LAURA DANIELA VARGAS RAYO ANA MARIA VICTORINO MANRIQUE

Director Cesar Alfonso Ariza Castillo Ing. agrónomo M.sc ciencias agrarias con énfasis en fitomejoramiento

INGENIERÍA AGRONÓMICA GRUPO DE INVESTIGACIÓN PROSAFIS 2016

INTRODUCCION Región pacifica posee 533 especies de orquídeas

La región caribe posee una riqueza media de orquídeas

La región caribe posee una riqueza media de orquídeas

La región andina posee 2542 especies que representan el 77% de orquídeas en Colombia La región Orinoquia posee 143 especies de orquídeas

Pero: 3000 especies están en peligro de extinción.

DEFINICION DEL PROBLEMA Las semillas de orquídeas carecen de endospermo Reservas energética, necesarias para su germinación. Todas las orquídeas necesitan de hongos formadores de micorrizas Para la germinación y establecimiento en medio natural Conservación de orquídeas en peligro de extinción Desconocimiento de las relaciones simbiótica hongo – orquídeas.

JUSTIFICACION Colombia posee el 15%, es decir, mas de 3500 spp. del total de las especies del mundo.

Se reportan aproximadamente 3000 especies en peligro de extinción.

La simbiosis hongo – planta permite brindar a la orquídea los nutrientes principales para germinar y desarrollarse.

Promover desarrollo y conservación de estas bioindicadoras de diversidad.

OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Caracterizar morfológicamente y las secuencias ITS de aislamientos de hongos asociados a raíces de orquídeas en la región del Sumapaz. OBJETIVOS ESPECIFICOS 1.

Aislar diferentes muestras de hongos asociados a raíces de diferentes tipos de orquídeas en la región del Sumapaz.

2.

Obtener cultivos monomiceliales de los aislamientos realizados y caracterizar dichos cultivos monomiceliales hasta género.

3.

Extraer y amplificar la secuencia del DNA de los cultivos monomiceliales con primers o cebadores universales para hongos.

4.

Secuenciar los fragmentos de DNA amplificados.

5.

Comparar las secuencias obtenidas con las secuencias del GenBank.

6.

Construir un árbol filogenético entre los aislamientos obtenidos de los hongos asociados a las raíces de orquídeas.

LAS ORQUIDEAS

Reino: Plantae División: Magnoliophyta Clase: Liliopsida Orden: Orchidales

Familia: Orchidaceae (Juss., nom. cons.)

CARACTERÍSTICAS DE LAS ORQUÍDEAS

GERMINACIÓN Y RELACIÓN SIMBIÓTICA EN ORQUÍDEAS Semillas de orquídeas polvosas.

Pocas reservas de alimento

Tienen que ser infectadas las raíces por un hongo formador de micorriza

Provee a las plantas jóvenes y nutrientes

DIFERENCIAS ENTRE ENDÓFITOS Y HONGOS FORMADORES DE MICORRIZAS ENDOFITOS • Microorganismos que crecen dentro de los tejidos. • No causan síntomas de enfermedad. • Describe donde vive un organismo.

HONGOS FORMADORES DE MICORRIZAS • Simbiosis formada por hongos y raíces de plantas. • Plantas obtienen nutrientes. • Relación mutualista.

PROCESO DE INFECCION El hongo degrada la cubierta de la semilla

Libera la semilla de la dormancia

Establecimiento de micorrizas orquidioides

Inicia la germinación

Emite filamentos y órganos subterráneos

CLASIFICACION TAXONOMICA DE Rhizoctonia REINO

• Fungí

PHYLUM

• Basidiomycota

CLASE

• Basidiomycetes

ORDEN

• ceratobasidiales

FAMILIA

• ceratobasidiaceae

GÉNERO

•

Rhizoctonia

IDENTIFICACION MORFOLOGICA MICROSCOPICA DE Rhizoctonia

Células monilioides

Constricción hifal

Identificación por medio del la clave taxonómica para hongos imperfectos (Barnett y Hunter, 1998)

Bifurcación hifal

IDENTIFICACION MORFOLOGICA MACROSCOPICA DE Rhizoctonia

Color café de micelio

Presencia de esclererocios

Crecimiento abundante

GEOREFENCIACION

GEOREFENCIACION

METODOLOGIA

Reserva natural Quinini

Parque natural San Rafael

COLECTA DE MUESTRAS

Recorrido en transeptos

Identificación orquídea

Colecta de raíces

PROCESAMIENTO DE MUESTRAS Almacenamiento de muestras

Obtención de explantes de 5mm*5mm a partir de raíces.

Siembra, en cámara de flujo laminar.

Protocolo de desinfección propuesto por Otero (2002).

Incubados a temperatura ambiente 27°c.

AISLAMIENTO

Montajes directos

Observados en el microscopios

Repique de las muestras

Identificación de Rhizoctonia

AISLAMIENTO MONOMICELIAL Obtener cultivo genéticamente puro

Micelio esteril

Metodología propuesta por el CIAT (2001)

Se hace a partir de puntas de hifas.

PROCESAMIENTO MOLECULAR Muestras enviadas a CORPOGEN

Secuencia consenso

NCBI y Unite

Extracción de ADN

Limpieza por medio de cromatogramas

Alineamiento de secuencias múltiples

Amplificación de la IT’S 1 e IT’S 4

Secuenciación

Árbol filogenético

RESULTADOS MORFOLOGICOS ORQUÍDEAS MUESTREADAS

Se colectaron un total de 25 muestras, donde 11 de estas muestras fueron tomadas de la Reserva Natural San Rafael y las 14 restantes en el Parque Natural Quinini, tras este proceso de recolección cada muestra fue tomada de orquídeas diferentes. Las raíces de plantas de orquídeas recolectadas a individuos silvestres que no presentaban señales visibles de enfermedad

CENTIMETROS

CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS DE LOS AISLAMIENTOS

MUESTRAS

CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS DE LOS AISLAMIENTOS

CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS DE LOS AISLAMIENTOS

CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS DE LOS AISLAMIENTOS

CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS DE LOS AISLAMIENTOS

CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS DE LOS AISLAMIENTOS

CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS DE LOS AISLAMIENTOS

RESULTADOS MOLECULARES

RESULTADOS MOLECULARES ALINEAMIENTOS DE LAS MUESTRAS

RESULTADOS MOLECULARES

RESULTADOS MOLECULARES ALINEAMIENTOS DE LAS MUESTRAS FRENTE A RHIZOCTONIA

RESULTADOS MOLECULARES

RESULTADOS MOLECULARES Neofosicocum Parvum PHYLUM: Ascomycota Colonias en PDA de color gris en estado maduro Reportado por Slippers y Wingfield, 2007 como endófito de plantas leñosas. Producción de pigmento amarillo que se difunden en el agar.

RESULTADOS MOLECULARES Alternaria alternata PHYLUM: Ascomycota Hongo filamentoso con conidióforo simples. En medio de cultivo es de color pardo Con septos transversales y verticales a disposición irregular.

RESULTADOS MOLECULARES Pleurotus sp. PHYLUM: Basidiomycota

Algunas especies comestibles

Especies de gran interés como el champiñón.

RESULTADOS MOLECULARES Bipolaris sp. PHYLUM: Ascomycota Producción de conidios marrón. Hifas septadas, condioforo café, recto geniculado. Unicelular Reportada como hongo endófito en especies de orquidioides. Colonias aterciopeladas marrón o grisáceas en estado maduro

CONCLUSIONES 1. Las orquídeas que se encuentran en la Reserva Natural del Quinini y el Parque Natural San Rafael generalmente presentan microorganismos fúngicos asociados a las raíces de las orquídeas, ya se han de carácter formador de micorrizas o no, o se presenten como hongos endófitos de las raíces de orquídeas. 2. Se aislaron hongos con características morfológicas macroscópicas y microscopias, correspondientes al genero Rhizoctonia.

CONCLUSIONES • Al comparar las secuencias obtenidas con la base de datos del GenBank se encontró Neofosicocum Parvum, Alternaria alternata, Pleurotus sp. y Bipolaris sp. en la Reserva Natural del Quinini y el Parque Natural San Rafael.

• El árbol filogenético del alineamiento de las secuencias mostro que las muestras de Alternaria Alternata son muy cercanas o están alineadas, y que las dos muestras bipolaris sp se son muy cercanas alinearon lo cual indico que si representan el mismo genero. • A pesar de que estas secuencias tienen un menor porcentaje de identidad con Rhizoctonia que es el hongo formador de micorriza orquidioide mas reportado, según las características microscópicas que presentaron si correspondía a este genero.

RECOMENDACIONES • Para próximos estudios se recomienda realizar transeptos generalizados a la Región del Sumapaz con el fin de abarcar el mayor territorio posible. • Para futuros estudios de micorrizas enfocados al hongo formador de micorriza Rhizoctonia, identificar los enrollamientos hifales en las raíces de las orquídeas (pelotones) y hacer siembra de estos, además amplificar las regiones IT’S 5,8s e IT’S 28s específicos para este género, teniendo en cuenta que los cebadores permitan la amplificación de estas regiones en amplitudes mayores a 1000pb.

RECOMENDACIONES • Identificar las funciones ecológicas de los hongos endófitos asociados a las raíces de orquídeas encontrados en el presente trabajo. • Para posteriores trabajos se recomienda rectificar la presencia de estos posibles hongos endófitos (Neofosicocum Parvum, Alternaria alternata, Pleurotus sp. y Bipolaris sp) presentes en las orquídeas. • Para próximos estudios tomar varias muestras por género de orquídea encontrada y en lo posible en estados juveniles.

AGRADECIMIENTOS • Al Grupo de Investigación PROSÁFIS, semillero SEMINAC de la Universidad de Cundinamarca. • Al laboratorio de microbiología de la Universidad de Cundinamarca sede Fusagasugá, por brindarnos el espacio para desarrollar cada uno de los ensayos y procedimientos y su encargado Alberto Suarez por su colaboración y disposición. • Gracias a los docentes Cesar Alfonso Ariza y Paola Moreno por su gran disposición, asesoría, por los conocimientos brindados y continuo apoyo durante el desarrollo de todo el trabajo de grado. • A nuestras familias por impulsarnos para cumplir nuestras metas y ser la columna de cada decisión tomada.

GRACIAS