicidad de los metales fue su efecto inhibitorio sobre la velocidad de crecimiento. En las cinéticas de crecimiento se observó un período de retardo que fue dependiente de la concentración y tipo de metal. Se determinó que los metales más tóxicos para los hongos son: Al3+, Hg2+ y Zn2+, y el metal que más toleran es el Pb2+. Se estableció una ecuación de velocidad de crecimiento en función de la concentración del metal presente en el medio ambiente, con ésta se pudo establecer que Aspergillus fue más tolerante a Al3+, Cu2+ y Zn2+, mientras que Penicillum tuvo una mayor tolerancia a Cr6+, Hg2+, Ni2+ y Pb2+. Además se logró adaptar ambas cepas para que toleraran concentraciones mayores de cobre y plomo.

INTRODUCCION Los organismos vivos necesitan de varios metales para sus procesos metabólicos, en el caso de los hongos metales como el Fe, Co, Mg, Mn, etc. actúan como cofactores de reacciones enzimáticas en diversas rutas metabólicas. La síntesis de metabolitos intermediarios y finales se ve afectada por la presencia y disposición de iones metálicos en el medio de cultivo. Los papeles metabólicos y fisiológicos de metales como el Hg, Cd, Pb, Ag y otros, aún no se han dilucidado completamente. A altas concentraciones los metales pesados resultan tóxicos para cualquier organismo (Gadd, 1978; Metcalf, 1979), y el interés sobre ellos se incrementa continuamente debido a la contaminación de aire, suelo y agua. Los hongos y levaduras son capaces secuestrar y acumular metales pesados, debido principalmente a dos procesos fundamentales: La absorción, que es la captura intracelular con sistemas de transporte activo y la adsorción, que es un proceso de unión pasiva a las estructuras externas como la pared celular, la cápsula y materiales extracelulares como polisacáridos. Diversos autores han propuesto varios mecanismos como los responsables de la adquisición de la tolerancia a metales pesados, entre los cuales se tienen: sistemas de oxido-reducción, atrapamiento en pared celular, impermeabilización de membranas, producción de agentes

quelantes o sideroforos, vacuolización, metilación o inducción genética de proteínas atrapadoras de metales, como las metalotioninas (Volesky, 1990; Mendoza-Amézquita et al., 1993; Cortés et al., 1993). De esto se desprende el uso de hongos y levaduras para el atrapamiento de metales pesados, ya que estos microorganismos tienen la capacidad de crecer en medios ambientes contaminados con altas concentraciones de metales, como los sitios contaminados por desechos mineros y efluentes de desecho de las industrias de galvanoplastia (Acosta et al., 1993). El presente trabajo tiene la finalidad de determinar el grado de tolerancia de Aspergillus niger y Penicillum chrysogenum a altas concentraciones de Al3+, Cu2+, Cr6+, Hg2+, Ni2+, Pb2+ y Zn2+.

MATERIAL Y METODOS Reactivos y Materiales. Todos los reactivos utilizados fueron grado analítico, los metales estudiados se adicionaron en forma de sales: Al(NO3 )3 , CuSO4 , K2Cr2 O7 , HgCl2 , Pb(NO3 )2 y ZnCl2 . En lo referente a los microorganismos utilizados en este trabajo, estos forman parte de la colección de cultivos microbianos del Tecnológico de Estudios Superiores de Ecatepec.

Estudio de resistencia a metales. El criterio que se tomó para determinar la toxicidad de los metales fue su efecto sobre la velocidad de crecimiento, tomando en cuenta que a mayor toxicidad menor velocidad de crecimiento. Así que el estudio se enfocó a determinar la concentración de cada metal a la cual se inhibe el crecimiento del microorganismo. Para determinar la tolerancia de Aspergillus niger y Penicillum chrysogenum a metales pesados se sembraron 2 x 104 esporas en el centro de una caja petri que contenía Agar de Czapeck Dox a pH de 4.5, adicionado con 10, 50, 100, 250, 500 y 1000 ppm de Al3+, Cu2+, Cr6+, Hg2+, Ni2+, Pb2+ y Zn2+. (cada metal por separado) y dejando en incubación 8 días a una temperatura de 27 o C. El crecimiento se determinó midiendo el diámetro de la colonia cada 24 horas y calculando la velocidad de crecimiento radial en mm/d.

Estudio de Adaptación. Las cepas de A. niger y P. chrysogenum fueron resembrada en 3 ocasiones en medios que contenían Agar de Czapeck Dox a pH de 4.5, adicionado con 500 ppm de Pb2+ y Cu2+ (cada metal por separado). Después de esto se determinó su tolerancia a mayores concentraciones de Cu2+ y Pb2+.

DISCUSION DE RESULTADOS En este trabajo se estudió el efecto de las altas concentraciones de diferentes metales pesados sobre el crecimiento micelial de A. niger y P. chrysogenum. La figura 1 muestra la cinética de crecimiento de una de las cepas en medios de cultivo contaminados con cobre (solo se muestra ésta gráfica como ejemplo de lo que sucedió con ambos microorganismos), en la cual se puede observar que el crecimiento de la cepa fue bifásica, es decir, se observó un período de retardo que fue dependiente de la concentración y tipo de metal. El hongo, en este período, sintetiza componentes que lo protegen contra la toxicidad del metal, tal como la síntesis intracelular de metalotioninas, proteínas que tienen una función en la desintoxicación, almacenamiento y regulación de la concentración interna del metal (Cortés et al., 1993; Volesky, 1995). El efecto de los metales sobre la velocidad de crecimiento de estas cepas se muestra en las figuras 2 a 8. De lo mostrado en las gráficas se desprende que los metales más tóxicos para los hongos son: Al3+, Hg2+ y Zn2+, y el metal que más toleran es el Pb2+.

14

80 70 60 50 40 30 20 10 0 0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Velocidad de Crecimiento (mm/d)

Crecimiento Radial (mm)

90

Tiempo (h)

12

10

8

6

4

2

0 0

10 ppm de Cu

50 ppm de Pb

100 ppm de Cu

250 ppm de Cu

200

400

500 ppm de Cu

600

800

1000

1200

1400

1600

ppm de Al Aspergillus Penicillum

14

14

12

12

Velocidad de Crecimiento (mm/d)

Velocidad de Crecimiento (mm/d)

Figura 1. Cinética de crecimiento radial de A. niger en medios de cultivo contaminados con Figura 2. Crecimiento de A. niger y P. Cu2+ chrysogenum en medios de cultivo con Al3+

10

8

6

4

2

0

10

8

6

4

2

0 0

200

400

600

800

1000

ppm de Cu Aspergillus

Penicillum

1200

1400

1600

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

ppm de Cr Aspergillus

Penicillum

Figura 3. Crecimiento de A. niger y P. Figura 4. Crecimiento de A. niger y P.

chrysogenum en medios de cultivo con Cr6+

14

14

12

12

Velocidad de Crecimiento (mm/d)

Velocidad de Crecimiento (mm/d)

chrysogenum en medios de cultivo con Cu2+

10

8

6

4

2

10

8

6

4

2

0

0 0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0

1600

200

400

600

ppm de Hg Aspergillus

800

1000

1200

1400

1600

ppn de Ni

Penicillum

Aspergillus

Penicillum

14

14

12

12

Velocidad de Crecimiento (mm/d)

Velocidad de Crecimiento (mm/d)

Figura 5. Crecimiento de A. niger y P. Figura 6. Crecimiento de A. niger y P. chrysogenum en medios de cultivo con Hg2+ chrysogenum en medios de cultivo con Ni2+

10

8

6

4

10

8

6

4

2

2 0 0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

0 0

200

400

600

800

1000

1200

1400

ppm de Zn

1600

Aspergillus Penicillum ppm de Pb

Aspergillus

Penicillum

Figura 7. Crecimiento de A. niger y P. Figura 8. Crecimiento de A. niger y P. chrysogenum en medios de cultivo con Pb2+ chrysogenum en medios de cultivo con Zn2+ De las figuras anteriores se nota que ambas cepas tienen una resistencia similar al efecto tóxico de los metales, ya que la concentración de cada metal a la cual se inhibe el crecimiento es la misma para los 2 microorganismos. Se ha observado que la velocidad de crecimiento decrece con la concentración del metal. Una forma de relacionar el efecto tóxico de los metales sobre la velocidad de crecimiento es mediante el uso de la siguiente expresión:

 C  = v SM 1 − M  → (1) C MI   n

v OBS VOBS = VSM = CM =

V Ln OBS  VSM

Velocidad de crecimiento observada. Velocidad de crecimiento sin presencia del metal. Concentración del metal.

  CM   = n * Ln  → (2)   C MI 

CMI = n=

Concentración del metal a la cual se inhibe el crecimiento celular. Coeficiente de envenenamiento, mientras mayor sea el valor de n mayor será el efecto inhibitorio sobre el crecimiento celular.

Para calcular el coeficiente (n) se utiliza la ecuación 2, la pendiente de la recta resultante de graficar Ln (VOBS/V SM) vs Ln (C M/CMI), es el coeficiente de envenenamiento (n). La tabla 1 muestra los valores de “n” para cada metal utilizado. Tabla 1. Coeficientes de envenenamiento calculados para cada microorganismo. Aspergillus niger Penicillum chrysogenum Metal n Metal n Aluminio 0.2467 Aluminio 7.2012 Cobre 2.4371 Cobre 3.8462 Cromo 6.0620 Cromo 3.8216 Mercurio 6.3625 Mercurio 2.3087 Níquel 1.7694 Níquel 0.8568 Plomo 2.3015 Plomo 1.4749 Zinc 0.7582 Zinc 3.1312 De acuerdo a los coeficientes de envenenamiento de la tabla anterior y a las figuras 2 a 8, se deduce que Aspergillus fue más tolerante a Al3+, Cu2+ y Zn2+, mientras que Penicillum tuvo una mayor tolerancia a Cr6+, Hg2+, Ni2+ y Pb2+ También se realizaron ensayos para conocer la posibilidad de adaptar las cepas para tolerar niveles más altos de Cu2+ y Pb2+. Para ello se creció a A. niger y P. chrysogenum en medios de cultivo que contenían 500 ppm de cada metal y después de 3 subcultivos en estas condiciones, se analizó la velocidad de crecimiento radial de la colonia en medios que contenían concentraciones mayores de cada metal. En la Figura 9 y 10 se comparan las velocidades de crecimiento radial, después de 8 días de incubación, en medios contaminados con cobre y plomo. De esta manera se establece que las cepas “adaptadas” fueron capaces de crecer en concentraciones mayores de Cu2+ y Pb2+. Encontrándose que Aspergillus creció en 1000 ppm de Cu2+ y 2000 ppm de Pb2+, mientras que Penicillum fue capaz de crecer en 1500 ppm de Cu2+ y 2000 ppm de Pb2+. Estos resultados indican que las cepas adquirieron rápidamente la capacidad de tolerar altas concentraciones de metales a pesar de que nunca había sido crecida en su presencia.

9

7

8

Velocidad de Crecimiento (mm/d)

Velocidad de Crecimiento (mm/d)

8

6 5 4 3 2 1

7 6 5 4 3 2 1

0 0

500

1000

1500

ppm de Cu Aspergillus

2000

0 0

500

1000

1500

2000

ppm de Pb (mg/l) Aspergillus Penicillum

Penicillum

Figura 9. Velocidad de crecimiento (mm/d) de Figura 10. Velocidad de crecimiento (mm/h) A. niger y P. chrysogenum adaptado, en medios de A. niger y P. chrysogenum adaptado, en de cultivo con Cu2+ medios de cultivo con Pb2+

CONCLUSIONES Durante el desarrollo de este trabajo se observó que los metales más tóxicos para los hongos son: Al3+, Hg2+ y Zn2+, y el metal que más toleran es el Pb2+. Una vez calculados los coeficientes de envenenamiento para cada metal se pudo establecer que Aspergillus fue más tolerante a Al3+, Cu2+ y Zn2+, mientras que Penicillum tuvo una mayor tolerancia a Cr6+, Hg2+, Ni2+ y Pb2+. Además se estableció una relación matemática que nos relaciona la concentración de cada metal y la velocidad de crecimiento de los microorganismos. Conjuntamente se logró la adaptación de ambas cepas a concentraciones mayores de Cu2+ y Pb2+, con lo cuál se puede establecer que Aspergillus niger y Penicillum chrysogenum son buenos modelos para evaluar las respuestas adaptativas de los microorganismos a un ambiente contaminado por metales pesados, ya que presenta tolerancia a altas concentraciones de metales pesados y una adaptación fisiológica muy rápida al cobre y plomo. Este comportamiento indica que su supervivencia depende de sus adaptaciones intrínsecas y desde luego a las propiedades fisicoquímicas del medio ambiente. Posiblemente esta adaptación sea a través de mecanismos genéticos, activados o inducidos por metales, que controlan determinados eventos bioquímicos. Si logramos entender la adaptación de este tipo de microorganismos sería más fácil utilizarlos para diseñar sistemas de captación de metales.

BIBLIOGRAFIA Acosta I., García G., Torre M. E., Moctezuma M. G. (1993) Aislamiento de Hongos Contaminantes Ambientales Resistentes a Metales Pesados y su Potencial Uso como Bioadsorbentes. In: Memorias del V Congreso Nacional de Biotecnología. No. 1 y 2. México. Pp: AM-1 a AM-7. Cortés C., Obregón A., Caracheo S., Vázquez G., Amézquita F., Hernández M., Gutiérrez F., Cano C., Sosa L. (1993) Mecanismos de Resistencia a Metales Pesados en Trichoderma spp. In: Memorias del V Congreso Nacional de Biotecnología. No. 1 y 2. México. Pp: AM-214 a AM-223. Gadd, G. M. and Griffths, A. J. (1978) Microorganisms and Heavy Metal Toxicity. Microbial Ecol. 4:303-317. Mendoza-Amézquita E., Mendoza, O. D., Caracheo A. S., Obregón H. A., López-Alba P. L., Gutiérrez C. F., Sosa L. L. E. (1993) Aislamiento de Cepas de Hongos Tolerantes a Metales a partir de Desperdicios Mineros. In: Memorias del V Congreso Nacional de Biotecnología. No. 1 y 2. México. Pp: AM-185 a AM-188. Metcalf and Eddy (1979) Waste Engineering: Treatment, Disposal, Reuse. Mc Graw Hill. USA. Pp:56-58, 102-103, 753. Volesky, B. (1990) Biosorption by Fungal Biomass. In: Biosorption of Heavy Metals. B. Volesky (Ed). CRC Press. 139-172.