Implementación de mejores soluciones para el control microbiano en processos petrolíferos Geert M. van der Kraan1, Diana Jocksch2, Monica Canalizo-Hernandez1, Bei Yin1, Terry Williams1 & Philip A. Keene3

Este Documento Técnico fue preparado para ser presentado en Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012, celebrado del 17 al 20 de septiembre de 2012 en Río de Janeiro. Este Documento Técnico fue seleccionado para su presentación por el Comité Técnico del evento según la información contenida en el documento final presentado por el/los autor/es. Los organizadores no deben traducir ni corregir los trabajos presentados. El material, tal como se presenta, no manifiesta necesariamente la opinión del Brazilian Petroleum, Gas and Biofuels Institute o de sus miembros o representantes. Los autores dan su consentimiento para la publicación de este Documento Técnico en las Actas del Rio Oil & Gas Expo and Conference.

RESUMEN En este trabajo se proponen soluciones para el control microbiano como parte del manejo del ciclo del agua industrial en la industria del petróleo a través de dos casos de estudio. Cada caso trata las diferentes fases del desarrollo de mejores soluciones de control microbiano dentro del manejo del agua. En el primer caso se aborda la aplicación de métodos microbiológicos tradicionales y de técnicas biológicas moleculares (a saber: pirosecuenciación con qPCR y 16S rADN). Se realizó un relevamiento de un sitio de producción de petróleo y una planta de separación petróleo-agua y luego se generó un mapa detallado que muestra las cuestiones microbiológicas detectadas en el sistema. Se demostró que las instalaciones del sitio de producción están gravemente contaminadas con reductores de sulfato que cubren, en diversas locaciones analizadas, hasta el 60% de la población total. Se identificaron locaciones de alta preocupación, con cantidades de células 1000 veces superiores a las del agua producida en los pozos. Según este análisis, se propuso un régimen optimizado de dosis de biocidas. El segundo caso de estudio trata el desarrollo de una mezcla biocida personalizada específicamente diseñada para yacimientos de gas de esquisto en los EE. UU. Se enriquecieron los primeros organismos del yacimiento específico, Se formularon nuevas mezclas THPS y se optimizaron según su eficacia contra estas cepas aisladas. Las mezclas también se optimizaron para garantizar una buena estabilidad y una buena compatibilidad con otras composiciones químicas utilizadas. Las nuevas mezclas mostraron una mejor eficacia en concentraciones menores de ingredientes activos, tornando así esta solución personalizada más sostenible desde un punto de vista ambiental.

1. Introducción Nuestra sociedad actual, en su esencia misma, depende fuertemente de los combustibles fósiles. Como ejemplo, el 40% de la demanda global de energía proviene solo del petróleo y el 90% de todos los químicos producidos provienen de recursos fósiles (Bakas & Creemers, 2007). Como se torna cada vez más difícil extraer los recursos fósiles del subsuelo, la industria del petróleo está aplicando técnicas secundarias y terciarias de recuperación de petróleo, predominantemente la inundación con agua (de mar) para sacar más petróleo del reservorio (en promedio un 10-15% de petróleo extra). Al introducir agua, se introducen también importantes aspectos referidos al crecimiento no deseado de microorganismos (Pedersen, 2000). Con frecuencia encontramos los microorganismos reductores de sulfatos y sus efectos perjudiciales como la acidificación del reservorio y la corrosión microbiana (MIC) (Pope et al, 1991) causada por la producción de H2S como producto final de su metabolismo (Muzyer & Stams, 2008) (Nilsen et al, 1996). Pero los efectos adversos como el taponamiento de los filtros y el reservorio pueden estar causados por la acumulación no deseada de microorganismos que crecen en las superficies (biopelículas) (Steward & Fogler, 2002) (Khazipov et. al, 1993). Todos estos procesos se tratan bajo el término "ensuciamiento biogénico". Los yacimientos de petróleo inundados con agua y los ecosistemas modificados asociados brindan entornos adecuados para que prosperen los reductores de sulfatos; con entornos reductores (sin oxígeno) con una gran cantidad de sulfato introducido a través del

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Especialista senior en I&D - The Dow Chemical Company Técnico en I&D - The Dow Chemical Company 3 Líder de aplicaciones para el cliente - The Dow Chemical Company 2

agua de mar, y una abundante fuente de carbono orgánico en forma de hidrocarburos. Las cuestiones referidas al crecimiento no deseado en el agua no se limitan a los yacimientos de petróleo, sino que también ocurren en la recuperación de gas de esquisto en donde se aplican vastas cantidades de agua, en particular en la fractura de un pozo (Kerr, 2010). En estos sistemas también se informan a menudo problemas con el crecimiento de microorganismos. Con el boom del gas de esquisto que se dio casi de la noche a la mañana en los EE. UU., la aplicación creciente de la inundación con agua para la recuperación secundaria de petróleo y las leyes más estrictas sobre el uso y eliminación del agua industrial, hay una creciente necesidad en la industria del petróleo de mejorar la administración del ciclo de agua y el control microbiano. El ensuciamiento biogénico del agua industrial es un elemento clave que debe ser tratado en el manejo del ciclo del agua. En la industria del petróleo es práctica común realizar pruebas de rutina en diversas fuentes de agua como el agua producida, el agua de inyección, el agua derivada de tanques de almacenamiento, etc. Esto a menudo ocurre a través de métodos basados en cultivos tradicionales (CBM, por sus siglas en inglés), que indican que se agrega una cantidad mínima de agua a un caldo rico en nutrientes específicos para el grupo de microorganismos en cuestión. El crecimiento observado es una indicación de la presencia de microorganismos. Durante estas pruebas tradicionales, también llamadas "incubaciones", a menudo se realizan series de dilución y recuentos en placa que brindan cierto nivel de cuantificación del número de microorganismos presentes. En muchos casos, esta es también la manera en que se prueban las soluciones de control microbiano. Existen dos protocolos principales que se reconocen y aplican internacionalmente (Estándar NACE TM0194-2004-21224). La eficacia de los tratamientos biocidas se evalúa en diferentes rangos de concentraciones de los activos y por medio de diluciones en serie y recuentos en placa. En general los tratamientos se prueban en una combinación estandarizada predefinida de organismos, a menudo cepas de laboratorio. Los métodos basados en cultivos, si bien brindan información acerca de la gravedad del bio ensuciamiento de un ecosistema modificado, tienen limitaciones. Solo puede cultivarse una fracción de microorganismos (0,1-1%) en entornos de laboratorio (Staley & Konopka, 1985) y a menudo el caldo de enriquecimiento aplicado para los cultivos selecciona qué microorganismos se desarrollan de modo que los resultados de las pruebas basadas en cultivos pueden no predecir con exactitud el desempeño de los tratamientos en el ecosistema del campo. Con el surgimiento de las herramientas de biología molecular en la industria del petróleo (técnicas para caracterizar el contenido genético de las células, a saber ADN y ARN), contamos con una nueva caja de herramientas para poder determinar mejor qué microorganismos están creciendo en los sistemas industriales y para evaluar mejor los efectos perjudiciales de estos microbios (Singh et al, 2009). Esta comprensión más profunda también ayuda a desarrollar nuevos tratamientos de control microbiano ya que se pueden hacer análisis de las especies relevantes en el ecosistema y con respecto a equivalentes de laboratorio más relevantes. Estos métodos también permiten una evaluación de campo de las soluciones de control microbiano nuevas, cuando se las aplica en sistemas industriales reales. El monitoreo de los procesos biológicos ("biomonitoreo") en el relevamiento tradicional de un sistema industrial como primer paso, permite entender mejor el crecimiento en el sistema e identifica las áreas del sistema con alta prioridad de tratamiento de control microbiano. Esto permite aplicar un mejor tratamiento y un mejor régimen de dosificación. El desarrollo de la mejor solución de control microbiano ajustada a las condiciones del sitio y las necesidades del usuario final son el segundo paso. Esto incluye la prueba y el desarrollo de diversos tratamientos biocidas, incluidas las combinaciones de biocidas, relevantes para el ecosistema. Por lo general, esto requiere programas amplios de selección de biocidas. En este trabajo se discuten, a través de dos casos de estudio, métodos destinados a mejorar las soluciones de control microbiano aplicadas. El caso de estudio 1 discute un estudio completo de todas las corrientes de agua en un yacimiento de petróleo offshore y sus instalaciones de separación de agua petróleo. Incluyó un análisis geoquímico y la aplicación de herramientas tradicionales y de biología molecular. El caso de estudio 2 discute el desarrollo de mezclas de THPS nuevas con patente pendiente para un yacimiento de gas de esquisto en los EE. UU. Se observó el crecimiento no deseado de microbios. Se realizó un análisis completo para preparar una solución personalizada, para lo cual se aislaron microorganismos de las diferentes corrientes de agua. La eficacia de las mezclas personalizadas se probó luego en estas cepas de tipo salvaje aisladas. Se realizó un relevamiento de "diversidad" similar al del caso de estudio1, pero no se discute en este documento.

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2. Caso de estudio 1 - Materiales y métodos

Sitios de producción-S1

Líneas entrantes-S2

Pozos de inyección-S6

Separador agua petróleo-S4 Tanque de depósito de petróleo

Tubería de retroalimentación-S3

Tanque de almacenamiento de agua

Pileta-S5

Figura 1: Representación - Visión general del sitio en el caso de estudio 1 2.1 Descripción de los sitios de producción y de las instalaciones de separación petróleo agua e inyección El petróleo se produce en diferentes sitios a diversas distancias del sitio de separación. Los pozos de producción e inyección están ubicados a lo largo de los sitios. No se ha advertido acidificación de los pozos producidos. La emulsión de agua en petróleo producida tiene un alto corte de agua (90%) y se transporta a un sitio de separación de petróleo agua a través de cañerías. Aquí la parte más grande de la fase de petróleo se separa en un separador y el petróleo se transporta a un tanque de almacenamiento de petróleo. La fase de agua se bombea a un tanque de almacenamiento de agua que desde aquí suministra el agua para las bombas inyectoras. Entre el tanque de almacenamiento y la pileta de agua hay un lazo de retroalimentación. Desde el tanque de almacenamiento de petróleo se bombea el agua restante de nuevo hacia el separador. Esta cantidad de agua es baja y esta cañería opera 2 horas por día. Pueden verse los detalles en la Figura 1. 2.2 Procedimiento y preparación del muestreo (descripción de los puntos de muestra) Se recolectó primero el agua producida en diversos sitios un recipiente de 10 litros. Para el análisis basado en el cultivo tradicional se agregó 1 ml de agua a tres tipos de medio diferentes (9 ml). Dos tipos de medios seleccionados para enriquecer bacterias reductoras de sulfato (SRB por sus siglas en inglés), un tipo de medio seleccionado para bacterias productos de ácido (APB, por sus siglas en inglés). Para el análisis biológico molecular el agua se filtró en filtros estériles tomando las células de entornos diferentes. Después de la filtración del agua, los filtros que retuvieron las células se colocaron en tubos y se transportaron a 0 °C al laboratorio en donde se los sometió a la extracción de ADN y otros análisis. 2.3 Análisis geoquímico Las temperaturas de las aguas se determinaron con un termómetro digital. El pH se determinó con tiras de prueba estándar. Se utilizaron kits de prueba estándar para determinar los niveles de sulfuros y hierros ferrosos libres (Fe 2+) en las diferentes aguas según las instrucciones del fabricante. 2.4 Métodos basados en técnicas de cultivo (CBM, por sus siglas en inglés) Las botellas anaeróbicas inoculadas con los diferentes medios se enviaron en hielo al laboratorio. Las botellas fueron incubadas anaeróbicamente durante 5 días a 25 °C. Se observó la turbidez a lo largo del tiempo (como control de presencia/ausencia). 3

2.5 Extracción de ADN y control de calidad del ADN extraído de las células El ADN de las células se obtuvo aplicando el kit de aislamiento de ADN PowerWater ™ Pro (MO BIO Laboratories) según las instrucciones del fabricante. (Filtración - Sección 2.2) Para verificar la presencia y cantidad de ADN genómico, se aplicaron dos métodos: electroforesis y cuantificación en gel de agarosa utilizando espectroscopia de absorción (con un espectrómetro NanoDrop). Se colocaron 5 µl de soluciones con el ADN genómico purificado en un 1,5% w/v de gel de agarosa y se las procesó durante 30 minutos a 90 voltios. El gel se colocó en un tampón 1X TAE durante la corrida y luego se tiñó con tinta de ADN. Se colocó 1 µl de ADN genómico en una espectrofotómetro Nanodrop. Se controló la absorción a 230, 260 y 280 nm. Las relaciones de las longitudes de onda indican la calidad y la cantidad de ADN. 2.6 Programa qPCR y secuenciación de pyrotags de rADN 16S Para verificar si el ADN puede utilizarse para la secuenciación de Pyrotags de rADN 16S y para tener una estimación gruesa de las cantidades de células relativas en las diferentes aguas, se realizaron ensayos de qPCR relativos. El primer par utilizado para esta amplificación fue 341f/907rM y apuntó al gen rADN de bacterias. La amplificación se realizó en un instrumento Biorad Icycler IQ5 rtPCR. La mezcla contenía 10,0 μl de supermezcla IQ Sybrgreen (BIO RAD), 9,1 μl de agua libre de ADN-ARN (Qiagen), 0,16 μl de BSA, 0,15 μl de cada iniciador (Bac341F, 50 μM / Bac907rM(rA+rC) (Schäfer & Muyzer, 2001), 50 μM – concentración madre y plantilla de 0,4 μl. Luego de esta verificación el ADN genómico fue enviado a los Research & Testing Laboratories (Texas, EE. UU.) para una secuenciación de Pyrotag de rADN 16S. El gen de rADN 16S se utiliza ampliamente en ecología microbiana para caracterizar estructuras y dinámicas comunitarias. Se analizaron 3000 secuencias por ambiente aplicando el paquete de software PyroTagger (Kunin & Hugenholtz, 2010). Todos los resultados obtenidos por secuenciación se han ajustado a una longitud de alta calidad utilizable de 250 pares base. Esta selección no incluyó Archaea esta vez.

3 Caso de estudio 2 - Materiales y métodos 3.1 Muestreo y métodos basados en cultivo Las aguas de las diferentes fuentes se tomaron de un yacimiento de gas de esquisto estadounidense con botellas estériles de 1 litro. Para el análisis basado en cultivo tradicional se agregó 1 ml de agua a dos tipos de medios diferentes (9 ml) para enriquecer bacterias reductoras de sulfato (SRB) y bacterias productoras de ácido (APB) La muestra del agua de laguna se tomó justo por debajo de la superficie a aproximadamente medio metro del borde. Se muestreó el barro de perforación tomando muestras en botellas similares de los puertos de corrientes laterales. Los detalles se muestran en la tabla 1. Se evaluó el contenido microbiológico de todas las muestras de agua. Estas incubaciones se aplicaron para estimar los números de células. Además se realizó un análisis ATP de todas las muestras. Se compraron botellas de incubación de 12 ml (9 ml de medio) de venta comercial compradas a proveedores locales. Luego de la inoculación con 1 ml de agua, la botellas se incubaron a 30 ˚C. Se registraron los recuentos de células Log 10 ml-1 para SRB y APB luego de 28 días de incubación. Este largo período de 28 días se debió a cuestiones logísticas de transporte de la muestra.

Tabla 1: Ubicaciones de las muestras y temperaturas respectivas del agua. Ubicación Temperatura 1) Agua de laguna (T < 40 ˚C) 2) Agua de foso (T < 40 ˚C) 3) Agua mezclada (contiene agua de laguna/agua de foso y agua producida) (T = 40 ˚C) 4) Agua mezclada tratada* (T = 40 ˚C) 5) Agua de reflujo (retorno luego de inyección inicial) (T = 70 ˚C) 6) Agua producida (T = 70 ˚C) 7) Barro de perforación (T = 60 ˚C) 8) Barro de perforación con base de petróleo *Esta agua se trató durante las pruebas de laboratorio y por lo tanto se analizó como tal. Análisis ATP de todas las corrientes de agua Se realizó un análisis ATP a las aguas listadas aplicando el método y el kit utilizados de LuminUltra Technologies, Ltd. con los kits llamados Quench-Gone™ según las instrucciones de los fabricantes. En breve, se pasaron muestras de 10 ml a través de un filtro y los organismos atrapados se lisaron para liberar el ATP celular. Los niveles de ATP presente se midieron utilizando un ensayo de luciferina-luciferasa con un luminómetro Kikkoman C-110 Lumitester™. Se determinaron los niveles de ATP a partir de una curva de respuesta a la dosis calibrada internamente con un patrón de ATP nuevo. Los valores se informaron como picogramas de ATP por ml de muestra. (La cantidad de ATP presente puede utilizarse para comparar ambientes relativos). 4

Verificación relativa de endosporas Se aplicó un protocolo de tinción con verde de malaquita en combinación con recuentos microscópicos para verificar la presencia de endosporas en las aguas. Se utilizó el kit Scheffer and Fulton Spore Stain (Fluka) para teñir las esporas siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizó un microscopio Olympus BX 51 con capacidad fluorescente para la observación visual de las esporas y una evaluación relativa de la presencia de esporas. Programa de análisis de eficacia de biocidas Se enriquecieron muestras ambientales para analizar diferentes programas de control microbiano. Se fijó como criterio para un buen control microbiano la reducción del recuento de células por debajo de 102 ml-1 En ambos grupos se probó la eficacia biocida. En todos los casos se aplicó una concentración biocida activa total de 150 ppm w/v. Los biocidas se analizaron solos y en combinaciones sinérgicas. En las pruebas de biocidas independientes, se aplicaron 200 ppm w/v de activos y se utilizó un criterio de aprobación "más blando" indicando que eran aceptables niveles de células mayores. Los biocidas analizados incluyeron el glutaraldehído, compuestos de amonio cuaternario, dazomet y THPS (sulfato de tetrakis hidroximetil fosfonio).

4. Caso de estudio 1 - Resultados 4.1 Composición química de las distintas aguas La salinidad del agua producida es diferente en cada pozo, pero en general se la califica como salobre. La temperatura promedio del agua del interior del pozo varía entre 65 y 85 °C. En los diferentes sitios de producción se midieron los niveles de sulfuro y hierro en las aguas así como sus pH. El agua que llega al sitio de separación petróleo-agua muestra diferencias con el agua producida. Ambas líneas tienen diferentes temperaturas (caliente y frío) de 41 °C y 10 °C. Esta diferencia está causada por la distancia variable hasta el sitio de separación. La línea "fría" entrante pasa a través de un intercambiador de calor para aumentar la temperatura levemente hasta por encima de 40 ˚C. El pH era aún neutro pero había una caracterización distintiva de sulfuro en el agua, alrededor de 3 mg L-1. El agua en el separador petróleo-agua está a alrededor de 43 °C, pero es levemente más ácida que el agua entrante que mantiene un pH de alrededor de 6 a 6,5, y no se detectó sulfuro. A diferencia del agua producida y del agua entrante, en esta se detectó algo de Fe2+ El agua del fondo del tanque de almacenamiento de petróleo y la tubería de retroalimentación tienen otra caracterización, con una temperatura de 37 °C y un nivel de hierro libre de alrededor de 10 mg L -1, el pH es de nuevo neutro. El agua aeróbica en la pileta retuvo una temperatura de 32°C y un pH levemente ácido de 5,8. No se detectaron ni sulfuro ni hierro libre. El agua de inyección retuvo una temperatura de 24,8 ˚C y un pH de 6,5, se detectó un nivel de sulfuro de más de 10 g L1 . Para una presentación detallada consulte la Tabla 2. 4.2 Resultados de métodos basados en cultivos tradicionales Se realizaron incubaciones de SRB & APB (CBM) de diferentes fuentes de agua en el sistema. Se demuestra que el agua de muchas locaciones presentó crecimiento de microorganismos (turbidez) que indica que las cantidades de células en el agua son altas (Tabla 2). Se muestra claramente que en todos los ambientes analizados, los microorganismos están prosperando, algunas diferencias entre los resultados indican la sensibilidad de estos métodos con respecto a la composición del medio y la detección de los microorganismos.

Tabla 2: Resultados de métodos basados en cultivos y análisis geoquímicos realizados APB (com.)

T (˚C)

H2S

Fe2+

pH

S1 S2

SRB (i) SRB (com.) Crecimiento detectado: Sí Sí

-

44 43,6

0 2

3 0

7 7

S3 S4 S5 S5

Sí Sí -

Sí Sí Sí Sí

37,5 43 32,3 24,8

0 0 0 10

10 3 0 0

7 6.5 5.8 6,5-7

Descripción locación

nr^.

Agua producida (5Años) Línea entrante Tanque de almacenamiento de petróleo Tanque separador P/A Agua de pileta Agua de inyección

Sí -

Línea tanque post 5

sedimentador * Sí Sí 47,7 0 0 7 Agua producida (35Años) * Sí 24,3 / / / ^ = número de muestra tomado para el análisis de biología molecular; * = no se filtró agua- sin análisis de biología molecular - Indica que no hay turbidez en las incubaciones, / indica que no hay datos disponibles. (com. = fuente comercial) 4.3 Calidad del ADN y resultados de qPCR relativa Para evaluar la calidad y las cantidades del ADN extraído se aplicaron dos métodos diferentes. 1) Se cargó ADN de alto peso molecular (HMW) en un gel de agarosa, 2) el ADN se colocó en un espectrómetro NanoDrop. Se realizó una qPCR que dio las cantidades relativas de células. En las reacciones qPCR se utilizaron diluciones 1/10 para evaluar si en efecto no había discrepancias entre las diluciones (datos no mostrados). Se obtuvo una señal positiva de PCR de todos los entornos, que indicó que todas las muestras eran aptas para la pirosecuenciación. Se mostró que se halló una diferencia de 3 o 4 ciclos entre las diluciones de 1 y 10 veces que indicó una calidad de ADN y condiciones de PCR aceptables. A partir de los resultados de qPCR puede hacerse una comparación relativa de las cantidades de ADN, y se puede obtener así una estimación de multitudes de cantidades de células que toman la cantidad más baja como punto de referencia (S1-S6). Los resultados se muestran en la tabla 3. Se tomaron en cuenta las diferencias en las cantidades de agua filtrada para el cálculo de la comparación relativa. Puede verse claramente que el sistema se enriquece para la cantidad de microorganismos a medida que la fase de agua migra por las tuberías. La cañería de retroalimentación desde la fase agua del tanque de almacenamiento de petróleo al separador de petróleo-agua en especial tiene un alto nivel de células (S3). El agua entrante de los pozos de producción y el agua saliente que llegan a los pozos de inyección son similares en cuanto a niveles de células. El agua producida del pozo joven y la pileta muestran niveles más bajos al ser comparadas con el sistema de separación de petróleo agua. Se eligió la muestra S1 como entorno comparativo ya que las cantidades de células aumentan desde ese punto, lo cual indica que el sistema se enriquece para bacterias cuando se lo compara con el agua producida que asciende.

Tabla 3: resultados qPCR relativa Nombre de la muestra S1 S2 S3 S4 S5 S6

Valores Ct (1/10)

27/20 16/20 16/19 16/20 21/25 16/20

Ciclos menos que S1 (agua producida) 11 11 11 6 11

Diferencia factor Más que S1

Diferencia factor Más de S2

1 102 103 102 1 102

0,01 1 10 1 0,1 1

4.4 Estructuras comunitarias (pirosecuenciación del rADN 16S) La presentación de todos los resultados de pirosecuenciación excede el alcance de este trabajo, ya que se han identificado más de 17000 clústeres diferentes en los 6 ambientes estudiados. En cambio, se provee un resumen de los entornos importantes en la Tabla 4, que muestra la distribución de las especies dominantes y los hallazgos principales. Los datos se presentan como porcentajes de la población total. A continuación aparece un resumen de los principales hallazgos. Pueden hacerse interesantes observaciones a partir de la Tabla 4. El agua de producción que viene desde el pozo de producción joven está dominada por especies que no pueden encontrarse en ningún otro lugar en el resto del sistema y parecen cumplir una función sin significado (columna gris claro de S1). Las líneas calientes entrantes enriquecen para una especie específica Desulfocaldus (Duncan et al, 2010) que también se enriquece en la tubería de inyección, en el tanque estas especies también están presentes pero a un nivel inferior con respecto a la comunidad total (fila gris Desulfocaldus). El agua en la pileta muestra Gammaproteobacteria, que es común en las aguas salinas levemente aeróbicas. En las siguientes secciones, se dará más detalle de los diferentes entornos. Como ejemplo del nivel detalle que puede entregar una pirosecuenciación, los resultados del agua entrante se presentan en la Figura 2.

Tabla 4: Secuencias de especies más abundantes (% de secuencias totales) presentes en las muestras. Nombre del pariente más cercano Cepa Bacillus sp. LAMI 010 Cepa Desulfocaldus sp. Hobo Cepa Desulfovibrio

S1

S2

S3

S4

S5

S6

42,08

2,68

64,2

0,53 0,01

46,73

Identidad 100% 100% 100%

6

desulfuricans G20 Similar a gammaproteobacterium Cepa Desulfotomaculum solfataricum V21 Similar a clostridium Cepa Desulfovibrio sp. M1 Cepa Desulfacinum subterraneum 101 Similares a Desulfotomaculum Similares a carboxidibrachium Cepas bacteroides sp. SA-7 Cepas aisladas 52651 Pseudomonas balearica st101

0,06 44,56

0,14

4,7

33,99

0,04

100%

52,86

0,1

0,05

100%

0,01

0,09

0,07

0,22

8,86

0,15

12,88

100% 100% 98,23%

18,6

0,14

0,07

99,56%

0,74

0,08 0,05 0,66

0,12 11,59 0,01

0,01 0,09 0,05 10,7

0,17 0,07

100% 100% 100% 100%

4.5 Descripción detallada de las comunidades halladas en las diferentes fuentes de agua En el agua producida (S1) de uno de los pozos se halló que dos especies cubrían casi el 80% de la comunidad, Desulfotomaculum solfataricum y una especie sin cultivar. La primera especie se describe en la bibliografía como un microorganismo con forma de bastón que puede formar esporas que pueden usar una amplia variedad de fuentes de carbono. Usa sulfato, tiosulfato y sulfito como aceptadores de electrones (Goorissen et al, 2003). El crecimiento óptimo del organismo es a 60 °C con un límite superior de 65 °C. El rango de pH de este organismo es 6,4-7,9. Puede crecer en agua con una salinidad máxima de 1,5 g L-1. Esto encaja con la descripción del ecosistema (Tabla 2). El agua entrante (S2) de las líneas de producción en el sitio de separación ha alcanzado para entonces una temperatura de 41 °C y muestra una regeneración de la comunidad bacteriana cuando se la compara con la comunidad del agua de producción. El agua que llega al sitio de separación está dominada ahora por un miembro Desulfocaldus, que ocupa más del 40% de la comunidad. La cantidad de células ha aumentado unas 10 veces en comparación con el agua producida en el pozo. Además, se detectaron trazas de sulfuro que indican una población activamente productora de H 2S. Está claro que la especie Desulfocaldus está jugando un papel dominante en la acidificación del sistema. Esta especie Desulfocaldus también ha sido detectada en los separadores de las instalaciones de Alaskan North Slope Oil (T = 50 ˚C). La cañería de retroalimentación (S3) opera solo durante 2 horas por día y sirve para bombear el retorno del agua restante de la fase de petróleo separada al tanque del separador. Mantiene una temperatura de 37,5 °C. De la comparación relativa de cantidades de células en las muestras ambientales directas surgió la cantidad de células más alta. También se descubrió que la comunidad del fondo del tanque de almacenamiento de petróleo es más diversa, lo cual indica una alta actividad microbiana. El pH es de alrededor de 7 y se detectó una cantidad de sustancias de Fe2+ libre que indican un proceso MIC que potencialmente también explica la baja cantidad de H 2S. Resulta interesante el hecho de que la especie Desulfocaldus (que se detecta en el agua entrante) a bajos niveles persiste aquí. Está claro que muchas secuencias detectadas tienen parientes más cercanos asociados con aguas de la degradación de petróleo y aguas asociadas con azufre. El agua extraída del tanque separador de agua petróleo (S4) es una combinación de todas las aguas de las diferentes locaciones de producción. La temperatura promedio es 43 °C. El agua es similar al agua de la línea caliente entrante según las especies. Se encuentra una gran dominancia de la misma especie Desulfocaldus, que cubre casi el 65% de la comunidad. Soprendentemente, no se detectó ningún sulfuro en el agua, sin embargo la presencia de Fe2+ libre puede explicar esta ausencia. El agua en la pileta (S5) está totalmente expuesta al aire exterior y por lo tanto es completamente aeróbica y representa un ecosistema diferente. La temperatura en la pileta es inferior a la del sistema (32 °C cuando se la midió) pero esto puede cambiar con las estaciones. La comunidad contiene especies que son típicas de agua salobre aeróbica y son de menor relevancia. El agua que llega a los pozos inyectores (S6) muestra gran similitud con el agua que llega de las líneas entrantes. Desde el punto de vista del ecosistema son en efecto similares. Al final de la tubería, la temperatura ha caído a 25 °C y cae gradualmente cuando se aleja del tanque de agua. El agua de inyección enriquece nuevamente la especie Desulfocaldus que abarca casi el 50% de la comunidad. Los niveles de sulfuro detectados fueron altos tal como se halló en la línea fría entrante con valores por encima de 10 mg L1 . El hecho de que el agua inyectada contenga tales niveles altos de sulfuro puede ser un problema para el reservorio.

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Figura 2: Resultados de pirosecuenciación del agua entrante (estructura comunitaria)

5. Caso de estudio 2 - Resultados 5.1 Análisis microbiológico de las fuentes de agua (Incubaciones y observaciones SRB/APB) Todas las aguas presentaron importante contaminación en todos los enriquecimientos. Los recuentos de células estuvieron entre 104 y 107 células tanto para SRB como para APB. También se demostró que las aguas de laguna y foso contenían niveles significativos de levaduras y hongos (datos no mostrados). Los recuentos de endosporas, especialmente en el reflujo y el agua producida fueron elevados en comparación con las otras fuentes de agua. El reflujo y el agua producida presentaron la mayor tolerancia a la temperatura de los microorganismos en las diversas muestras analizadas. Esto es de esperar ya que estos entornos están sujetos rangos de temperatura in situ mayores Los detalles se muestran en la tabla 5. 5.2 Análisis ATP de todas las fuentes de agua A partir del análisis ATP, resultó claro que el agua de foso mostraba la mayor cantidad de ATP de 7000 pg ml -1, seguida por la laguna y las aguas mezcladas y el reflujo (cada una alrededor de 2000-2500 pg ml-1). Una observación clara fue que el contenido de ATP del agua tratada (laboratorio) fue significativamente inferior, por ejemplo a alrededor de 70 pg ml-1 después de 6 horas de tratamiento. El análisis de ATP de los barros de perforación no pudo obtenerse debido a la interferencia del barro con la medición de ATP. Puede verse en la Tabla 5. 5.3 Análisis de biocidas y combinaciones para un desempeño optimizado Con el fin de brindar una solución sostenible al problema del bioensuciamiento, se probaron análisis de biocidas y combinaciones en cepas de entornos enriquecidos aisladas del yacimiento de gas de esquisto. Resultan de particular interés las evaluaciones del reflujo y del agua producida. Tal como se muestra en la Tabla 6, puede verse que las combinaciones de biocidas nuevas propuestas controlan mejor que los biocidas utilizados tradicionalmente, durante un periodo más prolongado. En este caso, el criterio de aprobación se fijó en la reducción de los recuentos viables a menos de 102 células por ml-1. En el análisis, el nivel combinado de activos fue 150 ppm w/v. En comparación con las combinaciones analizadas, la aplicación de biocidas simples, incluso cuando se los dosifica en concentraciones mayores, a saber 200 ppm activos y con un criterio de aprobación más blando (reducción de 3 log por ml en recuentos de células) no resultó como el control. Pueden verse los detalles en la Tabla 7.

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Tabla 5: Cantidad de células y análisis ATP de diferentes fuentes de agua. Fuente

Recuentos de células (a la décima potencia) SRB APB Agua de laguna 3 5 Agua de foso 6,5 6,5 Agua mezclada 5,5 7 Agua mezclada (tratada) 3 3,5 Agua de reflujo 4 5 Agua producida 3,5 3 Barro de perforación 4 7 Barro de perforación con base de petróleo 5 7

Picograma ATP promedio ml-1

Endosporas

2200 7000 2600 (70 (6 horas) – 15 (24 horas) 2300 200 *

baja baja baja baja alta alta *

*

*

Tabla 6*: Análisis de combinación de biocidas realizado sobre enriquecimientos de agua de reflujo Combinaciones aplicadas

Glutaraldehído/ Sal de amonio cuaternario** Dazomet/ Sal de amonio cuaternario** Glutaraldehído/Activo nuevo 1 THPS/Activo nuevo 1 Gultaraldehído/Activo nuevo 2 THPS/Activo nuevo 2

eficacia 24 horas SRB APB

Eficacia 48 horas SRB APB

Eficacia 7 días SRB APB

×







×

×

× ×  × 

× ×  × 

    

×    

×    

×    

* Una x indica: no pasó el criterio establecido recuento de células por debajo de 102 ml-1, una  indica; pasó este criterio **La cuaternaria aplicada en este caso es propiedad del operador del yacimiento y por lo tanto no puede revelarse. Tabla 7*: Análisis de biocidas (independientes) realizado sobre enriquecimientos de agua de reflujo Biocidas aplicados

eficacia 24 horas SRB APB

Eficacia 48 horas SRB APB

Eficacia 7 días SRB APB

Glutaraldehído Dazomet THPS

× × 

× × ×

× × ×

× × 

× × ×

× × ×

* Una x indica: no pasó el criterio establecido de reducción 3 log de células ml-1, un  indica: pasó este criterio

6. Discusión La realización de un análisis de biología molecular en profundidad, además de los análisis tradicionales basados en cultivos, brindó información que resulta clave para la aplicación del concepto de "biomonitoreo". Hemos obtenido información que quizás podría no obtenerse utilizando solo las pruebas tradicionales. Una observación científica interesante es que, en efecto, las especies se relacionan con las propiedades del ecosistema recuperadas mediante un análisis geoquímico simple (salinidad, T, pH, sulfuro y niveles de hierro) El agua de producción que llega retiene especies asociadas con el ecosistema del pozo y hemos descubierto que no cumplen ninguna función significativa en el resto del sistema. Posteriormente (en el Caso 1), la especie para la que se enriquece la tubería de agua caliente es la cepa Desulfocaldus que aparece como dominante en todo el sistema. La línea caliente entrante y la tubería de agua de inyección son similares en ese aspecto, y en especial el agua de inyección presenta altos niveles de sulfuro que indican una alta actividad microbiana. El punto de mayor inquietud es el agua de retroalimentación desde la cañería entre el 9

separador de petróleo-agua y el tanque de almacenamiento de petróleo, esta agua contenía los mayores niveles y diversidad microbianos. El análisis biológico molecular mostró que esta zona es la zona probable de infección de todo el sistema industrial. La Figura 3 resume los resultados biológicos moleculares. A cada uno de los ambientes analizados se le asignó un nivel de inquietud basado en el análisis. Se elaboraron recomendaciones con el fin de mejorar el manejo del ciclo del agua. Se propuso agregar un nuevo punto de adición de biocida en el tanque de agua ya que el agua de inyección era una inquietud importante debido a los altos niveles de H 2S. Se propuso un destino diferente para el agua del fondo del tanque de almacenamiento de petróleo. La situación actual es que como rutina (a diario) el agua del fondo se transfiere del tanque de petróleo al tanque de asentamiento. Los datos surgidos de los análisis muestran que este agua sin tratar contiene SRB y APB. El tanque de petróleo puede considerarse una fuente continua de infecciones hacia el tanque de asentamiento y el sistema. El agua transferida o el agua del fondo del tanque deben ser tratadas para eliminar este fuente clave de contaminación no tratada hacia el sistema. Como alternativa se propuso alimentar el agua directamente desde el agua de la pileta en donde dominan las condiciones aeróbicas de modo que los niveles de SRB y APB se reducirían en gran medida en el sistema. Con estos cambios podemos ajustar el tratamiento y monitorear el agua de inyección para reducir el H2S biótico sospechado y los niveles de SRB/APB. La eficacia de estas medidas puede determinarse mediante el monitoreo rutinario del sistema aplicando las mismas metodologías de análisis. Comunidad diversa y altos niveles de células Esta cañería es una fuente de infección para el sistema y es una gran preocupación (T=37.5 ˚C, pH 7, 10 mg L-1 Fe2+)

Desulfocaldus, altos niveles de H2S (T=24.8 ˚C, pH 6.5, H2S, 30 mg L-1) Esta cañería es de gran preocupación.

Tanto el agua producida como el agua de la pileta son de baja preocupación con respecto a las especies y las cantidades de células.

El área alrededor del separador de A/P genera algo de preocupación (T=43 ˚C, pH 6.57; 3 mg L-1 Fe2+).

Figura 2: Áreas de preocupación: el verde indica baja, el rojo indica alta. La selección correcta de biocidas para un yacimiento y una corriente de agua en particular es un paso clave, pero representa un desafío en cada ambiente diferente. En el estudio del yacimiento de gas de esquisto en EE. UU., se halló que las aguas del interior del pozo también estaban muy contaminadas con microorganismos. Las combinaciones de biocidas analizadas se desempeñan potencialmente mejor que el programa de control microbiano aplicado. Se halló que estas aguas contienen microorganismos termofílicos resistentes, incluyendo altos niveles de formadores de esporas. Aquí el tratamiento resulta esencial para reducir e inhibir la germinación de las endosporas. Esta investigación indica que el tratamiento actual es ineficaz y que es necesario un tratamiento eficaz de los fluidos de perforación con productos de control microbiano enmendados. Además el bajo volumen de los fluidos reduce al mínimo la cantidad de conservante necesario. Para la inyección de fluido las condiciones son diferentes. En este caso deben aplicarse una temperatura estable y un control microbiano de larga duración ya que el agua permanecerá en la formación durante un período prolongado. A partir de los datos de monitoreo de campo, que no incluyeron un programa de tratamiento biocida, se detectó una contaminación microbiana pesada (niveles de SRB & APB significativamente por encima de los criterios de 102 células ml-1). Los estudios de laboratorio brindaron varias soluciones para poner nuevamente bajo control el sistema. Estas soluciones incluyeron innovadoras combinaciones de biocidas sostenibles que ofrecen control eficaz en concentraciones activas menores. Las combinaciones de biocidas propuestas aún pueden optimizarse con respecto a las proporciones y los regímenes de dosificación. Se realizará un análisis pPCR para considerar mejor la cantidad total de células con respecto a los grupos. Se realizará un ensayo de campo cuando se hayan optimizado los parámetros anteriores. Los programas de biomonitoreo (no mostrados) indicaron cuáles de las fuentes de agua necesitaron el tratamiento más sólido. 10

7. Conclusiones Los resultados presentados en el caso de estudio 1 brindaron una prueba conceptual del motivo por el cual la caja de herramientas puede aplicarse para el desarrollo del manejo del ciclo de agua en la industria del petróleo. Permite una mejor comprensión de las dinámicas de la comunidad y de los procesos metabólicos en los sistemas industriales y puede ayudar a identificar los lugares de alta preocupación, y pueden hacerse los cambios de locación y tipo de agregado de biocida para mejorar el control microbiano. Además, la biología molecular puede ayudar en la identificación temprana de potenciales problemas, brindando así la posibilidad de diseñar una estrategia proactiva de soluciones para el control microbiano. Por lo general, cuando los problemas están en una etapa temprana, se requiere menos biocida para recuperar el control eficaz, lo que permite contar con programas de tratamiento incluso más sostenible. En ambos escenarios se aplican con más eficacia las soluciones de control microbiano. En el segundo caso, se requiere un monitoreo de rutina del sistema. Los resultados presentados en el caso de estudio 2 muestran que el desarrollo de combinaciones biocidas específicas ajustadas al ecosistema son un siguiente paso valioso que requiere un protocolo de análisis amplio que tenga en cuenta diversos parámetros, teniendo como parámetros clave la eficacia y la compatibilidad con el agua y con otros productos químicos agregados a ese agua. En el segundo caso de estudio se desarrollaron nuevas combinaciones de biocidas basados en THPS como activo principal, específicamente para yacimientos de gas de esquisto en la zona de los EE. UU. Este caso de estudio mostró claramente que un programa integrado de manejo del ciclo de vida del agua debe incluir un programa de control microbiano dedicado, basado en los parámetros ambientales particulares de un yacimiento de gas de esquisto. El análisis microbiológico requiere un laboratorio especializado que puede imitar las condiciones ambientales específicas del cliente. Esto es esencial para desarrollar una solución de control microbiano eficaz. Ambos casos de estudio demostraron que un buen programa de monitoreo de los sitios industriales en combinación con el desarrollo de tratamientos biocidas adaptados al sitio y a las condiciones del usuario final, puede llevar en el futuro cercano al desarrollo de un programa de control microbiano más eficaz y sostenible.

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