INMUNOLOGÍA APLICADA NOTAS DE CLASE

INMUNODEFICIENCIAS (ID)

Las ID primarias se deben a defectos intrínsecos en las células del sistema inmune y son por regla general de origen genético. Las ID secundarias derivan de factores extrínsecos como fármacos, radiaciones, desnutrición y malnutrición, infecciones, deficiencias de etapas fisiológicas,etc. Síntomas y señales Los siguientes síntomas son una clara advertencia y deben conducir a sospechar de la presencia de un defecto en la defensa contra la infección: Infecciones frecuentes o largas Infecciones por bacterias que normalmente no causan enfermedades Envenenamiento de la sangre (septicemia) Infecciones repetidas de oído, piel y senos nasales Ataques de neumonía repetidos Crecimiento pobre y/o diarrea crónica Infecciones en lugares inusuales Cansancio en aumento Los síntomas y señales de inmunodeficiencia (ID) dependen de la localización del defecto en el sistema inmune. Las inmunodeficiencias de origen congénito se denominan ID primarias y se diferencian de las adquiridas o secundarias. Los diferentes tipos de inmunodeficiencia: -Falta de Anticuerpos( inmunodeficiencia humoral) La falta de anticuerpos en la sangre es el tipo de inmunodeficiencia más común. Esta condición se llama hipogammaglobulinemia. La concentración de una o de varias clases de inmunoglobulinas, se reduce o falta. Son típicas las infecciones bacterianas frecuentes. -Deficiencia de células T (inmunodeficiencia celular) Existen muchas formas de deficiencia de células T con diferentes grados de severidad. Hay frecuentes infecciones graves con virus, hongos y otros microorganismos. -Inmunodeficiencia combinada (inmunodeficiencia humoral y celular) En estas condiciones, hay una diferencia de producción de anticuerpos y de células T -Deficiencia del sistema de Complemento Se han descrito pacientes con deficiencias selectivas de la mayoría de los factores de C´. Estos pacientes son muy susceptibles a enfermedades por meningococos y autoinmunes. -Deficiencia del sistema fagocítico 1

Hay muchas variedades de deficiencia de fagocítos. Evaluación de pacientes que se sospecha presentan una inmunodeficiencia Selección e identificación de pacientes con inmunodeficiencia -Es vital el diagnóstico temprano y el tratamiento de los pacientes. Muchas ID primarias y secundarias, son tratables. El tratamiento a tiempo puede evitar el daño devastador que puede ocurrir. Así, cuando se presentan infecciones recurrentes que no responden a antibióticos o que sean causadas por agentes infecciosos inusuales u oportunistas, se debe considerar la posibilidad de ID, primaria o secundaria. Los pacientes con ID se pueden dividir en siete grandes grupos: a) niños de familias que tienen ID hereditaria: hacer diagnóstico prenatal b) niños cuyos hermanos tienen una ID posible o establecida c) niños cuyas enfermedades están asociadas a ID d) niños que no progresan, presentan infecciones persistentes con baja virulencia u oportunistas, erupciones inusuales o diarrea persistente e)pacientes con infecciones recurrentes o persistentes que no responden a terapia de antibióticos, infecciones pulmonares y pacientes con obstrucción pulmonar crónica f) pacientes con infecciones de piel recurrentes, abcesos, periodontitis o cicatrización de heridas anormal g) pacientes con infecciones por Neisseria recurrentes o con lupus eritematoso diseminado. -El escrutinio necesario para las ID requiere de la evaluación de la habilidad del paciente para desarrollar y expresar funciones inmunológicas de células B, T, o combinadas. Se deben investigar los procesos de ampliación biológica (complemento, citocinas, etc.) y los mecanismos efectores básicos (fagocitosis y la respuesta inflamatoria). Es esencial que las pruebas clínicas y de laboratorio seleccionadas para la evaluación inmunológica sean ampliamente informativas, confiables y con una buena relación costo-beneficio. La mayor parte de estos desórdenes pueden evaluarse con bajo costo si se eligen las pruebas de escrutinio, adecuadas. - La biometría hemática y la velocidad de sedimentación son las pruebas más indicadas. Una velocidad de sedimentación normal indica que no hay infección bacteriana crónica. -Si los neutrófilos son normales, se eliminan las neutropenias congénitas y adquiridas y defectos graves de la quimiotaxis. -Si la cuenta de linfocitos es normal, el paciente no debe tener un defecto grave de células T. Sin embargo es importante recordar que las cuentas de linfocitos normales, son muy altas en la infancia. -Si la cuenta de plaquetas es normal se excluye el síndrome de Wiscott-Aldrich.

2

Más de 2 infecciones severas o neumonía / año Más de 8 otitis / año Neumonía por germen no habitual

Sí

¿Existe historia familiar de inmunodeficiencia?

No ¿Hay otra explicación asma, fibrosis quística, rinitis alérgica, VIH o anomalía estructural pulmonar?

Sí

Tratar y reevaluar

No

Detección de inmunodeficiencias Biometría hemática completa Cuantificación de linfocitos B y T

Cuadro 1 Evaluación de la inmunidad en una consulta respiratoria.

Células B -Tomando primero las células B, se emplea un sistema de escrutinio para determinar la presencia y título de anticuerpos a eritrocitos tipo A y B, p.ej. isoaglutininas, ya que esta prueba mide principalmente IgM. -La determinación de anticuerpos a los toxoides de difteria o tétanos, antes y dos semanas después de un refuerzo a dichos toxoides, ayuda a evaluar la capacidad de formar anticuerpos, IgG. -Para evaluar la habilidad de respuesta a antígenos polisacarídicos, los anticuerpos anti-neumococo pueden medirse antes y tres semanas después de una inmunización con una vacuna polivalente de polisacárido de neumococo. --Los títulos de anticuerpos IgG e IgM normales, no excluyen la deficiencia selectiva de IgA, la hipogammaglobulinemia selectiva de la infancia, o los estados de pérdida de proteínas. La deficiencia de IgA se excluye cuantificando IgA.

3

Si la IgA es normal, se desechan los tipos habituales de hipogammaglobulinemia, ya que la IgA es muy baja o no detectable en esas condiciones. Si la IgA es baja, se deben cuantificar IgG e IgM. Células T -Para evaluar la función de células T, se utiliza la prueba cutánea con cándida. Los adultos y niños mayores a 6 años, se deben evaluar intradérmicamente con 0.1 mL, de una dilución 1:1000 de un extracto potente de Candida albicans. Si la prueba es negativa a las 24, 48 y 72 horas, se debe probar una dilución de 1:100. Si la prueba es positiva definida por un eritema e induración de 10 mm o más a las 48 horas, virtualmente todos los defectos primarios de T, se excluyen. ID Fagocitosis Los pacientes con disfunción fagocítica se evaluan por: a) reducción de nitroazul de tetrazolio semicuantitativa, después de exponer las células del paciente a estímulos fagocíticos b) medida directa de la formación del radical oxígeno después de estimular las células del paciente con diclorofluorina y midiendo la producción de oxígeno. c) midiendo la respuesta fagocítica por quimio-luminiscencia, después de un estímulo similar al anterior d) cuantificando la capacidad de las células de ingerir y matar microorganismos catalasa positiva, como estafilococos La integridad de la respuesta inflamatoria puede evaluarse con las técnicas de la ventana de Rebuck El análisis in vitro de la respuesta inflamatoria se puede medir estudiando la quimiotaxis, la quimiocinesis y la capacidad de producir y liberar citocinas inflamatorias.

INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS CELULAS B SÍNDROME DE BRUTON La hipogammaglobulinemia ligada a X (HX) (Síndrome de Bruton) Es el prototipo de la deficiencia de anticuerpos. Tiene una presentación clínica más o menos homogénea, característica que llevó a pensar en un defecto monogenético sin embargo se ha visto que resulta de mutaciones en señales de transducción citoplasmáticas. Esto ha ampliado la descripción del fenotipo y llevado a la conclusión de que es más común de lo originalmente pensado. Los niños afectados presentan en la infancia o niñez temprana, infecciones piógenas recurrentes, conjuntivitis, otitis media, sinusitis neumonía y pioderma. Estas infecciones son debidas principalmente a Haemophilus influenzae y a Streptococcus neumoniae. Aunque se controlan con antibióticos estas infecciones llevan a destrucción anatómica en especial de los pulmones y a enfermedad de obstrucción crónica. Los niños con HX están en riesgo de adquirir poliomielitis paralítica como consecuencia de la vacuna de virus vivos. Se infestan con Giardia lamblia lo que lleva a diarrea crónica, pérdida de peso y enteropatía con pérdida de proteínas. Las amígdalas son pequeñas y los 4

ganglios linfáticos impalpables. Hay una disminución en los linfocitos B circulantes (5/1000 linfocitos); no hay células plasmáticas, ni centros germinales. El suero de estos pacientes tiene menos de 100 mg de IgG por decilitro e IgM e IgA no detectables. El número y función de linfocitos T no se afecta. Se generan células B tempranas en la médula ósea sin embargo maduran a un ritmo muy lento, el gen BTK (Bruton,tirosin-cinasa) es miembro de la familia Tec de las proteinas plasmáticas de tirosin cinasas. Esta cinasa es necesaria para el crecimiento de precursores de la celula B y para su desarrollo a celulas B maduras, motivo por el cual, no hay celulas B circulantes en los pacientes con hipogammaglobulinemia de Bruton. Se encuentran células pre B en la médula ósea. El defecto genético se localiza en el brazo largo del cromosoma X (Xq21.3-22). En las acarreadoras femeninas, el cromosoma defectuoso se lioniza durante la proliferación de linfocitos B. El fenotipo clínico puede ser muy variable aun en la misma familia. Desde la identificación del defecto cromosómico se ha visto que el fenotipo clínico es más amplio que el concebido originalmente. CELULAS T SINDOME DE DI GEORGE (Hipoplasia tímica) El DiGeorge pertenece a una serie de síndromes continuos genéticos que afectan múltiples órganos durante la embriogénesis temprana. Resulta de la dismorfogénesis de la tercera y cuarta bolsas faríngeas, en la embriogénesis temprana, conducente a hipoplasia o aplasia del timo y de las glándulas paratiroides. Otras estructuras que se forman en la misma época también se afectan resultando en anormalidades de los grandes vasos (arco aórtico derecho), atresia esofágica, úvula bífida, enfermedad cardiaca congénita (defectos atriales y ventriculares), pliegue antimongoloide en los ojos, hipoplasia mandibular y orejas bajas .Casi todos los pacientes (8090%) con esta anomalía tienen deleciones (a menudo microdeleciones) del cromosoma 22q11-ter. Hay otros síndromes con deleciones localizados en la misma área. Debido a que involucran deleciones del 22q11-ter se han llamado CATCH22 con un acrónimo de los órganos involucrados: cardiac abnormalities, abnormal facies, thymic hypoplasia, cleft palate, hypocalcemia. Otras anomalías Di George pueden derivar de alcoholismo fetal y de la diabetes materna. En los niños afectados se presentan clínicamente: tetania, y/o falla cardiaca. Los rasgos faciales pueden sugerir que se sospeche de la enfermedad. El diagnóstico es a menudo derivado de la presencia de ataques hipocalcémicos en el período neonatal. Las concentraciones de inmunoglobulinas de suero suelen ser normales. INMUNODEFICIENCIA SEVERA COMBINADA (SCID) Esta ID es de las más graves y generalmente presenta un desenlace fatal. Tiene variadas causas genéticas aunque el fenotipo es bastante uniforme. Generalmente los niños afectados se enferman antes de los tres meses de edad con erupciones excesivas en el área del pañal, por monilia. Pueden tener diarrea y una tos persistente debida a neumonía intersticial por P. carinii. Aunque el 5

crecimiento puede parecer normal en un principio, éste y el peso decaen y hay fallo en el desarrollo. Algunas veces se presenta una erupcion, un rash morbiliforme que se vuelve hiperpigmentado y se debe al paso de linfocitos maternos que montan una reacción injerto vs hospedero. La muerte es rápida después de infecciones por varicela, herpes, adenovirus o citomegalovirus. La inmunodeficiencia grave combinada ligada a X se debe a la deficiencia de la cadena gamma común del receptor de IL-2, uno de los varios defectos que conducen al SCID –X1 y es la forma mas común (46%). El gen anormal se mapeó en la región Xq13 y después se identificó como el que codifica la cadena gamma q es comun a los receptores de superficie para 5 interleucinas (interleucinas 2, 4, 7, 9 y 15). El hallazgo de que el gen mutado no permite la señalización normal de varios receptores de citocinas, explica como las celulas T, las B y las NK pueden ser afectadas por una sola mutación. SCID autosómico recesivo (defecto metabólico) Otro síndrome del SCID aparece en 15% de los pacientes ( T-, B-, NK-) es autosómico recesivo. Los pacientes con deficiencia de adenosino-deaminasa, tienen las mismas características clínicas que aquellos con otras formas de SCID pero además tienen displasia condro-ósea, que se pone de manifiesto por la presencia de anormalidades esqueléticas múltiples en el examen radiográfico. Los niños con esta inmunodeficiencia, tienen una linfopenia mas aguda que en otros tipos de SCID..Esta deficiencia afecta principalmenta las células T que están ausentes. Este defecto se debe a mutaciones en el gen del cromosoma 20q13.2q13.11 y produce una acumulación marcada, de adenosina, 2’-desoxiadenosina y 2’-O-metiladenosina. La acumulación de estos metabolitos tóxicos, directa o indirectamente conduce a la apoptosis de linfocitos. Se han mejorado notablemente (100%) los pacientes con terapia de reposición de la enzima, con inyecciones subcutáneas semanales de adenosino-deaminasa modificada en polietilén-glicol. Sin embargo la inmuno-competencia resultante, es menos completa de la lograda con transplante de médula òsea. La terapia génica todavía no es satisfactoria para esta condición. Conclusiones Las ID primarias son raras pero muy importantes por varias razones: Primero un índice elevado de sospecha y diagnóstico temprano, puede conducir a un tratamiento que salve vidas o produzca una mejoría importante en la calidad de vida. Segundo, la apreciación de la naturaleza genética de un defecto en las defensas del hospedero hace posible el consejo a familias y el diagnóstico de acarreadoras y el prenatal. Finalmente, la larga y ascendiente lista de los defectos genéticos humanos en las vías inmunológicas, proporciona una herramienta importante para entender la inmuno-regulación. Se han comprobado las causas genéticas de muchas enfermedades por inmunodeficiencia heredadas, en los últimos años. Estas enfermedades proporcionan un marco de referencia en el cual, se pueden ir añadiendo los descubrimientos adicionales y los hallazgos de genes de 6

enfermedades por la continuación el progreso acelerado en la inmunología y en la genética moleculares. Por lo anterior, es necesario conocer las causas moleculares de las inmunodeficiencias, para que se pueda proporcionar el consejo genético apropiado, la asesoría prenatal y cuando se perfeccione, la terapia génica necesaria para corregir el defecto.

INMUNODEFICIENCIAS SECUNDARIAS Las inmunodeficiencias secundarias o adquiridas son las más frecuentes. Estas pueden ser debidas principalmente a los siguientes factores: Malignidad Infecciones Traumatismos Cirugías Quemaduras Fisiológicas Asociadas a fármacos Terapias Desórdenes metabólicos Desnutrición y malnutrición

Desnutrición De estas causas elegimos la desnutrición por ser un problema ampliamente extendido y desatendido en poblaciones de países en vías de desarrollo (léanse artículos de Arnoldo Kraus (Jornada 97,98,99) Está actualmente comprobado que la nutrición es un determinante importante en la respuesta inmune. Los datos epidemiológicos y clínicos sugieren que las deficiencias nutricionales alteran la inmunocompetencia y aumentan el riesgo de infecciones. La higiene personal y las condiciones sanitarias deficientes, la sobrepoblación, el agua y los alimentos contaminados y la desnutrición y la ignorancia acerca de la alimentación, contribuyen a la susceptibilidad a infecciones. Se ha comprobado que la inmunidad alterada es un factor crítico en las enfermedades asociadas a la desnutrición. Este concepto se aplica no sólo a niños del tercer mundo, sino a grupos de todas las edades en todas las poblaciones de la tierra, incluyendo a los ancianos, a los que presentan desórdenes de la alimentación y a pacientes con padecimientos debilitantes. -La atrofia linfoide es un rasgo dramático en la desnutrición proteico-energética (PEM). Se reduce el tamaño y peso del timo. En PEM la mayor parte de los mecanismos están alterados. Las respuestas en las pruebas cutáneas de hipersensibilidad tardía a antígenos están marcadamente deprimidas. Es común

7

que se presente una anergia total a una batería de antígenos. Estos cambios se dan también en deficiencias nutricionales moderadas. Las reacciones en piel se restituyen después de una terapia nutricional apropiada, durante varias semanas y aun meses. Hay también una reducción en linfocitos T maduros y diferenciados; hay reducción en la actividad del factor tímico sérico. Se aumenta la actividad de la desoxinucleotidil transferasa en leucocitos. La proporción de linfocitos T cooperadores (helper) reconocidos por la presencia de CD4, disminuye marcadamente. También hay una reducción moderada en el número de células citotóxicas CD8+. Así el cociente de CD4 a CD8 es significativamente menor que en sujetos control bien alimentados (eutróficos). La proliferación de linfocitos y la síntesis de DNA se reducen. -Las respuestas de anticuerpos séricos generalmente permanecen intactas en PEM, especialmente para antígenos que no son T dependientes. Inclusive en poblaciones de niños desnutridos que sufren muchas infecciones, los anticuerpos se elevan sobre los que presentan los eutróficos. Sin embargo, la afinidad de los anticuerpos decrece en los pacientes desnutridos. Esto puede explicar el porqué se encuentran complejos antígeno-anticuerpo en estos pacientes. Las concentraciones de IgA secretoria disminuyen después de la inmunización con vacunas virales. Hay una reducción selectiva de IgA secretoria con un aumento compensatorio de IgM en secreciones. -La fagocitosis también está afectada en PEM, La actividad de la mayor parte de los componentes del complemento disminuye. La activación metabólica y la destrucción intracelular de bacterias disminuye. En suma, decrecen el índice fagocítico y la reducción del nitro-azul de tetrazolio por los fagocítos. -Finalmente, se ha demostrado que la producción de varias citocinas, que incluyen IL-1,IL-2 e interferón gamma, disminuye notablemente en PEM. Más aun, la desnutrición altera la habilidad de responder apropiadamente a las citocinas. Micronutrimentos Diversos elementos traza(huella) y vitaminas, tienen un papel esencial en las vías metabólicas clave y en las funciones del sistema inmune. Las deficiencias de micronutrimentos son raras excepto del Fe, la vitamina A y el Zn. La desnutrición y la malnutrición generalmente forman un síndrome, compuesto de múltiples deficiencias nutricionales. En estos aspectos ya se han delineado varios conceptos básicos: 1)las alteraciones de la respuesta se presentan inmediatamente después de la reducción en la ingesta del micronutrimento. 2)la extensión del daño inmunológico depende del tipo de micronutrimento involucrado, sus interacciones con otros nutrientes esenciales, la gravedad de la deficiencia, la presencia de infecciones concomitantes y la edad del sujeto. 3) las anormalidades inmunológicas predicen el resultado, particularmente el riesgo de infección y la mortalidad 4) en muchos micronutrimento la ingesta excesiva está asociada a respuestas inmunes alteradas 5)las pruebas de inmuno-competencia son útiles en la evaluación de los requerimientos fisiológicos y en la determinación de límites inferiores y superiores idóneos, de ingesta de micronutrimentos 8

Zinc Se elige el Zn como un ejemplo para ilustrar estos conceptos. La deficiencia de Zn tanto heredada como adquirida, se asocia con atrofia linfoide, respuestas de hipersensibilidad tardía cutánea disminuidas, rechazo de injertos tardío y menor actividad de la hormona tímica. Los pacientes con acrodermatitis enteropática (un síndrome con carencia de zinc) tienen respuesta linfocítica a fitohemaglutinina dañada e hipersensibilidad cutánea tardía, reducida. En modelos animales se confirman estos hechos y se observa disminución de células formadoras de anticuerpos en bazo, actividad defectuosa en células T citototóxicas y fagocitosis disminuída. Probablemente el zinc estimule la NADPH oxidasa como cofactor de la fosfolipasa A2 o fosfolipasa C. El zinc puede estabilizar al ácido araquidónico contra la oxidación de los complejos de Fe. Los complejos de zinc pueden reaccionar con el oxígeno generando productos muy tóxicos para los patógenos ingeridos. La cicatrización de heridas está dañada en la deficiencia de Zn. Esta deficiencia promueve el establecimiento de nemátodos y altera las características de su expulsión del intestino. -Una ingesta ligeramente aumentada de Zn se asocia a mejor respuesta inmune. En nuestro laboratorio, se ha observado en ratones durante la gestación y la lactancia, una respuesta de proliferación de T aumentada. También se incrementa la fagocitosis y en el metabolismo de monocitos macrófagos. El Zn in vitro actúa como mitógeno importante para linfocitos T. Se ha demostrado la elevación de IL2, IL-12 y TNF alfa, con el aumento de la ingesta de Zn. También se ha observado una respuesta incrementada en la resistencia a parásitos como Taenia crassiceps, acompañada de una reducción al 50% de la carga parasitaria en modelos murinos. En los infantes, en los niños y en los ancianos se observa una respuesta inmune baja. Los patrones de enfermedad en individuos de la tercera edad sugieren declinación de la respuesta inmune, con aumento en la incidencia de infecciones, cáncer, enfermedad por complejos inmunes, autoinmunidad y amiloidosis. La manipulación molecular y celular, incluyendo el apoyo nutricional para evitar o detener la declinación de las funciones inmunes se espera que retarde la gravedad de la patología asociada a la tercera edad. Asimismo en los infantes desnutridos y en neonatos se espera que el soporte nutricional evite enfermedades y aun más la administración del Zn.

Metodología del Laboratorio de Inmunología para la Evaluación de la Respuesta Inmune en Pacientes Inmunoglobulinas y anticuerpos Medida de la concentración de inmunoglobulinas:

9

-Las inmunoglobulinas de suero se miden comúnmente por inmunodifusion radial o métodos inmunoturbidimétricos automatizados. Técnicas como ELISA y radioinmunoanálisis son accesibles y útiles para IgD e IgE. -Las subclases de IgG se pueden medir por ELISA o por inmunodifusión radial. Estas determinaciones tienen un valor limitado al evaluar pacientes con ID clínica ya que puede haber deficiencia funcional de anticuerpos a pesar de niveles normales de subclases y al contrario, puede haber niveles deficientes de alguna subclase en individuos con producción normal de anticuerpos específicos que están clínicamente normales. Evaluación de formación de anticuerpos después de una inmunización: La inmunidad humoral se puede evaluar por respuestas de anticuerpos a antígenos a los cuales la población está expuesta normalmente o después de una inmunización activa. Se pueden usar antígenos de proteína y polisacarídicos. Se deben usar técnicas sensibles como ELISA. Las vacunas (BCG, polio, sarampión, rubéola y paperas) no deben administrarse jamás si se sospecha de ID. Se recomiendan las siguientes pruebas: -Anticuerpos naturales, las isohemaglutininas A y B se usan como medición para IgM. -Anticuerpos IgG se evalúan como respuesta a inmunizaciones comunes: Niños sin inmunizar: difteria y tétanos. Medir IgG por ELISA, si son bajos los anticuerpos dar un refuerzo y hacer prueba de Schick. Tres dosis de vacuna de polio a intervalos de 2 semanas, también se pueden usar. Se pueden utilizar otros antígenos como polisacárido b Haemophilus, o de neumococo o meningococo o antígeno Vi de tifoidea. También la vacuna de hepatitis A. Los linfocitos B se cuentan mediante la detección de CDs :CD19 y CD20, con citometría de flujo o por técnicas inmunohistológicas con inmunofluorescencia en frotis de sangre. Los monocitos se pueden distinguir por citometría de flujo o por tinción de esterasa, ingestión de partículas de látex forradas d IgG o anticuerpos monoclonales específicos como CD14. Inmunidad mediada por células Se hacen diversas pruebas como la reacción en piel de hipersensibilidad tardía (HT); enumeración de células T y sus subpoblaciones; pruebas in vitro de función de T. Pruebas en piel. La reacción de hipersensibilidad tardía es una respuesta localizada en piel. Ya que la HT depende de linfocitos derivados del timo, funcionales (linfocitos T), la HT se puede emplear en el escrutinio para la inmunodeficiencia mediada por células T. Todas las pruebas se hacen por inyección intradérmica de 0.1 ml de antígeno. Los resultados se leen a las 48-72 horas por el diámetro máximo de induración. Antígenos: Tuberculina:0.1 ml conteniendo de 2 a 10 unidades internacionales(IU) de PPD soluble estabilizado en Tween 2, candida o monilia: Prueba inicial dilución 1:100. Si no hay reacción prueba a dilución 1:10 10

Tricofitón: usar dilución 1:30 Paperas: usar sin diluir; leer de 6 a 8 horas para reacción de Arthus (mediada por anticuerpos) y a las 48 horas para HT. Toxoides fluídos de tétano y difteria: usar dilución 1:100 Linfocitos T Las células T se pueden enumerar por inmunofluorescencia con el uso de anticuerpos monoclonales a CD3 que también enumeran las células NK. Las técnicas de citometría de flujo, son más confiables, reproducibles y sensibles que la enumeración microscópica visual.; si no se cuenta con citofluorómetro las técnicas inmunohistológicas usando anticuerpos marcados con fluorocromos o enzimas,se pueden utilizar. Los anticuerpos que reconocen CD4 Y CD8 reconocen subpoblaciones importantes. Reacciones in vitro Los linfocitos se estimulan in vitro con: 1) mitógenos como fitohemaglutinina, fitolaca americana y concanavalina A 2) antígenos como PPD, cándida, estreptocinasa, tétanos y difteria, si el paciente ha tenido contacto previo con el antígeno o con superantígenos como la toxina del choque tóxico. 3) células alogénicas 4) anticuerpos a moléculas de superficie involucradas en señales de transducción como a CD3,CD2,CD28 y CD43. La activación de los linfocitos T se puede evaluar por 1) expresión de antígenos de activación 2) medición de blastogénesis y/proliferación de células 3) liberación de mediadores: a) Las células T activadas expresan CD69,receptores de IL-2 alfa(CD25),receptores de transferrina (CD71) y moléculas MHC clase II no presentes en células en reposo. La aparición de estas moléculas se mide con un citómetro de flujo. b) B) la respuesta blastogénica se analiza en de 3 a 7 días dependiendo de la naturaleza del estimulante, por incorporación de timidina H3 o C14 por 16 a 24 horas. Esto se sigue de extracción de DNA o precipitación en papel filtro y conteo en contador de centelleo. c) Las células T activadas y monocitos sintetizan y secretan interleucinas 2,4,5 y 6,interferón gamma y otras citocinas. Los sobrenadantes de las células de sangre periférica estimulados con PHA se puede evaluar par IL-2 con una técnica de ELISA o determinando su capacidad para estimular la incorporación de timidina H3 por líneas de cultivo de T dependientes de IL-2. NK -Anticuerpos monoclonales vs CD16,CD56 y CD57 aunque no son específicos de línea pueden ser útiles para la detección y enumeración de NK; su actividad funcional se puede evaluar por una prueba de citotoxicidad vs líneas como K562.

11

Apéndice I Si las pruebas anteriores resultan anormales y aun si son normales pero los rasgos clínicos del paciente todavía sugieren un defecto, el paciente debe ser examinado en un centro donde se realicen estudios inmunológicos más detallados y sea posible establecer un tratamiento adecuado. Pruebas especiales para definir el defecto inmunológico a nivel molecular: a) En la hipogammaglobulinemia con IgM alta y en varones se debe realizar la expresión de btk ausente en XLA. b) Expresión de la cadena γ del receptor de la IL-2 (CD132). Estudio de ADA (adenosindeaminasa) y PNP (purín nucleósido fosforilasa). Expresión de Zap-70 (DISK con pocas CD8) y UASP en sospecha de WA. c) Moléculas de adhesión (CD18). Detección de anomalías en las distintas proteínas de la cadena oxidativa d) Descartando un defecto de las células T y capacidad oxidativa de los neutrófilos se debe realizar un estudio de los receptores de IFN-γ (CD119) e IL-12 y la síntesis de IFN-γ e IL-12 e) Estudios funcionales de los diferentes componentes de la vía clásica y alternativa del complemento.

12

Número total de eritrocitos, linfocitos, monocitos y granulositos

Poblaciones linfocitarias Linfocitos T: CD3, CD4, CD8 Linfocitos B: CD19, CD20 Células NK: CD56, CD16

Inmunodeficiencia humoral

↓ IgG con o sin células B

Subclases de la IgG − Anticuerpos naturales (ASTO isohemaglutininas) y − Respuesta a la vacunación (valoración según edad y antecedentes de vacunación conocidos.

Inmunodeficiencia celular

Alteración en las cifras de CD3

Realizar la medición de subpoblaciones T (CD4, CD8, CD45RO)

Inmunodeficiencia inespecífica

• Cuantificación de factores del complemento • Quimiotaxis y fagocitosis

Evaluar la función del linfocito T • Respuesta a mitógenos y antígenos • Estudio de los receptores de las células T (TCR α/β, γ/δ) y marcadores de activación (CD25, HLA-DR)

Una leucocitosis con Igs normales o altas

Realizar una prueba de la capacidad oxidativa de los granulocitos

13

Cuadro 2 Secuencia de estudios inmunológicos ante la sospecha clínica de una inmunodeficiencia primaria.

Conceptos inmunológicos necesarios para ID Aspectos moleculares de la Respuesta Inmune El antígeno se reconoce con base en su forma; la forma del epitopo se complementa con la del sitio de combinación del anticuerpo o la forma del complejo MHC-péptido, complementa la for del sitio de combinación del receptor de T. Las regiones determinantes de la complementariedad de los anticuerpos secretados y los receptores de antígenos en los linfocitos se une de manera nocovalente a las estructuras que reconocen. Las fuerzas intermoleculares involucradas en la unión se ponen de manifiesto sólo cuando las estructuras moleculares complementarias están próximas. Para los antígenos pequeños, el sitio de unión del anticuerpo pude ser un pliegue o un bolsillo, pero en la mayoría de los casos se parece más bien a una superficie ondulante. Los anticuerpos, ya sea en su forma secretada o actuando como el receptor de la célula B, pueden reconocer algunas veces una secuencia de péptidos contínua. Sin embargo, generalmente reconocen epitopos discontinuos compuestos de amino-ácidos que se aproximan cuando la proteína se pliega en su estructura nativa. Algunos epitopos del antígeno encajan especialmente bien con los sitios de reacción disponibles, en el repertorio de la célula B y la población de anticuerpo0s, contra estos epitopos tiende a dominar la respuesta policlonal contra ese antígeno. Los epitopos reconocidos por los receptores (alfa)(beta) de la célula T, son en contraste, péptidos lineales derivados de la proteolisis intracelular, del antígeno. Estos péptidos se transportan a la superficie de la célula dentro del surco de unión al péptido de una molécula MHC. Aunque los anticuerpos y los receptores de T pueden distinguir exactamente entre antígenos estrechamente relacionados, a veces tienen reacciones cruzadas con antígenos aparentemente no relacionados, ya sea porque los dos antígenos comparten un epitopo idéntico o porque dos epitopos diferentes tienen formas y cargas similares. Esas reacciones cruzadas son la base del concepto de mimetismo molecular, mientras que epitopos de agentes microbianos estimulan la producción de anticuerpos (o la proliferación de células T) que reaccionan con antígenos propios. Algunos antígenos (los antígenos T independientes) pueden estimular células B, sin asistencia de T. Entre estos, se encuentran polisacáridos o flagelina polimerizada, que tienen numerosos epitopos repetidos. Estos arreglos (arrays) se unen ávidamente a los receptores de T, y en conjunto con la señales de activación que pueden ser proporcionadas por varios tipos de células activan a células B sin necesidad de ayuda de células T CD4. Los antígenos T-independientes no inducen la formación de centros germinales y por lo tanto son incapaces de inducir la generación de células T de memoria o de hipermutación somática que resulta en la producción de anticuerpos de alta afinidad.

14

Muchos antígenos (a diferencia de los polisacáridos) no son capaces de estimular células B en ausencia de ayuda de T CD4 y se llaman T -dependientes. Cuando estos antígenos se unen a receptores de células B, se internalizan y procesan por la célula B como péptidos cortos, los que son llevados a la superficie celular por las moléculas clase II. Las células T CD4 vecinas que reconocen el complejo péptido-MHC, se activan y expresan moléculas coestimulatorias en su superficie del tipo CD154 (llamado también ligando de CD40), en la célula B; se genera una señal que promueve que la célula B empiece el proceso de mutación hipersomática y el switching de la clase de Ig. Se proporciona ayuda por varias citocinas, como las interleucinas-2, 4 y 5 , liberadas por las células T cooperadoras. Las células dendríticas y los macrófagos, al presentar complejos péptido-clase II, pueden también activar células T CD4, y a través de esta vía las células T activadas también expresan moléculas coestimuladoras y libera citocinas inmuno-estimuladoras. Algunas secuencias de DNA microbiano, particularmente las que contienen motivos CpG no-metilados (secuencias citosina-guanosina dinucleótido flanqueadas por dos 5’purinas y dos 3’pirimidinas) pueden estimular las células B directamente. También tienen propiedades adyuvantes, las que son mediadas por un efecto activador sobre las células dendríticas y macrófagos. Los antígenos reconocidos por linfocitos T Las células T reconocen antígenos extraños que se presentan en las superficies de las células del organismo. Estos patógenos pueden derivar de virus, o bacterias intracelulares que se replican dentro de las células o de patógenos o sus productos, que han sido internalizados del fluido extracelular por endocitosis. La mayor parte de los linfocitos T reconocen solo péptidos. Algunas T son específicas para formas químicamente reactivas de haptenos, como el dinitrofenol (probablemente los haptenos se unen a proteínas propias y estas complejos hapteno-proteína sean reconocidos por T). Las células T son específicas para secuencias de péptidos. Reconocen determinantes lineales. Las T reconocen y responden a péptidos extraños sólo cuando los antígenos están unidos alas superficies de células presentadoras de antígeno(APC). Las T reconocen péptidos extraños solo cuando estos péptidos están unidos y mostrados por las moléculas MHC propias. Esto se llama restricción MHC. Las células T cooperadoras CD4+ reconocen péptidos unidos a moléculas MHC clase II, Mientras los CTLs, CD8+, están restringidos a moléculas clase I. Las células T restringidas a clase II, reconocen péptidos derivados principalmente de proteínas extracelulares que se internalizan en las vesículas de las APCs. Esto

15

en tanto que las células T, CD8+, reconocen péptidos derivados de proteínas citosólicas, generalmente sintetizadas en forma endógena. Los antígenos reconocidos por linfocitos B Las inmunoglobulinas interactúan con patógenos y sus productos tóxicos en los espacios extracelulares del cuerpo. Los linfocitos B pueden reconocer específicamente péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos, lípidos y moléculas químicas pequeñas Los B reconocen determinantes conformacionales. Las células B y los anticuerpos secretados se unen a antígenos solubles en los fluidos corporales y en las superficies celulares. Bibliografía 1. Buckley RH, (2004) Molecular defects in human severe combined immunodeficiency and approaches to immune reconstitution, Ann Rev Immunol 22:625-655. 2. J Elorz Lambarri, JM García Martínez y A Bilbao Aburto, (2004) Inmunodeficiencias primarias, An Pediatr, 60(Supl 1):19-23. 3. T Español, T Marco, M Hernández, Diagnóstico de las inmunodeficiencias primarias, en Protocolos diagnósticos y terapéuticos en pediatría.

Ma.Dolores Lastra Octubre 2004

16